Name: formulating and characterizing an exosome-based dopamine carrier system
Uploaded: 2022-04-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System at JoVE.com

Arbeidet ble primært støttet av forskningsmidler fra Yıldız Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713).

MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer og utstyr som brukes i denne protokollen.
1. Dyrking og kryopreservering av Whartons gelé mesenkymale stamceller
<ol><li>Fjern WJ-MSC (fra ATCC) fra fryseren ved -80 °C. Frø cellene til en kolbe som inneholder DMEM-F12 medium supplert med 10% føtal bovint serum (FBS). Inkuber dem ved 37 ° C i en inkubator som inneholder 5% CO2.</li>
	<li>Endre kulturmediet hver 2. Pass ce...

Eksosomer er små membranvesikler med dimensjoner på 40-200 nm som skilles ut av de fleste celletyper, for eksempel MSC1. I stand til å muliggjøre kommunikasjon mellom celler, kan eksosomer komme inn i celler på forskjellige måter som endocytose, fagocytose, mikropinocytose, lipidmediert internalisering og fusjon 33,44. Sammenlignet med andre nanobærersystemer, gir lipidene og kolesterolet som finnes på eksosomoverflaten evnen til ?...

Exosomer, bioaktive vesikler med betydelige egenskaper, varierer i størrelse fra 40 nm til 200 nm. Exosomer stammer fra cellemembranen og dannes på grunn av frigjøring av endosomene1. Disse strukturene tjener som celle-til-celle-kommunikatorer og interagerer med naboceller for å lette overføringen av aktive molekyler. Exosomer kan isoleres fra mange forskjellige kilder. Disse inkluderer kroppsvæsker som plasma, urin, cerebrospinalvæske, spytt, samt cellelinjer dyrket under in vitro-forhold . Eksosomer har en viktig rolle i eliminering av nerveskader, takket være biomakromolekylene de inneholder, som lipider, proteiner og nukleinsyrer2. Glia, som er støttecellene i nervesystemet3, overfører proteiner og mikro-RNA til aksonene til nevroner via eksosomer4.
Lipider som danner myelinskjeden, som er et karakteristisk trekk ved nerveledning, frigjøres også fra oligodendrocytter via eksosomer 4,5. Exosomer er også involvert i prosesser som synaptisk plastisitet, neuronal stressrespons, celle-cellekommunikasjon og neurogenese i hjernen 6,7. Det faktum at eksosomer har nano-dimensjoner gjør at de kan passere gjennom BBB. Det er en spesiell overgangsrute fra interstitialvæsken til cerebrospinalvæsken etter penetrering av denne membranen8. Takket være overflateegenskapene kan eksosomer samhandle effektivt med målceller som et legemiddelleveringssystem og aktivt levere de lastede legemidlene.
På grunn av ekspresjonen av forskjellige klebende proteiner (tetraspaniner og integriner) på overflaten av eksosomer, kan disse ekstracellulære vesiklene lett samhandle og smelte sammen med vertscellemembraner9. Det antas at eksosomer kan brukes som et legemiddelleveringssystem, spesielt ved behandling av sykdommer i sentralnervesystemet på grunn av deres evne til å trenge inn i BBB og deres overflateegenskaper. Mesenkymale stamcelle (MSC)-avledede eksosomer har lavere risiko for immunavstøtning sammenlignet med allogene cellulære terapier, og i denne forbindelse kan de være en viktig komponent i cellefrie behandlingsapplikasjoner10.
Dopamin er et molekyl hvis mangel i hjernen er det karakteristiske trekk ved Parkinsons sykdom (PD), forverres dagfor dag 11,12,13. Det er kjent at PD er assosiert med degenerasjon av dopaminerge nevroner i substantia nigra av mesencephalon og tap av motorneuronfunksjoner14,15. Døden av dopaminerge nevroner forhindrer tilførsel av nevrotransmitteren dopamin til hjernens striatum. Dette resulterer igjen i fremveksten av PD-spesifikke symptomer16. Disse symptomene på PD er bradykinesi, postural ustabilitet, stivhet og spesielt hviletremor12,13. Selv om PD først ble beskrevet for mer enn to århundrer siden, pågår studier for å forstå sykdommens patologi og etiologi fortsatt, og det er for tiden akseptert at PD er en kompleks systemisk sykdom17. Det er spådd at dopaminmangel oppstår, og kliniske PD-symptomer observeres når mer enn 80% av nevronene degenererer18. Ved behandling av sykdommen foretrekkes ufullstendig dopamintilskudd for å redusere motoriske symptomer. In vivo studier har vist at direkte infusjon av dopamin i hjernen signifikant reduserer symptomer hos dyr19. Dopaminforløpere som L-DOPA (L-3,4-dihydroksyfenylalanin) og dopaminreseptormedikamenter brukes i klinikken fordi direkte infusjon av dopamin i hjernen ikke er mulig hos mennesker og dopamin som kommer inn i systemet ikke kan krysse BBB20. Disse typer stoffer mister sin effektivitet over tid. Imidlertid er det fortsatt ingen kurativ behandlingstilnærming for PD. Derfor er det et stort behov for å utvikle nye terapeutiske strategier og behandlingsmodaliteter for å avsløre patofysiologien til sykdommen og redusere virkningen av PD på pasienter.
Eksosombaserte studier har nylig fått oppmerksomhet for å samle informasjon om både terapeutiske tilnærminger og patologier av sykdommer i nervesystemet. MSC-avledede eksosomer har vist seg å redusere betennelse i nerveskader og bidra til nevronregenerering21,22,23. I tillegg har det blitt rapportert at MSC-avledede eksosomsekretamer reduserer apoptose ved å vise nevrotrofiske og nevrobeskyttende effekter, spesielt på dopaminerge nevroner24,25. Forskning på plattformer der eksosomer brukes som terapeutiske legemiddelleveringssystemer har intensivt akselerert de siste årene. I mange studier har det blitt observert at relevante legemidler lett kan innkapsles i eksosomer og leveres trygt inn i målceller, vev og organer26,27. Ulike metoder som inkubasjon, fryse / tine sykluser, sonikering og ekstrudering kan brukes til legemiddelbelastning i eksosomer28.
Coincubation med eksosomer eller eksosomlignende vesikler gjør at lipofile små molekyler kan passivt innkapsles i disse leveringssystemene28,29,30. Spesielt ble forskjellige molekyler som curcumin 31, katalase 30, doksorubicin32 og paklitaksel33 effektivt lastet inn i eksosomer. Det har blitt observert at katalaseholdige eksosomer, som har antioksidantaktivitet, effektivt akkumuleres i nevronene og mikroglialcellene i hjernen og viste sterke nevrobeskyttende aktiviteter30. I den samme studien, saponin, lagt inn i komplekset for å øke belastningseffektiviteten, ble funnet å øke stoffbelastningsprosenten under inkubasjon30,34. Imidlertid er det behov for ytterligere studier for å etablere standarder for legemiddelbelastning i eksosomer.
Denne artikkelen beskriver utviklingen av et nanobærersystem ved innkapsling av dopamin i eksosomer som ble isolert fra WJ-MSC. Alle trinn, inkludert dyrking av WJ-MSC, isolering og karakterisering av eksosomer, legemiddelbelastningseksperimenter, karakterisering av dopaminbelastede eksosomer med forskjellige teknikker og in vitro cytotoksisitetsanalyse er forklart i detalj.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td>Aisimo</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Aisimo</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates (Falcon, TPP microplates)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271004-1L</td>
			<td>Used for HPLC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>NUVE-OT 90L</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Cabin</td>
			<td>Hera Safe KS</td>
			<td></td>
			<td>Used for the cell culture process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td>Used in the exosome isolation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator with Safe Cell UV</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td>Used for the cell culture process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine hydrochloride H8502-10G</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8502-10G</td>
			<td>Used in exosome dopamine loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Mixture-F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBJ7249</td>
			<td>Used as cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum-FBS</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>FBS-16A</td>
			<td>It was used by adding to the cell culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U5386S-PE</td>
			<td>To store cells and the resulting exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MPR-215-PE</td>
			<td>Used to store cell culture and other materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance liquid chromatography-HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope- Primovert</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used to observe cells in cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT Assay</td>
			<td>Biomatik</td>
			<td></td>
			<td>Used to measure cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern panalytical</td>
			<td>Malvern panalytical</td>
			<td>Used for exosome characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-100 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Used in the exosome isolation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablet</td>
			<td>Biomatik</td>
			<td>43602</td>
			<td>In the preparation of the PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin Solution</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>PB-S</td>
			<td>It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Aid</td>
			<td>Isolab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance-Kern</td>
			<td>Kern-ABJ220-4NM</td>
			<td></td>
			<td>Used in the preparation of solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q500 Sonicator</td>
			<td>Qsonica, LLC</td>
			<td></td>
			<td>Used to digest exosomes in HPLC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47036-50G-F</td>
			<td>It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrostar-Nano-Spectrophotometry</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td>Used for MTT and drug release analyzes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPSS 22</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>statistical package program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vorteks-FinePCR</td>
			<td>FinePCR-FineVortex</td>
			<td></td>
			<td>Used to mix solutions homogeneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath 37 &#176;C-Senova</td>
			<td>Senova</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wharton&#8217;s jelly mesenchymal stem cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer</td>
			<td>Malvern Nano ZS</td>
			<td>Malvern Nano ZS</td>
			<td>Used for exosome characterization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulating and characterizing an exosome-based dopamine carrier system

Eksosomer mellom 40 og 200 nm i størrelse utgjør den minste undergruppen av ekstracellulære vesikler. Disse bioaktive vesiklene utskilt av celler spiller en aktiv rolle i intercellulær last og kommunikasjon. Exosomer finnes for det meste i kroppsvæsker som plasma, cerebrospinalvæske, urin, spytt, fostervann, råmelk, morsmelk, leddvæske, sæd og pleurasyre. Tatt i betraktning størrelsen på eksosomer, antas det at de kan spille en viktig rolle i sykdommer i sentralnervesystemet fordi de kan passere gjennom blod-hjernebarrieren (BBB). Derfor har denne studien som mål å utvikle et eksosombasert nanobærersystem ved å innkapsle dopamin i eksosomer isolert fra Whartons gelé mesenkymale stamceller (WJ-MSCs). Exosomer som passerte karakteriseringsprosessen ble inkubert med dopamin. De dopaminbelastede eksosomene ble rekarakterisert ved slutten av inkubasjonen. Dopaminbelastede eksosomer ble undersøkt i medikamentfrigivelses- og cytotoksisitetstester. Resultatene viste at dopamin kunne bli vellykket innkapslet i eksosomene, og at de dopaminbelastede eksosomene ikke påvirket fibroblastens levedyktighet.

Eksosomisolasjon og karakterisering Wharton gelé stamceller dyrkes og inkuberes i et serumfritt medium i 48 timer når kulturen når tilstrekkelig tetthet. Etter endt inkubasjon lagres supernatanten ved -20 °C. De innsamlede supernatantene fortynnes med PBS og utsettes for ultrasentrifugering (figur 1). Den oppnådde løsningen analyseres ved NTA- og DLS-analyser. Eksosomene steriliseres ved å passere gjennom et 0, 22 μm filter. Den gjennomsnittlige størrelsen på d...

Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System at JoVE.com

Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System

Her hadde vi som mål å oppnå en formulering ved dopaminbelastning av de isolerte eksosomene av stamceller fra Whartons gelémesenkymale stamceller. Eksosomisolering og karakterisering, legemiddelbelastning i de resulterende eksosomene og den cytotoksiske aktiviteten til den utviklede formuleringen er beskrevet i denne protokollen.

formulere og karakterisere et eksosombasert dopaminbærersystem

Exosomes between 40 and 200 nm in size constitute the smallest subgroup of extracellular vesicles. These bioactive vesicles secreted by cells play an ...

Exosomer kan reagere på vesikler utskilt av en celle mellom 14 og 200 nanometer i størrelse, og splittet fra i intracellulær last og kommunikasjon, som kommer til den minste undergruppen av ekstracellulære vesikler. Exosomer som dannes som et resultat av differensiering av endosomet, stammer fra cellemembranen. Stamcellene kan isoleres fra forskjellige kilder som benmarg eller fettvev.men voksne vevstørkede stamceller har høyere immunogent potensial Ulemper som springer størrelsen på eksosomer, blir det fortalt at det har gjort en viktig rolle i sykdom i sentralnervesystemet fordi det kan passere gjennom til blodhjernebarrieren. For å begynne, vask den frøede Whartons gelé mesenkymale stamceller med fem milliliter PBS. Deretter tilsettes fem milliliter trypsin EDTA-løsning før kolben legges i en inkubator.Etter inkubering, samle cellene og sentrifugen ved 1.500 G i fem minutter. Fjern deretter supernatanten og tilsett en milliliter DMEM-F12 som inneholder 10% FBS til røret. Vask dyrkede celler med PBS.Etter vask, tilsett serumfritt DMEM-F12 medium til cellene og legg det i inkubatoren. For å isolere eksosomene, samle serumfrie medier og sentrifuge ved 300 G ved fire grader Celsius i 10 minutter. Overfør supernatanten til et annet rør og behandle den ved seriesentrifugering ved høyere hastigheter.Etter den endelige sentrifugeringen, fjern sakte supernatanten og oppløs pelleten i en milliliter PBS. Bland ved vortexing og fortsett med ultracentrifugation ved 110 000 g i 70 minutter ved fire grader Celsius. Tilsett tre milliliter PBS til eksosomsuspensjonen samlet tidligere ved ultrasentrifugering og steriliser den fortynnede suspensjonen ved filtrering ved bruk av et 0,22 mikron filter.Overfør deretter 500 mikroliter av den steriliserte eksosomsuspensjonen til et annet rør. Deretter tilsettes 500 mikroliter 0,5 milligram per milliliter dopaminoppløsning og saponin i den steriliserte suspensjonen. Etter inkubering ultracentrifuge suspensjonen.Prøven kan enten brukes til NTA- og DLS-analyse for å karakterisere dopaminlastede eksosomer eller lagres ved minus 20 grader Celsius til videre bruk. I NTA-analysen ble den gjennomsnittlige størrelsen på Wharton-geléavledede eksosomer bestemt til å være 98 nanometer og dopaminbelastede eksosomer til å være 110 nanometer. Antallet nanopartikler avslørt av NTA- og DLS-analyser var konsistente med hverandre.Zetapotensialet til Wharton-geléavledede eksosomer ble målt som minus 15,7 og dopaminbelastede eksosomer som minus 17,6 millivolt. HPLC-analysen av de dopaminbelastede eksosomene oppdaget toppen for dopamin etter 6,45 minutter. Den kumulative legemiddelfrigjøringsprofilen viste at 74,8% av innkapslet dopamin ble frigjort fra eksosomene innen de første åtte timene.Cytotoksisiteten til de dopaminlastede og frie eksosomene på fibroblaster ble undersøkt. Selv om de dopaminbelastede eksosomene ikke viste noen cytotoksiske effekter, reduserte saponin fibroblastens levedyktighet. MTT-analysen viste økt cellelevedyktighet når fibroblastene ble behandlet med dopaminbelastede eksosomer.Den statistiske signifikansen av resultatene ble evaluert ved å utføre enveis anova. I tillegg ble de cytotoksiske effektene av forskjellige konsentrasjoner av frie eksosomer undersøkt på fibroblastene. Fibroblastens levedyktighet var høyere med frie eksosomer i konsentrasjonen på 25 mikroliter per milliliter.Det er veldig viktig for sentralnervesystemet er pasientstørrelsene, lekerollen i prosessene som plastisitet, nevrorespons, side til side-kommunikasjon og nevrogenese i hjernen. I tillegg, takket være overflaten av eksosomer, står det, har blitt observert at de kan samhandle med målcellemedikament og aktivitet levert under stoffet Er en ferdigstillelse. For første gang i studien utviklet vi en ny legemiddelformulering ved å innkapsle dopamin i stamcelleavledede eksosomer.Han foreslo at denne formuleringen vil være så lovende for behandling av Parkinsons sykdom.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Et eksperimentelt system for å studere Mechanotransduction i Fetal lungeceller

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Metoder for å karakterisere Co-utvikling av Biofilm og Habitat Heterogenitet

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Design og implementering av en automatisert Illuminating, dyrking, og Sampling System for Microbial optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

Målrettet plasmamembran Levering av en hydrofob Cargo innkapslet i en Liquid Crystal partikler Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Karakterisere celle migrasjon tredimensjonale In Vitro sår miljøer

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Syntese av smittsomme Bacteriophages i en E. coli -basert Cell-free uttrykk System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

En Orbital risting kultur pattedyrceller i O-formet fartøy å produsere Uniform aggregater

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

En kirurgiske teknikken som grunnlag for i Vivo delvis leveren Engineering i rotte

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

Sanntids visualisering og analyse av Chondrocyte personskader mekaniske belastninger i fullt intakt Murine brusk Explants

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

Screening og identifisering av små peptider målretting Fibroblast vekstfaktor Receptor2 ved hjelp av en Phage display peptid bibliotek

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...