Name: formulating and characterizing an exosome-based dopamine carrier system
Uploaded: 2022-04-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System at JoVE.com

この研究は、主にユルドゥズ工科大学科学研究プロジェクト(TSA-2021-4713)から提供された研究資金によって支援されました。

注意: このプロトコルで使用されるすべての材料および機器に関連する詳細については、 部品表 を参照してください。
1. ウォートンゼリー間葉系幹細胞の培養・凍結保存
<ol><li>WJ-MSC(ATCC製)を-80°Cの冷凍庫から取り出します。10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したDMEM-F12培地を含むフラスコに細胞を播種します。5%CO2を含むインキュベーターで37...

エキソソームは、ほとんどの細胞タイプ(MSC1など)から分泌される40〜200nmの寸法の小さな膜小胞です。細胞間のコミュニケーションを可能にすることができるエクソソームは、エンドサイトーシス、食作用、ミクロピノサイトーシス、脂質媒介性内在化、融合など、さまざまな方法で細胞に侵入することができます33,44。他のナノ?...

重要な特徴を持つ生理活性小胞であるエクソソームは、40nmから200nmまでの大きさです。エクソソームは細胞膜に由来し、エンドソーム1の放出によって形成される。これらの構造は、細胞間コミュニケーターとして機能し、隣接する細胞と相互作用して活性分子の移動を促進します。エクソソームは、多くの異なる供給源から単離することができます。これらには、血漿、尿、脳脊髄液、唾液などの体液、および in vitro 条件下で培養された細胞株が含まれます。エクソソームは、脂質、タンパク質、核酸などの生体高分子を含むため、神経損傷の除去に重要な役割を果たします2。神経系の支持細胞であるグリアは3、エクソソーム を介して タンパク質やマイクロRNAをニューロンの軸索に伝達します4。
神経伝導の特徴であるミエリン鞘を形成する脂質も、エクソソームを介してオリゴデンドロサイトから放出される4,5。エクソソームは、シナプス可塑性、ニューロンストレス応答、細胞間コミュニケーション、脳内のニューロン新生などのプロセスにも関与しています6,7。エクソソームはナノ次元を持っているため、BBBを通過することができます。この膜8を貫通した後、間質液から脳脊髄液への特別な移行経路がある。エクソソームは、その表面特性により、薬物送達システムとして標的細胞と効率的に相互作用し、負荷された薬物を能動的に送達することができます。
エクソソームの表面には様々な接着性タンパク質(テトラスパニンおよびインテグリン)が発現しているため、これらの細胞外小胞は宿主細胞膜と容易に相互作用し、融合することができる9。エクソソームは、BBBに浸透する能力とその表面特性により、特に中枢神経系疾患の治療において、薬物送達システムとして使用できると考えられています。間葉系幹細胞(MSC)由来のエクソソームは、同種細胞療法と比較して免疫拒絶反応のリスクが低く、この点で、無細胞治療アプリケーションの重要な要素となり得る10。
ドーパミンは、脳内の欠乏がパーキンソン病(PD)の特徴である分子であり、日々悪化します11,12,13。PDは、中脳の黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの変性および運動ニューロン機能の喪失と関連していることが知られている14,15。ドーパミン作動性ニューロンの死は、神経伝達物質ドーパミンの脳線条体への供給を妨げる。その結果、PD特異的な症状が出現する16。PDのこれらの症状は、運動緩慢、姿勢の不安定性、硬直、特に安静時の振戦です12,13。パーキンソン病は2世紀以上前に初めて記述されたが、この疾患の病理学と病因を理解するための研究はまだ進行中であり、現在、パーキンソン病は複雑な全身性疾患であることが認められている17。ドーパミン欠乏症が起こり、神経細胞の80%以上が変性すると臨床的PD症状がみられると予測されている18。この疾患の治療では、運動症状を軽減するために不完全なドーパミン補給が好まれます。In vivo研究では、ドーパミンを脳に直接注入すると、動物の症状が大幅に軽減されることが示されています19。L-DOPA(L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン)やドーパミン受容体薬などのドーパミン前駆体は、ヒトでは脳へのドーパミンの直接注入が不可能であり、体内に入るドーパミンがBBB20を通過できないため、診療所で使用されています。これらのタイプの薬は、時間の経過とともに効果を失います。したがって、疾患の病態生理を明らかにし、PDの患者への影響を軽減するために、新しい治療戦略と治療法を開発することが非常に必要です。
近年、エクソソームを用いた研究は、神経系疾患の治療法と病態の双方に関する情報収集として注目されています。MSC由来のエクソソームは、神経損傷の炎症を軽減し、神経細胞の再生に寄与することが示されています21,22,23。さらに、MSC由来のエクソソームセクレトームは、特にドーパミン作動性ニューロンに対して神経栄養作用および神経保護作用を示すことにより、アポトーシスを減少させることが報告されています24,25。近年、エクソソームを治療用薬物送達システムとして用いるプラットフォームの研究が加速しています。多くの研究において、関連する薬物はエキソソームに容易にカプセル化され、標的細胞、組織、および臓器に安全に送達できることが観察されています26,27。インキュベーション、凍結/融解サイクル、超音波処理、および押出成形などのさまざまな方法を、エキソソームへの薬物ローディングに用いることができる28。
エキソソームまたはエキソソーム様小胞とのコインキュベーションにより、親油性小分子をこれらの送達システムに受動的にカプセル化することができます28,29,30。特に、クルクミン31、カタラーゼ30、ドキソルビシン32、パクリタキセル33などの様々な分子がエクソソームに効果的にロードされました。抗酸化活性を持つカタラーゼ含有エクソソームは、脳内の神経細胞やミクログリア細胞に効率よく蓄積し、強い神経保護活性を示すことが観察されている30。同じ研究では、ローディング効率を高めるために複合体に添加されたサポニンは、インキュベーション中の薬物ローディング率を増加させることがわかりました30,34。しかし、エクソソームへの薬物負荷の基準を確立するには、さらなる研究が必要です。
本稿では、WJ-MSCから単離したエクソソームにドーパミンをカプセル化することで、ナノキャリアシステムを開発した。WJ-MSCの培養、エクソソームの単離と特性評価、薬物ローディング実験、さまざまな技術によるドーパミン負荷エクソソームの特性評価、 in vitro 細胞毒性分析など、すべてのステップが詳細に説明されています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td>Aisimo</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Aisimo</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates (Falcon, TPP microplates)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271004-1L</td>
			<td>Used for HPLC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>NUVE-OT 90L</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Cabin</td>
			<td>Hera Safe KS</td>
			<td></td>
			<td>Used for the cell culture process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td>Used in the exosome isolation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator with Safe Cell UV</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td>Used for the cell culture process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine hydrochloride H8502-10G</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8502-10G</td>
			<td>Used in exosome dopamine loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Mixture-F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBJ7249</td>
			<td>Used as cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum-FBS</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>FBS-16A</td>
			<td>It was used by adding to the cell culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U5386S-PE</td>
			<td>To store cells and the resulting exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MPR-215-PE</td>
			<td>Used to store cell culture and other materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance liquid chromatography-HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope- Primovert</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used to observe cells in cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT Assay</td>
			<td>Biomatik</td>
			<td></td>
			<td>Used to measure cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern panalytical</td>
			<td>Malvern panalytical</td>
			<td>Used for exosome characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-100 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Used in the exosome isolation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablet</td>
			<td>Biomatik</td>
			<td>43602</td>
			<td>In the preparation of the PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin Solution</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>PB-S</td>
			<td>It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Aid</td>
			<td>Isolab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance-Kern</td>
			<td>Kern-ABJ220-4NM</td>
			<td></td>
			<td>Used in the preparation of solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q500 Sonicator</td>
			<td>Qsonica, LLC</td>
			<td></td>
			<td>Used to digest exosomes in HPLC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47036-50G-F</td>
			<td>It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrostar-Nano-Spectrophotometry</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td>Used for MTT and drug release analyzes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPSS 22</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>statistical package program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vorteks-FinePCR</td>
			<td>FinePCR-FineVortex</td>
			<td></td>
			<td>Used to mix solutions homogeneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath 37 &#176;C-Senova</td>
			<td>Senova</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wharton&#8217;s jelly mesenchymal stem cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer</td>
			<td>Malvern Nano ZS</td>
			<td>Malvern Nano ZS</td>
			<td>Used for exosome characterization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulating and characterizing an exosome-based dopamine carrier system

サイズが40〜200nmのエクソソームは、細胞外小胞の最小サブグループを構成します。細胞から分泌されるこれらの生理活性小胞は、細胞間のカーゴやコミュニケーションに積極的な役割を果たしています。エクソソームは、血漿、脳脊髄液、尿、唾液、羊水、初乳、母乳、関節液、精液、胸膜などの体液に多く含まれています。エクソソームは、その大きさから、血液脳関門(BBB)を通過できることから、中枢神経系疾患において重要な役割を担っているのではないかと考えられます。そこで本研究では、ウォートンゼリー間葉系幹細胞(WJ-MSC)から単離したエクソソームにドーパミンを内包することで、エクソソームを用いたナノキャリアシステムの開発を目指しました。特性評価プロセスに合格したエクソソームをドーパミンとインキュベートしました。ドーパミンをロードしたエクソソームは、インキュベーションの最後に再特徴付けされました。ドーパミンをロードしたエクソソームを、薬物放出および細胞毒性アッセイで調査しました。その結果、ドーパミンがエクソソーム内にうまくカプセル化され、ドーパミンをロードしたエクソソームが線維芽細胞の生存率に影響を与えないことが示されました。

エクソソームの単離と特性評価 ウォートンゼリー幹細胞を培養し、培養が十分な密度に達したら、無血清培地中で48時間インキュベートします。インキュベーション終了後、上清を-20°Cで保存します。 回収した上清をPBSで希釈し、超遠心分離を行います(図1)。得られた溶液は、NTAおよびDLS分析によって分析されます。エクソソームは、0.22μmのフィルター...

Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System at JoVE.com

Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System

ここでは、ウォートンゼリー間葉系幹細胞から幹細胞の単離エクソソームをドーパミン負荷することで製剤を得ることを目指しました。エキソソームの単離と特性評価、得られたエクソソームへの薬物負荷、および開発された製剤の細胞毒性活性は、このプロトコルで説明されています。

エクソソームベースのドーパミンキャリアシステムの定式化と特性評価

Exosomes between 40 and 200 nm in size constitute the smallest subgroup of extracellular vesicles. These bioactive vesicles secreted by cells play an ...

エクソソームは、14〜200ナノメートルの大きさの細胞から分泌され、細胞内カーゴとコミュニケーションで分裂した小胞に反応し、細胞外小胞の最小のサブグループに到達します。エンドソームの分化の結果として形成されるエクソソームは、細胞膜に由来します。幹細胞は、骨髄や脂肪組織などのさまざまなソースから単離できます。しかし、成体組織乾燥幹細胞は免疫原性が高く、エクソソームの大きさから、血液脳関門を通過できるため、中枢神経系疾患において重要な役割を担っていると言われています。まず、播種したウォートンゼリー間葉系幹細胞を5ミリリットルのPBSで洗浄します。次に、フラスコをインキュベーターに入れる前に、5ミリリットルのトリプシンEDTA溶液を加えます。インキュベーション後、細胞を回収し、1, 500 Gで5分間遠心分離します。次に、上清を取り除き、10%FBSを含む1ミリリットルのDMEM-F12をチューブに加えます。培養細胞をPBSで洗浄します。洗浄後、無血清DMEM-F12培地を細胞に添加し、インキュベーターに入れます。エクソソームを単離するには、無血清培地を回収し、300 G、摂氏4度、10分間遠心分離します。上清を別のチューブに移し、より高速で連続遠心分離して処理します。最後の遠心分離後、上清をゆっくりと除去し、ペレットを1ミリリットルのPBSに溶解します。ボルテックスで混合し、110, 000 G で 4 °C で 70 分間超遠心分離を進めます。先ほど超遠心分離で採取したエクソソーム懸濁液に3ミリリットルのPBSを加え、希釈した懸濁液を0.22ミクロンのフィルターでろ過して滅菌します。次に、滅菌したエキソソーム懸濁液500マイクロリットルを別のチューブに移します。次に、500マイクロリットルの0.5ミリグラム/ミリリットルのドーパミン溶液とサポニンを滅菌懸濁液に加えます。インキュベーション後、懸濁液を超遠心分離します。このサンプルは、ドーパミンをロードしたエクソソームの特性評価のためにNTAおよびDLS分析に使用するか、さらに使用するまで摂氏マイナス20度で保存することができます。NTAの解析では、ウォートンゼリー由来のエクソソームの平均サイズは98ナノメートル、ドーパミンを充填したエクソソームの平均サイズは110ナノメートルと判定されました。NTA分析とDLS分析で明らかになったナノ粒子の数は、互いに一致していました。ウォートンゼリー由来のエクソソームのゼータ電位はマイナス15.7、ドーパミンをロードしたエクソソームのゼータ電位はマイナス17.6ミリボルトと測定されました。ドーパミンをロードしたエクソソームのHPLC分析により、6.45分にドーパミンのピークが検出されました。累積薬物放出プロファイルにより、カプセル化されたドーパミンの74.8%が最初の8時間以内にエクソソームから放出されたことが明らかになりました。線維芽細胞上のドーパミン負荷および遊離エクソソームの細胞毒性が調査されました。ドーパミンをロードしたエクソソームは細胞毒性効果を示さなかったが、サポニンは線維芽細胞の生存率を低下させた。MTTアッセイでは、線維芽細胞をドーパミンをロードしたエキソソームで処理すると、細胞生存率の向上が示されました。結果の統計的有意性は、一元配置分散分析を実行することによって評価されました。さらに、線維芽細胞に対するさまざまな濃度の遊離エクソソームの細胞毒性効果を調査しました。線維芽細胞の生存率は、25マイクロリットル/ミリリットルの濃度の遊離エキソソームで高かった。中枢神経系にとって本当に重要なのは、患者のサイズ、可塑性、神経反応、左右のコミュニケーション、脳内の神経新生などのプロセスにおける役割です。また、エクソソームの表面のおかげで、薬物中に送達された薬物や活性を標的細胞と相互作用させることが観察されているとのことです。本研究では初めて、幹細胞由来のエクソソームにドーパミンを内包した新薬製剤を開発しました。彼は、この製剤がパーキンソン病の治療に非常に有望であると提案しました。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

胎児肺細胞におけるメカノトランスを研究するための実験システム

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

バイオフィルムと生息地異質の共同開発を特徴付けるための方法

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

微生物光遺伝学アプリケーションのための自動照明、培養、およびサンプリングシステムの設計と実装

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

液晶ナノ粒子キャリアにおける疎水性貨物カプセル化の標的細胞膜配達

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

三次元培養細胞遊走を特徴付ける傷の環境

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

大腸菌の伝染性のバクテリオファージの合成による無細胞発現系

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

哺乳類細胞培養を均一な骨材を生産する O の形をした船で揺れ、軌道

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

ラットでの肝部分工学生体内での基盤として新しい手術手技

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

リアルタイム可視化と完全にそのままマウス軟骨外植片の機械的荷重により軟骨損傷の解析

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

ファージ表示ペプチドライブラリーを用いて線維芽細胞増殖因子受容体2を標的とする小ペプチドのスクリーニングと同定

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...