Name: formulating and characterizing an exosome-based dopamine carrier system
Uploaded: 2022-04-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System at JoVE.com

Il lavoro è stato sostenuto principalmente dai finanziamenti per la ricerca forniti dai progetti di ricerca scientifica dell'Università tecnica di Yıldız (TSA-2021-4713).

NOTA: Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali e le attrezzature utilizzati in questo protocollo.
1. Coltura e crioconservazione di cellule staminali mesenchimali gelatinose di Wharton
<ol><li>Rimuovere i WJ-MSC (dall'ATCC) dal congelatore a -80 °C. Seminare le cellule in un matraccio contenente terreno DMEM-F12 integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS). Incubarli a 37 °C in un incubatore contenente il 5% di CO<su...

Gli esosomi sono piccole vescicole di membrana con dimensioni di 40-200 nm secrete dalla maggior parte dei tipi di cellule, ad esempio le MSC1. In grado di consentire la comunicazione tra le cellule, gli esosomi possono entrare nelle cellule in diversi modi come l'endocitosi, la fagocitosi, la micropinocitosi, l'internalizzazione mediata dai lipidi e la fusione33,44. Rispetto ad altri sistemi di nanocarrier, i lipidi e il colesterolo prese...

Gli esosomi, vescicole bioattive con caratteristiche significative, hanno dimensioni comprese tra 40 nm e 200 nm. Gli esosomi hanno origine dalla membrana cellulare e si formano a causa del rilascio degli endosomi1. Queste strutture fungono da comunicatori cellula-cellula e interagiscono con le cellule vicine per facilitare il trasferimento di molecole attive. Gli esosomi possono essere isolati da molte fonti diverse. Questi includono fluidi corporei come plasma, urina, liquido cerebrospinale, saliva e linee cellulari coltivate in condizioni di vitro . Gli esosomi hanno un ruolo importante nell'eliminazione dei danni ai nervi, grazie alle biomacromolecole che contengono, come lipidi, proteine e acidi nucleici2. La glia, che sono le cellule di supporto del sistema nervoso3, trasferisce proteine e micro RNA agli assoni dei neuroni attraverso gli esosomi4.
I lipidi che formano la guaina mielica, che sono una caratteristica della conduzione nervosa, vengono rilasciati anche dagli oligodendrociti attraverso gli esosomi 4,5. Gli esosomi sono anche coinvolti in processi come la plasticità sinaptica, la risposta allo stress neuronale, la comunicazione cellula-cellula e la neurogenesi nel cervello 6,7. Il fatto che gli esosomi possiedano dimensioni nanometriche consente loro di passare attraverso la BBB. Esiste una speciale via di transizione dal liquido interstiziale al liquido cerebrospinale dopo essere penetrata in questa membrana8. Grazie alle loro proprietà superficiali, gli esosomi possono interagire in modo efficiente con le cellule bersaglio come sistema di somministrazione dei farmaci e rilasciare attivamente i farmaci caricati.
A causa dell'espressione di varie proteine adesive (tetraspanine e integrine) sulla superficie degli esosomi, queste vescicole extracellulari possono facilmente interagire e fondersi con le membrane della cellula ospite9. Si ritiene che gli esosomi possano essere utilizzati come sistema di somministrazione di farmaci, soprattutto nel trattamento delle malattie del sistema nervoso centrale grazie alla loro capacità di penetrare nella BBB e alle loro proprietà superficiali. Gli esosomi derivati da cellule staminali mesenchimali (MSC) hanno un rischio inferiore di rigetto immunitario rispetto alle terapie cellulari allogeniche e, a questo proposito, possono essere una componente importante delle applicazioni di trattamento senza cellule10.
La dopamina è una molecola la cui carenza nel cervello è la caratteristica del morbo di Parkinson (PD), peggiorando di giorno in giorno11,12,13. È noto che la malattia di Parkinson è associata alla degenerazione dei neuroni dopaminergici nella substantia nigra del mesencefalo e alla perdita delle funzioni dei motoneuroni14,15. La morte dei neuroni dopaminergici impedisce l'apporto del neurotrasmettitore dopamina allo striato cerebrale. Questo, a sua volta, provoca l'emergere di sintomi specifici del morbo di Parkinson16. Questi sintomi della malattia di Parkinson sono la bradicinesia, l'instabilità posturale, la rigidità e soprattutto il tremore a riposo12,13. Sebbene la malattia di Parkinson sia stata descritta per la prima volta più di due secoli fa, gli studi per comprendere la patologia e l'eziologia della malattia sono ancora in corso ed è attualmente accettato che la malattia di Parkinson sia una malattia sistemica complessa17. Si prevede che si verifichi una carenza di dopamina e si osservano sintomi clinici di Parkinson quando oltre l'80% dei neuroni degenera18. Nel trattamento della malattia, l'integrazione incompleta di dopamina è preferita per ridurre i sintomi motori. Studi in vivo hanno dimostrato che l'infusione diretta di dopamina nel cervello riduce significativamente i sintomi negli animali19. I precursori della dopamina come la L-DOPA (L-3,4-diidrossifenilalanina) e i farmaci del recettore della dopamina sono utilizzati in clinica perché l'infusione diretta di dopamina nel cervello non è possibile negli esseri umani e la dopamina che entra nel sistema non può attraversare la BBB20. Questi tipi di farmaci perdono la loro efficacia nel tempo. Tuttavia, non esiste ancora un approccio terapeutico curativo per la malattia di Parkinson. Quindi, c'è un'enorme necessità di sviluppare nuove strategie terapeutiche e modalità di trattamento per rivelare la fisiopatologia della malattia e ridurre l'impatto della malattia sui pazienti.
Gli studi basati sugli esosomi hanno recentemente attirato l'attenzione per la raccolta di informazioni sia sugli approcci terapeutici che sulle patologie delle malattie del sistema nervoso. È stato dimostrato che gli esosomi derivati dalle MSC riducono l'infiammazione nel danno ai nervi e contribuiscono alla rigenerazione neuronale21,22,23. Inoltre, è stato riportato che i secretomi esosomici derivati da MSC riducono l'apoptosi mostrando effetti neurotrofici e neuroprotettivi, in particolare sui neuroni dopaminergici24,25. La ricerca sulle piattaforme in cui gli esosomi sono utilizzati come sistemi terapeutici di somministrazione di farmaci ha subito un'intensa accelerazione negli ultimi anni. In numerosi studi, è stato osservato che i farmaci rilevanti possono essere facilmente incapsulati negli esosomi e somministrati in modo sicuro nelle cellule, nei tessuti e negli organi bersaglio26,27. Diversi metodi come l'incubazione, i cicli di congelamento/scongelamento, la sonicazione e l'estrusione potrebbero essere utilizzati per il caricamento del farmaco negli esosomi28.
La coincubazione con esosomi o vescicole simili agli esosomi consente di incapsulare passivamente piccole molecole lipofile in questi sistemi di rilascio28,29,30. In particolare, varie molecole come la curcumina 31, la catalasi30, la doxorubicina32 e il paclitaxel33 sono state efficacemente caricate negli esosomi. È stato osservato che gli esosomi contenenti catalasi, che hanno attività antiossidante, si accumulavano in modo efficiente nei neuroni e nelle cellule microgliali del cervello e mostravano forti attività neuroprotettive30. Nello stesso studio, è stato riscontrato che la saponina, aggiunta al complesso per aumentare l'efficienza di caricamento, aumenta la percentuale di carico del farmaco durante l'incubazione30,34. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per stabilire gli standard per il caricamento del farmaco negli esosomi.
Questo articolo descrive lo sviluppo di un sistema di nanocarrier mediante incapsulamento della dopamina in esosomi che sono stati isolati da WJ-MSCs. Tutte le fasi, tra cui la coltivazione di WJ-MSC, l'isolamento e la caratterizzazione degli esosomi, gli esperimenti di carico farmacologico, la caratterizzazione degli esosomi carichi di dopamina con varie tecniche e l'analisi della citotossicità in vitro sono spiegate in dettaglio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td>Aisimo</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Aisimo</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates (Falcon, TPP microplates)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271004-1L</td>
			<td>Used for HPLC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>NUVE-OT 90L</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Cabin</td>
			<td>Hera Safe KS</td>
			<td></td>
			<td>Used for the cell culture process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td>Used in the exosome isolation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator with Safe Cell UV</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td>Used for the cell culture process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine hydrochloride H8502-10G</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8502-10G</td>
			<td>Used in exosome dopamine loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Mixture-F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBJ7249</td>
			<td>Used as cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum-FBS</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>FBS-16A</td>
			<td>It was used by adding to the cell culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U5386S-PE</td>
			<td>To store cells and the resulting exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MPR-215-PE</td>
			<td>Used to store cell culture and other materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance liquid chromatography-HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope- Primovert</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used to observe cells in cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT Assay</td>
			<td>Biomatik</td>
			<td></td>
			<td>Used to measure cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern panalytical</td>
			<td>Malvern panalytical</td>
			<td>Used for exosome characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-100 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Used in the exosome isolation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablet</td>
			<td>Biomatik</td>
			<td>43602</td>
			<td>In the preparation of the PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin Solution</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>PB-S</td>
			<td>It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Aid</td>
			<td>Isolab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance-Kern</td>
			<td>Kern-ABJ220-4NM</td>
			<td></td>
			<td>Used in the preparation of solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q500 Sonicator</td>
			<td>Qsonica, LLC</td>
			<td></td>
			<td>Used to digest exosomes in HPLC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47036-50G-F</td>
			<td>It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrostar-Nano-Spectrophotometry</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td>Used for MTT and drug release analyzes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPSS 22</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>statistical package program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vorteks-FinePCR</td>
			<td>FinePCR-FineVortex</td>
			<td></td>
			<td>Used to mix solutions homogeneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath 37 &#176;C-Senova</td>
			<td>Senova</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wharton&#8217;s jelly mesenchymal stem cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer</td>
			<td>Malvern Nano ZS</td>
			<td>Malvern Nano ZS</td>
			<td>Used for exosome characterization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulating and characterizing an exosome-based dopamine carrier system

Gli esosomi di dimensioni comprese tra 40 e 200 nm costituiscono il sottogruppo più piccolo di vescicole extracellulari. Queste vescicole bioattive secrete dalle cellule svolgono un ruolo attivo nel carico e nella comunicazione intercellulare. Gli esosomi si trovano principalmente nei fluidi corporei come plasma, liquido cerebrospinale, urina, saliva, liquido amniotico, colostro, latte materno, liquido articolare, sperma e acido pleurico. Considerando le dimensioni degli esosomi, si pensa che possano svolgere un ruolo importante nelle malattie del sistema nervoso centrale perché possono passare attraverso la barriera emato-encefalica (BBB). Quindi, questo studio mirava a sviluppare un sistema di nanocarrier basato sugli esosomi incapsulando la dopamina in esosomi isolati dalle cellule staminali mesenchimali gelatinose di Wharton (WJ-MSCs). Gli esosomi che hanno superato il processo di caratterizzazione sono stati incubati con dopamina. Gli esosomi carichi di dopamina sono stati ricaratterizzati alla fine dell'incubazione. Gli esosomi carichi di dopamina sono stati studiati in saggi di rilascio di farmaci e citotossicità. I risultati hanno mostrato che la dopamina poteva essere incapsulata con successo all'interno degli esosomi e che gli esosomi carichi di dopamina non influenzavano la vitalità dei fibroblasti.

Isolamento e caratterizzazione degli esosomi Le cellule staminali della gelatina Wharton vengono coltivate e incubate in un terreno privo di siero per 48 ore quando la coltura raggiunge una densità sufficiente. Al termine dell'incubazione, il surnatante viene conservato a -20 °C. I surnatanti raccolti vengono diluiti con PBS e sottoposti a ultracentrifugazione (Figura 1). La soluzione ottenuta viene analizzata mediante analisi NTA e DLS. Gli esosomi vengono sterilizzat...

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Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System

Qui, abbiamo mirato ad ottenere una formulazione caricando dopamina degli esosomi isolati di cellule staminali dalle cellule staminali mesenchimali gelatinose di Wharton. In questo protocollo vengono descritti l'isolamento e la caratterizzazione degli esosomi, il caricamento del farmaco negli esosomi risultanti e l'attività citotossica della formulazione sviluppata.

Formulazione e caratterizzazione di un sistema di trasporto della dopamina basato sugli esosomi

Exosomes between 40 and 200 nm in size constitute the smallest subgroup of extracellular vesicles. These bioactive vesicles secreted by cells play an ...

Gli esosomi potrebbero reagire alle vescicole secrete da una cellula di dimensioni comprese tra 14 e 200 nanometri e dividersi nel carico e nella comunicazione intracellulare, che arriva al sottogruppo più piccolo di vescicole extracellulari. Gli esosomi che si formano a seguito della differenziazione dell'endosoma, hanno origine dalla membrana cellulare. Le cellule staminali possono essere isolate da diverse fonti come il midollo osseo o i tessuti adiposi.ma le cellule staminali essiccate dei tessuti adulti hanno un potenziale immunogenico più elevato Contro Svantaggi delle dimensioni degli esosomi, si dice che abbia svolto un ruolo importante nelle malattie del sistema nervoso centrale perché può passare attraverso la barriera ematoencefalica. Per iniziare, lavare le cellule staminali mesenchimali della gelatina di Wharton con cinque millilitri di PBS. Quindi aggiungere cinque millilitri di soluzione di tripsina EDTA prima di mettere il pallone in un'incubatrice.Dopo l'incubazione, raccogliere le cellule e centrifugare a 1.500 G per cinque minuti. Quindi rimuovere il surnatante e aggiungere un millilitro di DMEM-F12 contenente il 10% di FBS nella provetta. Lavare le cellule in coltura con PBS.Dopo il lavaggio, aggiungere alle cellule il terreno DMEM-F12 privo di siero e metterlo nell'incubatrice. Per isolare gli esosomi, raccogliere il terreno privo di siero e centrifugare a 300 G a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Trasferire il surnatante in un'altra provetta e processarlo mediante centrifugazione seriale a velocità più elevate.Dopo la centrifugazione finale, rimuovere lentamente il surnatante e sciogliere il pellet in un millilitro di PBS. Miscelare mediante vortex e procedere con ultracentrifugazione a 110.000 G per 70 minuti a quattro gradi Celsius. Aggiungere tre millilitri di PBS alla sospensione dell'esosoma raccolta in precedenza mediante ultracentrifugazione e sterilizzare la sospensione diluita mediante filtrazione utilizzando un filtro da 0,22 micron.Quindi trasferire 500 microlitri della sospensione di esosomi sterilizzati in un'altra provetta. Successivamente, aggiungere in sequenza 500 microlitri di soluzione di dopamina da 0,5 milligrammi per millilitro e saponina nella sospensione sterilizzata. Dopo l'incubazione ultracentrifugare la sospensione.Il campione può essere utilizzato per l'analisi NTA e DLS per caratterizzare gli esosomi carichi di dopamina o conservato a meno 20 gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo. Nell'analisi NTA, la dimensione media degli esosomi derivati dalla gelatina di Wharton è stata determinata a 98 nanometri e gli esosomi caricati di dopamina a 110 nanometri. Il numero di nanoparticelle rivelate dalle analisi NTA e DLS era coerente tra loro.Il potenziale zeta degli esosomi derivati dalla gelatina di Wharton è stato misurato come meno 15,7 e gli esosomi carichi di dopamina come meno 17,6 millivolt. L'analisi HPLC degli esosomi carichi di dopamina ha rilevato il picco di dopamina a 6,45 minuti. Il profilo cumulativo di rilascio del farmaco ha rivelato che il 74,8% della dopamina incapsulata è stata rilasciata dagli esosomi entro le prime otto ore.È stata studiata la citotossicità degli esosomi carichi di dopamina e liberi sui fibroblasti. Sebbene gli esosomi caricati con dopamina non abbiano dimostrato alcun effetto citotossico, la saponina ha diminuito la vitalità dei fibroblasti. Il test MTT ha mostrato una maggiore vitalità cellulare quando i fibroblasti sono stati trattati con gli esosomi caricati con dopamina.La significatività statistica dei risultati è stata valutata eseguendo un'anova unidirezionale. Inoltre, sono stati studiati gli effetti citotossici di diverse concentrazioni di esosomi liberi sui fibroblasti. La vitalità dei fibroblasti era più alta con esosomi liberi alla concentrazione di 25 microlitri per millilitro.È molto importante per il sistema nervoso centrale le dimensioni del paziente, il ruolo svolto nei processi come la plasticità, la risposta neurologica, la comunicazione da lato a lato e la neurogenesi nel cervello. Inoltre, grazie alla superficie degli esosomi, si dice, è stato osservato che possono interagire con la cellula bersaglio del farmaco e l'attività erogata durante il farmaco è un completamento. Per la prima volta nello studio, abbiamo sviluppato una nuova formulazione farmacologica incapsulando la dopamina in esosomi derivati da cellule staminali.Ha proposto che questa formulazione sarà così promettente per il trattamento del morbo di Parkinson.

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