Name: formulating and characterizing an exosome-based dopamine carrier system
Uploaded: 2022-04-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System at JoVE.com

Работа была в основном поддержана финансированием исследований, предоставленным Научно-исследовательскими проектами Технического университета Йылдыз (TSA-2021-4713).

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации, относящейся ко всем материалам и оборудованию, используемым в этом протоколе.
1. Культивирование и криоконсервация желейных мезенхимальных стволовых клеток Уортона
<ol><li>Извлеките...

Экзосомы представляют собой небольшие мембранные везикулы размером 40-200 нм, секретируемые большинством типов клеток, например, МСК1. Способные обеспечивать коммуникацию между клетками, экзосомы могут проникать в клетки различными путями, такими как эндоцитоз, фагоцитоз, м...

Экзосомы, биологически активные везикулы со значительными особенностями, имеют размер от 40 нм до 200 нм. Экзосомы происходят из клеточной мембраны и образуются в результате высвобождения эндосом1. Эти структуры служат межклеточными коммуникаторами и взаимодействуют с соседними клетками, облегчая передачу активных молекул. Экзосомы могут быть выделены из множества различных источников. К ним относятся биологические жидкости, такие как плазма, моча, спинномозговая жидкость, слюна, а также клеточные линии, культивируемые в условиях in vitro . Экзосомы играют важную роль в устранении повреждений нервов благодаря содержащимся в них биомакромолекулам, таким как липиды, белки и нуклеиновыекислоты. Глии, которые являются опорными клетками нервной системы3, переносят белки и микроРНК к аксонам нейронов через экзосомы4.
Липиды, образующие миелиновую оболочку, которые являются характерной особенностью нервной проводимости, также высвобождаются из олигодендроцитов через экзосомы 4,5. Экзосомы также участвуют в таких процессах, как синаптическая пластичность, реакция нейронов на стресс, межклеточная коммуникация и нейрогенез в мозге 6,7. Тот факт, что экзосомы обладают наноразмерностью, позволяет им проходить через ГЭБ. Существует специальный путь перехода от интерстициальной жидкости к спинномозговой жидкости после проникновения через эту мембрану8. Благодаря своим поверхностным свойствам экзосомы могут эффективно взаимодействовать с клетками-мишенями в качестве системы доставки лекарств и активно доставлять загруженные лекарства.
Благодаря экспрессии различных адгезивных белков (тетраспанинов и интегринов) на поверхности экзосом эти внеклеточные везикулы могут легко взаимодействовать и сливаться с клеточными мембранамихозяина 9. Считается, что экзосомы могут быть использованы в качестве системы доставки лекарств, особенно при лечении заболеваний центральной нервной системы из-за их способности проникать в ГЭБ и их поверхностных свойств. Экзосомы, полученные из мезенхимальных стволовых клеток (МСК), имеют более низкий риск иммунного отторжения по сравнению с аллогенной клеточной терапией, и в этом отношении они могут быть важным компонентом применения бесклеточного лечения10.
Дофамин – это молекула, дефицит которой в головном мозге является характерным признаком болезни Паркинсона (БП), ухудшающейся день ото дня11,12,13. Известно, что болезнь Паркинсона ассоциирована с дегенерацией дофаминергических нейронов в черной субстанции мезэнфералона и потерей функций двигательных нейронов14,15. Гибель дофаминергических нейронов препятствует поступлению нейромедиатора дофамина в полосатое тело головного мозга. Это, в свою очередь, приводит к возникновению симптомов, специфичных для БП16. Такими симптомами БП являются брадикинезия, постуральная нестабильность, ригидность и особенно тремор в покое12,13. Несмотря на то, что болезнь Паркинсона была впервые описана более двух столетий назад, исследования, направленные на понимание патологии и этиологии заболевания, все еще продолжаются, и в настоящее время признано, что болезнь Паркинсона является сложным системнымзаболеванием. Прогнозируется, что дефицит дофамина возникает, а клинические симптомы болезни Паркинсона наблюдаются при дегенерации более 80% нейронов18. При лечении заболевания предпочтение отдается неполному приему дофамина для уменьшения двигательных симптомов. Исследования in vivo показали, что прямая инфузия дофамина в мозг значительно уменьшает симптомыу животных. Предшественники дофамина, такие как L-ДОФА (L-3,4-дигидроксифенилаланин) и препараты дофаминовых рецепторов, используются в клинике, потому что прямая инфузия дофамина в мозг у человека невозможна, и дофамин, попадая в систему, не может пересечьГЭБ-20. Эти виды препаратов со временем теряют свою эффективность. Тем не менее, до сих пор не существует подхода к лечению болезни Паркинсона. Следовательно, существует огромная необходимость в разработке новых терапевтических стратегий и методов лечения для выявления патофизиологии заболевания и снижения влияния БП на пациентов.
Исследования на основе экзосом в последнее время привлекли внимание в связи со сбором информации как о терапевтических подходах, так и о патологиях заболеваний нервной системы. Было показано, что экзосомы, полученные из МСК, уменьшают воспаление при повреждении нервов и способствуют регенерации нейронов21,22,23. Кроме того, сообщалось, что секретомы экзосом, полученные из МСК, снижают апоптоз, проявляя нейротрофические и нейропротекторные эффекты, особенно на дофаминергических нейронах24,25. Исследования платформ, в которых экзосомы используются в качестве терапевтических систем доставки лекарств, интенсивно ускорились в последние годы. В многочисленных исследованиях было замечено, что соответствующие лекарственные препараты могут быть легко инкапсулированы в экзосомы и безопасно доставлены в клетки, ткани и органы-мишени26,27. Различные методы, такие как инкубация, циклы замораживания/оттаивания, ультразвуковая обработка и экструзия, могут быть использованы для загрузки лекарств в экзосомы28.
Коинкубация с экзосомами или экзосомоподобными везикулами позволяет пассивно инкапсулировать липофильные малые молекулы в эти системы доставки28,29,30. В частности, различные молекулы, такие как куркумин31, каталаза30, доксорубицин 32 и паклитаксел33, были эффективно загружены в экзосомы. Было замечено, что каталазосодержащие экзосомы, обладающие антиоксидантной активностью, эффективно накапливаются в нейронах и клетках микроглии головного мозга и проявляют сильную нейропротекторную активность30. В этом же исследовании было обнаружено, что сапонин, добавленный в комплекс для повышения эффективности загрузки, увеличивает процент загрузки препарата во время инкубации30,34. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования, чтобы установить стандарты загрузки лекарств в экзосомы.
В данной работе описывается разработка системы наноносителей путем инкапсуляции дофамина в экзосомы, которые были выделены из WJ-MSCs. Подробно объясняются все этапы, включая культивирование WJ-МСК, выделение и характеристику экзосом, эксперименты по загрузке лекарственными препаратами, характеристику экзосом, нагруженных дофамином, с помощью различных методов и анализ цитотоксичности in vitro .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td>Aisimo</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Aisimo</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates (Falcon, TPP microplates)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271004-1L</td>
			<td>Used for HPLC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>NUVE-OT 90L</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Cabin</td>
			<td>Hera Safe KS</td>
			<td></td>
			<td>Used for the cell culture process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td>Used in the exosome isolation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator with Safe Cell UV</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td>Used for the cell culture process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine hydrochloride H8502-10G</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8502-10G</td>
			<td>Used in exosome dopamine loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Mixture-F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBJ7249</td>
			<td>Used as cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum-FBS</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>FBS-16A</td>
			<td>It was used by adding to the cell culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U5386S-PE</td>
			<td>To store cells and the resulting exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MPR-215-PE</td>
			<td>Used to store cell culture and other materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance liquid chromatography-HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope- Primovert</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used to observe cells in cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT Assay</td>
			<td>Biomatik</td>
			<td></td>
			<td>Used to measure cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern panalytical</td>
			<td>Malvern panalytical</td>
			<td>Used for exosome characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-100 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Used in the exosome isolation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablet</td>
			<td>Biomatik</td>
			<td>43602</td>
			<td>In the preparation of the PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin Solution</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>PB-S</td>
			<td>It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Aid</td>
			<td>Isolab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance-Kern</td>
			<td>Kern-ABJ220-4NM</td>
			<td></td>
			<td>Used in the preparation of solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q500 Sonicator</td>
			<td>Qsonica, LLC</td>
			<td></td>
			<td>Used to digest exosomes in HPLC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47036-50G-F</td>
			<td>It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrostar-Nano-Spectrophotometry</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td>Used for MTT and drug release analyzes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPSS 22</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>statistical package program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vorteks-FinePCR</td>
			<td>FinePCR-FineVortex</td>
			<td></td>
			<td>Used to mix solutions homogeneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath 37 &#176;C-Senova</td>
			<td>Senova</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wharton&#8217;s jelly mesenchymal stem cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer</td>
			<td>Malvern Nano ZS</td>
			<td>Malvern Nano ZS</td>
			<td>Used for exosome characterization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulating and characterizing an exosome-based dopamine carrier system

Экзосомы размером от 40 до 200 нм составляют наименьшую подгруппу внеклеточных везикул. Эти биологически активные везикулы, секретируемые клетками, играют активную роль в межклеточном грузе и коммуникации. Экзосомы в основном содержатся в жидкостях организма, таких как плазма, спинномозговая жидкость, моча, слюна, околоплодные воды, молозиво, грудное молоко, суставная жидкость, сперма и плевральная кислота. Учитывая размер экзосом, считается, что они могут играть важную роль в заболеваниях центральной нервной системы, поскольку они могут проходить через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Таким образом, это исследование было направлено на разработку системы наноносителей на основе экзосом путем инкапсуляции дофамина в экзосомы, выделенные из желейных мезенхимальных стволовых клеток Уортона (WJ-MSCs). Экзосомы, прошедшие процесс характеризации, инкубировали с дофамином. Экзосомы, нагруженные дофамином, были повторно охарактеризованы в конце инкубации. Экзосомы, нагруженные дофамином, были исследованы в анализах на высвобождение лекарств и цитотоксичность. Результаты показали, что дофамин может быть успешно инкапсулирован в экзосомах, и что экзосомы, загруженные дофамином, не влияют на жизнеспособность фибробластов.

Выделение и характеристика экзосом Стволовые клетки Уортонского желе культивируют и инкубируют в безсывороточной среде в течение 48 ч, когда культура достигает достаточной плотности. После окончания инкубации надосадочную жидкость хранят при температуре -20 °С. Собранные н?...

Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System at JoVE.com

Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System

В данной работе мы стремились получить рецептуру путем дофаминовой загрузки изолированных экзосом стволовых клеток из желейных мезенхимальных стволовых клеток Уортона. Выделение и характеристика экзосом, загрузка препарата в полученные экзосомы и цитотоксическая активность разработанной лекарственной формы описаны в данном протоколе.

Формулировка и характеристика экзосомно-носительской системы дофамина

Exosomes between 40 and 200 nm in size constitute the smallest subgroup of extracellular vesicles. These bioactive vesicles secreted by cells play an ...

Экзосомы могут реагировать на везикулы, секретируемые клеткой размером от 14 до 200 нанометров, и расщепляются во внутриклеточном грузе и коммуникациях, которые попадают в самую маленькую подгруппу внеклеточных везикул. Экзосомы, которые образуются в результате дифференцировки эндосомы, берут свое начало из клеточной мембраны. Стволовые клетки могут быть выделены из различных источников, таких как костный мозг или жировая ткань.но взрослые высушенные стволовые клетки имеют более высокий иммуногенный потенциал Говорят, что они играют важную роль в заболеваниях центральной нервной системы, потому что они могут проникать через гематоэнцефалический барьер. Для начала промойте засеянные мезенхимальные стволовые клетки желе Уортона пятью миллилитрами PBS. Затем добавьте пять миллилитров раствора трипсина ЭДТА перед помещением колбы в инкубатор.После инкубации собирают клетки и центрифугируют при 1,500 Г в течение пяти минут. Затем удалите надосадочную жидкость и добавьте в пробирку один миллилитр DMEM-F12, содержащего 10% FBS. Промыть культивируемые клетки PBS.После промывки добавьте в клетки безсывороточную среду DMEM-F12 и поместите ее в инкубатор. Чтобы изолировать экзосомы, соберите свободную от сыворотки среду и центрифугируйте при 300 G при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Перелейте надосадочную жидкость в другую пробирку и обработайте ее последовательным центрифугированием на более высоких скоростях.После окончательного центрифугирования медленно удалите надосадочную жидкость и растворите гранулу в одном миллилитре PBS. Перемешайте вихревым способом и приступайте к ультрацентрифугированию при 110 000 G в течение 70 минут при температуре четыре градуса Цельсия. К суспензии экзосом, собранной ранее ультрацентрифугированием, добавляют три миллилитра PBS и стерилизуют разбавленную суспензию фильтрацией с помощью фильтра 0,22 мкм.Затем переложите 500 микролитров стерилизованной суспензии экзосом в другую пробирку. Далее последовательно добавляют в стерилизованную суспензию 500 микролитров раствора дофамина и сапонина по 0,5 миллиграмма на миллилитр. После инкубации ультрацентрифугируют суспензию.Образец может быть использован для анализа NTA и DLS для характеристики экзосом, нагруженных дофамином, или храниться при температуре минус 20 градусов Цельсия до дальнейшего использования. В анализе NTA средний размер экзосом, полученных из желе Уортона, был определен как 98 нанометров, а экзосом, загруженных дофамином, — 110 нанометров. Количество наночастиц, выявленных при анализе NTA и DLS, соответствовало друг другу.Дзета-потенциал экзосом, полученных из желе Уортона, был измерен как минус 15,7, а экзосом, загруженных дофамином, как минус 17,6 милливольт. ВЭЖХ-анализ экзосом, нагруженных дофамином, выявил пик дофамина на 6,45-й минуте. Кумулятивный профиль высвобождения препарата показал, что 74,8% инкапсулированного дофамина было высвобождено из экзосом в течение первых восьми часов.Исследована цитотоксичность дофаминовых и свободных экзосом на фибробластах. Несмотря на то, что экзосомы с дофаминовой нагрузкой не проявляли никаких цитотоксических эффектов, сапонин снижал жизнеспособность фибробластов. МТТ-анализ показал повышенную жизнеспособность клеток, когда фибробласты были обработаны экзосомами, загруженными дофамином.Статистическую значимость результатов оценивали путем выполнения одностороннего анова. Кроме того, исследовано цитотоксическое действие различных концентраций свободных экзосом на фибробласты. Жизнеспособность фибробластов была выше у свободных экзосом в концентрации 25 микролитров на миллилитр.Для центральной нервной системы очень важен размер пациента, играющий роль в таких процессах, как пластичность, нейрореакция, межвидовая коммуникация и нейрогенез в головном мозге. Кроме того, благодаря поверхности экзосом, было замечено, что они могут взаимодействовать с клетками-мишенями и проявлять активность, доставляемую во время приема препарата. Впервые в исследовании мы разработали новую лекарственную форму, инкапсулировав дофамин в экзосомы, полученные из стволовых клеток.Он предположил, что эта формулировка будет столь перспективной для лечения болезни Паркинсона.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Экспериментальная система по изучению механотрансдукции в эмбриональные клетки легких

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Методы Характеризуя совместного развития биопленки и Хабитат неоднородности

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Разработка и внедрение автоматизированной освещая, культивированием и система отбора проб для микробного оптогенетика приложений

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

Целенаправленное плазматической мембраны Поставка гидрофобной Cargo инкапсулированы в жидком кристалле наночастицы Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Характеризующие клеток миграции в рамках трехмерной в Vitro рану среды

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Синтез инфекционных бактериофагов в E. coli-на основе свободных клеток выражение системы

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Орбиталь, пожимая культуры Mammalian клеток в O-образный судов для получения единообразных агрегатов

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Роман хирургической техники как основы для в естественных условиях частичной печени инженерии в крыса

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

В реальном времени визуализации и анализа хондроцитов травмы вследствие механической загрузки в полной сохранности мышиных хряща эксплантов

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

Скрининг и идентификация малых пептидов Ориентация Фактор роста Фибробласты Рецептор2 с помощью Phage Дисплей Пептид библиотека

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...