Name: formulating and characterizing an exosome-based dopamine carrier system
Uploaded: 2022-04-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System at JoVE.com

O trabalho foi apoiado principalmente por financiamento de pesquisa fornecido por Yıldız Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713).

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais e equipamentos utilizados neste protocolo.
1. Cultura e criopreservação de células-tronco mesenquimais gelatinosas de Wharton
<ol><li>Remova os WJ-MSCs (do ATCC) do congelador de -80 °C. Semeando as células em um frasco contendo meio DMEM-F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB). Incubá-los a 37 °C numa incubadora contendo 5% de CO2.</li>
	...

Exossomos são pequenas vesículas de membrana com dimensões de 40-200 nm secretadas pela maioria dos tipos celulares, por exemplo, CTMs1. Capazes de permitir a comunicação entre as células, os exossomos podem entrar nas células de diferentes maneiras, como endocitose, fagocitose, micropinocitose, internalização mediada por lipídios e fusão33,44. Comparados a outros sistemas nanocarreadores, os lipídios e o colesterol encontrados...

Os exossomos, vesículas bioativas com características significativas, variam em tamanho de 40 nm a 200 nm. Os exossomos originam-se da membrana celular e são formados devido à liberação dos endossomos1. Essas estruturas servem como comunicadores célula a célula e interagem com células vizinhas para facilitar a transferência de moléculas ativas. Os exossomos podem ser isolados de muitas fontes diferentes. Estes incluem fluidos corporais como plasma, urina, líquido cefalorraquidiano, saliva, bem como linhagens celulares cultivadas em condições in vitro . Os exossomos têm papel importante na eliminação de lesões nervosas, graças às biomacromoléculas que contêm, como lipídios, proteínas e ácidos nucléicos2. A glia, que são as células de suporte do sistema nervoso3, transfere proteínas e micro RNAs para os axônios dos neurônios via exossomos4.
Os lipídios que formam a bainha de mielina, característicos da condução nervosa, também são liberados dos oligodendrócitos via exossomos 4,5. Os exossomos também estão envolvidos em processos como plasticidade sináptica, resposta neuronal ao estresse, comunicação célula-célula e neurogênese no cérebro 6,7. O fato de os exossomos possuírem nanodimensões permite que eles passem pelo BBB. Existe uma rota especial de transição do líquido intersticial para o líquido cefalorraquidiano após a penetração dessa membrana8. Graças às suas propriedades de superfície, os exossomos podem interagir eficientemente com as células-alvo como um sistema de liberação de drogas e entregar ativamente os medicamentos carregados.
Devido à expressão de várias proteínas adesivas (tetraspaninas e integrinas) na superfície dos exossomos, essas vesículas extracelulares podem facilmente interagir e fundir-se com as membranas celulares dohospedeiro9. Acredita-se que os exossomos podem ser usados como um sistema de liberação de drogas, especialmente no tratamento de doenças do sistema nervoso central, devido à sua capacidade de penetrar na BHE e suas propriedades de superfície. Exossomos derivados de células-tronco mesenquimais (CTM) apresentam menor risco de rejeição imunológica quando comparados às terapias celulares alogênicas e, nesse aspecto, podem ser um componente importante de aplicações de tratamento livre de células10.
A dopamina é uma molécula cuja deficiência no cérebro é a característica da doença de Parkinson (DP), agravando-se a cada dia11,12,13. Sabe-se que a DP está associada à degeneração de neurônios dopaminérgicos na substância negra do mesencéfalo e à perda das funções dos neurônios motores14,15. A morte dos neurônios dopaminérgicos impede o fornecimento do neurotransmissor dopamina para o estriado cerebral. Isso, por sua vez, resulta no surgimento de sintomas específicos da DP16. Esses sintomas da DP são bradicinesia, instabilidade postural, rigidez e, principalmente, tremor de repouso12,13. Embora a DP tenha sido descrita pela primeira vez há mais de dois séculos, estudos para entender a patologia e a etiologia da doença ainda estão em andamento e atualmente é aceito que a DP é uma doença sistêmicacomplexa17. Prevê-se que ocorra deficiência de dopamina, e sintomas clínicos de DP são observados quando mais de 80% dos neurônios degeneram18. No tratamento da doença, a suplementação incompleta de dopamina é preferida para reduzir os sintomas motores. Estudos in vivo demonstraram que a infusão direta de dopamina no cérebro reduz significativamente os sintomas em animais19. Precursores de dopamina como a L-DOPA (L-3,4-dihidroxifenilalanina) e drogas receptoras de dopamina são usados na clínica porque a infusão direta de dopamina no cérebro não é possível em humanos e a dopamina que entra no sistema não pode atravessar a BHE20. Esses tipos de medicamentos perdem sua eficácia com o tempo. No entanto, ainda não existe uma abordagem terapêutica curativa para a DP. Assim, há uma enorme necessidade de desenvolver novas estratégias terapêuticas e modalidades de tratamento para revelar a fisiopatologia da doença e reduzir o impacto da DP nos pacientes.
Estudos baseados em exossomos têm recentemente atraído atenção por reunir informações sobre abordagens terapêuticas e patologias de doenças do sistema nervoso. Exossomos derivados de CTM demonstraram reduzir a inflamação no dano ao nervo e contribuir para a regeneração neuronal21,22,23. Além disso, tem sido relatado que os secretomas do exossomo derivados das CTM reduzem a apoptose por apresentarem efeitos neurotróficos e neuroprotetores, especialmente sobre os neurônios dopaminérgicos24,25. A pesquisa em plataformas nas quais exossomos são usados como sistemas terapêuticos de liberação de fármacos tem acelerado intensamente nos últimos anos. Em numerosos estudos, observou-se que drogas relevantes podem ser facilmente encapsuladas em exossomos e entregues com segurança em células-alvo, tecidos e órgãos26,27. Diferentes métodos como incubação, ciclos de congelamento/descongelamento, sonicação e extrusão podem ser utilizados para o carregamento de fármacos em exossomos28.
A coincubação com exossomos ou vesículas semelhantes a exossomos permite que pequenas moléculas lipofílicas sejam passivamente encapsuladas nesses sistemas de liberação28,29,30. Em particular, várias moléculas como curcumina 31, catalase 30, doxorrubicina32, e paclitaxel33 foram efetivamente carregadas em exossomos. Observou-se que os exossomos contendo catalase, que possuem atividade antioxidante, acumularam-se eficientemente nos neurônios e células da microglia no cérebro e exibiram forte atividade neuroprotetora30. No mesmo estudo, a saponina, adicionada ao complexo para aumentar a eficiência de carga, aumentou a porcentagem de carga do fármaco durante a incubação30,34. No entanto, mais estudos são necessários para estabelecer os padrões para a carga de drogas em exossomos.
Este trabalho descreve o desenvolvimento de um sistema nanocarreador por encapsulamento de dopamina em exossomos isolados de CTMs-WJ. Todas as etapas, incluindo o cultivo de CTMs-WJ, isolamento e caracterização de exossomos, experimentos de carregamento de drogas, caracterização de exossomos carregados de dopamina com várias técnicas e análise de citotoxicidade in vitro são explicadas em detalhes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td>Aisimo</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Aisimo</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates (Falcon, TPP microplates)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271004-1L</td>
			<td>Used for HPLC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>NUVE-OT 90L</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Cabin</td>
			<td>Hera Safe KS</td>
			<td></td>
			<td>Used for the cell culture process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td>Used in the exosome isolation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator with Safe Cell UV</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td>Used for the cell culture process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine hydrochloride H8502-10G</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8502-10G</td>
			<td>Used in exosome dopamine loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Mixture-F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBJ7249</td>
			<td>Used as cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum-FBS</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>FBS-16A</td>
			<td>It was used by adding to the cell culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U5386S-PE</td>
			<td>To store cells and the resulting exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MPR-215-PE</td>
			<td>Used to store cell culture and other materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance liquid chromatography-HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope- Primovert</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used to observe cells in cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT Assay</td>
			<td>Biomatik</td>
			<td></td>
			<td>Used to measure cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern panalytical</td>
			<td>Malvern panalytical</td>
			<td>Used for exosome characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-100 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Used in the exosome isolation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablet</td>
			<td>Biomatik</td>
			<td>43602</td>
			<td>In the preparation of the PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin Solution</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>PB-S</td>
			<td>It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Aid</td>
			<td>Isolab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance-Kern</td>
			<td>Kern-ABJ220-4NM</td>
			<td></td>
			<td>Used in the preparation of solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q500 Sonicator</td>
			<td>Qsonica, LLC</td>
			<td></td>
			<td>Used to digest exosomes in HPLC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47036-50G-F</td>
			<td>It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrostar-Nano-Spectrophotometry</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td>Used for MTT and drug release analyzes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPSS 22</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>statistical package program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vorteks-FinePCR</td>
			<td>FinePCR-FineVortex</td>
			<td></td>
			<td>Used to mix solutions homogeneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath 37 &#176;C-Senova</td>
			<td>Senova</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wharton&#8217;s jelly mesenchymal stem cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer</td>
			<td>Malvern Nano ZS</td>
			<td>Malvern Nano ZS</td>
			<td>Used for exosome characterization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulating and characterizing an exosome-based dopamine carrier system

Exossomos entre 40 e 200 nm de tamanho constituem o menor subgrupo de vesículas extracelulares. Essas vesículas bioativas secretadas pelas células desempenham um papel ativo na carga intercelular e na comunicação. Os exossomos são encontrados principalmente em fluidos corporais como plasma, líquido cefalorraquidiano, urina, saliva, líquido amniótico, colostro, leite materno, líquido articular, sêmen e ácido pleural. Considerando o tamanho dos exossomos, acredita-se que eles possam desempenhar um papel importante em doenças do sistema nervoso central, pois podem atravessar a barreira hematoencefálica (BHE). Assim, este estudo teve como objetivo desenvolver um sistema nanocarreador baseado em exossomos por meio do encapsulamento de dopamina em exossomos isolados de células-tronco mesenquimais gelatinosas de Wharton (CTMs-WJ). Os exossomos que passaram pelo processo de caracterização foram incubados com dopamina. Os exossomos carregados de dopamina foram recaracterizados ao final da incubação. Exossomos com dopamina foram investigados em ensaios de liberação de fármacos e citotoxicidade. Os resultados mostraram que a dopamina pode ser encapsulada com sucesso dentro dos exossomos e que os exossomos carregados de dopamina não afetaram a viabilidade dos fibroblastos.

Isolamento e caracterização de exossomos As células-tronco da geleia de Wharton são cultivadas e incubadas em meio livre de soro por 48 h quando a cultura atinge densidade suficiente. Após o término da incubação, o sobrenadante é armazenado a -20 °C. Os sobrenadantes coletados são diluídos em PBS e submetidos à ultracentrifugação (Figura 1). A solução obtida é analisada por NTA e DLS. Os exossomos são esterilizados passando por um filtro de 0,22 μm. O...

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Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System

Nosso objetivo foi obter uma formulação por carga de dopamina dos exossomos isolados de células-tronco da geleia mesenquimal de Wharton. O isolamento e caracterização dos exossomos, a carga do fármaco nos exossomos resultantes e a atividade citotóxica da formulação desenvolvida são descritos neste protocolo.

Formulando e caracterizando um sistema portador de dopamina baseado em exossomo

Exosomes between 40 and 200 nm in size constitute the smallest subgroup of extracellular vesicles. These bioactive vesicles secreted by cells play an ...

Os exossomos podem reagir a vesículas secretadas por uma célula entre 14 e 200 nanômetros de tamanho, e se separar da carga e comunicação intracelular, que chega ao menor subgrupo de vesículas extracelulares. Exossomos que são formados como resultado da diferenciação do endossomo, originam-se da membrana celular. As células-tronco podem ser isoladas de diferentes fontes, como medula óssea ou tecido adiposo.mas as células-tronco secas do tecido adulto têm maior potencial imunogênico Cons surgindo o tamanho dos exossomos, é dito que fez um papel importante na doença do sistema nervoso central porque pode passar através da barreira hemato-encefálica. Para começar, lave as células-tronco mesenquimais gelatinosas de Wharton com cinco mililitros de PBS. Em seguida, adicionar cinco mililitros de solução de tripsina EDTA antes de colocar o balão numa incubadora.Após a incubação, coletar as células e centrifugar a 1.500 G por cinco minutos. Em seguida, remova o sobrenadante e adicione um mililitro de DMEM-F12 contendo 10% FBS ao tubo. Lavar células cultivadas com PBS.Após a lavagem, adicionar meio DMEM-F12 livre de soro às células e colocá-lo na incubadora. Para isolar os exossomos, coletar o meio livre de soro e centrifugar a 300 G a quatro graus Celsius por 10 minutos. Transfira o sobrenadante para outro tubo e processe-o por centrifugação seriada em velocidades mais altas.Após a centrifugação final, remova lentamente o sobrenadante e dissolva o pellet em PBS de um mililitro. Misture por vórtice e prossiga com a ultracentrifugação a 110.000 G por 70 minutos a quatro graus Celsius. Adicionar três mililitros de PBS à suspensão do exossomo coletada anteriormente por ultracentrifugação e esterilizar a suspensão diluída por filtração usando um filtro de 0,22 mícron.Em seguida, transfira 500 microlitros da suspensão esterilizada do exossomo para outro tubo. Em seguida, sequencialmente, adicione 500 microlitros de 0,5 miligramas por mililitro de solução de dopamina e saponina na suspensão esterilizada. Após a incubação ultracentrifugar a suspensão.A amostra pode ser usada para análise de NTA e DLS para caracterizar exossomos carregados de dopamina ou armazenada a menos 20 graus Celsius até uso posterior. Na análise NTA, o tamanho médio dos exossomos derivados da geleia de Wharton foi determinado como sendo 98 nanômetros e os exossomos carregados com dopamina como sendo 110 nanômetros. Os números de nanopartículas revelados pelas análises de NTA e DLS foram consistentes entre si.O potencial zeta dos exossomos derivados da geleia de Wharton foi medido como menos 15,7 e os exossomos carregados de dopamina como menos 17,6 milivolts. A análise por HPLC dos exossomos carregados de dopamina detectou o pico de dopamina aos 6,45 minutos. O perfil de liberação cumulativa da droga revelou que 74,8% da dopamina encapsulada foi liberada dos exossomos nas primeiras oito horas.A citotoxicidade dos exossomos dopamina carregados e livres em fibroblastos foi investigada. Embora os exossomos carregados de dopamina não tenham demonstrado efeitos citotóxicos, a saponina diminuiu a viabilidade dos fibroblastos. O ensaio de MTT mostrou aumento da viabilidade celular quando os fibroblastos foram tratados com os exossomos carregados de dopamina.A significância estatística dos resultados foi avaliada pela realização de anova one-way. Adicionalmente, os efeitos citotóxicos de diferentes concentrações de exossomos livres foram investigados sobre os fibroblastos. A viabilidade dos fibroblastos foi maior com os exossomos livres na concentração de 25 microlitros por mililitro.É realmente importante para o sistema nervoso central é o tamanho do paciente, o papel desempenhado nos processos como plasticidade, resposta neuro, comunicação lado a lado, e neurogênese no cérebro. Além disso, graças à superfície dos exossomos, diz, foi observado que eles podem interagir com a droga da célula alvo e a atividade entregue durante a droga é uma conclusão. Pela primeira vez no estudo, desenvolvemos uma nova formulação de droga encapsulando dopamina em exossomos derivados de células-tronco.Ele propôs que essa formulação será tão promissora para o tratamento da doença de Parkinson.

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