Name: formulating and characterizing an exosome-based dopamine carrier system
Uploaded: 2022-04-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System at JoVE.com

El trabajo fue financiado principalmente por fondos de investigación proporcionados por los Proyectos de Investigación Científica de la Universidad Técnica de Yıldız (TSA-2021-4713).

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales y equipos utilizados en este protocolo.
1. Cultivo y criopreservación de células madre mesenquimales de gelatina de Wharton
<ol><li>Retire los WJ-MSC (del ATCC) del congelador a -80 °C. Siembre las células en un matraz que contenga medio DMEM-F12 suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS). Incubarlos a 37 °C en una incubadora que contenga 5% de CO<...

Los exosomas son pequeñas vesículas de membrana con dimensiones de 40-200 nm secretadas por la mayoría de los tipos de células, por ejemplo, las MSC1. Capaces de permitir la comunicación entre células, los exosomas pueden entrar en las células de diferentes maneras, como endocitosis, fagocitosis, micropinocitosis, internalización mediada por lípidos y fusión33,44. En comparación con otros sistemas de nanotransportadores, los lí...

Los exosomas, vesículas bioactivas con características significativas, varían en tamaño de 40 nm a 200 nm. Los exosomas se originan en la membrana celular y se forman debido a la liberación de los endosomas1. Estas estructuras sirven como comunicadores de célula a célula e interactúan con las células vecinas para facilitar la transferencia de moléculas activas. Los exosomas se pueden aislar de muchas fuentes diferentes. Estos incluyen fluidos corporales como plasma, orina, líquido cefalorraquídeo, saliva, así como líneas celulares cultivadas en condiciones in vitro . Los exosomas tienen un papel importante en la eliminación del daño nervioso, gracias a las biomacromoléculas que contienen, como lípidos, proteínas y ácidos nucleicos2. Los glías, que son las células de soporte del sistema nervioso3, transfieren proteínas y micro ARN a los axones de las neuronas a través de exosomas4.
Los lípidos que forman la vaina de mielina, que son un rasgo característico de la conducción nerviosa, también se liberan de los oligodendrocitos a través de los exosomas 4,5. Los exosomas también están implicados en procesos como la plasticidad sináptica, la respuesta al estrés neuronal, la comunicación célula-célula y la neurogénesis en el cerebro 6,7. El hecho de que los exosomas posean nanodimensiones les permite pasar a través de la barrera hematoencefálica. Existe una ruta especial de transición desde el líquido intersticial hasta el líquido cefalorraquídeo después de penetrar en esta membrana8. Gracias a sus propiedades superficiales, los exosomas pueden interactuar de manera eficiente con las células diana como un sistema de administración de fármacos y administrar activamente los fármacos cargados.
Debido a la expresión de diversas proteínas adhesivas (tetraspaninas e integrinas) en la superficie de los exosomas, estas vesículas extracelulares pueden interactuar y fusionarse fácilmente con las membranas de las células huésped9. Se cree que los exosomas pueden utilizarse como sistema de administración de fármacos, especialmente en el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central debido a su capacidad para penetrar en la barrera hematoencefálica y sus propiedades superficiales. Los exosomas derivados de células madre mesenquimales (MSC) tienen un menor riesgo de rechazo inmunológico en comparación con las terapias celulares alogénicas y, en este sentido, pueden ser un componente importante de las aplicaciones de tratamiento libre de células10.
La dopamina es una molécula cuya deficiencia en el cerebro es el rasgo característico de la enfermedad de Parkinson (EP), empeorando día a día11,12,13. Se sabe que la EP está asociada a la degeneración de las neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra del mesencéfalo y a la pérdida de las funciones de las neuronas motoras14,15. La muerte de las neuronas dopaminérgicas impide el suministro del neurotransmisor dopamina al cuerpo estriado cerebral. Esto, a su vez, da lugar a la aparición de síntomas específicos de la EP16. Estos síntomas de la EP son la bradicinesia, la inestabilidad postural, la rigidez y, especialmente, el temblor en reposo12,13. A pesar de que la EP fue descrita por primera vez hace más de dos siglos, los estudios para comprender la patología y etiología de la enfermedad aún están en curso y actualmente se acepta que la EP es una enfermedad sistémica compleja17. Se predice que se produce una deficiencia de dopamina, y se observan síntomas clínicos de EP cuando más del 80% de las neuronas se degeneran18. En el tratamiento de la enfermedad, se prefiere la suplementación incompleta con dopamina para reducir los síntomas motores. Los estudios in vivo han demostrado que la infusión directa de dopamina en el cerebro reduce significativamente los síntomas en animales19. Los precursores de dopamina como la L-DOPA (L-3,4-dihidroxifenilalanina) y los fármacos receptores de dopamina se utilizan en la clínica porque la infusión directa de dopamina en el cerebro no es posible en los seres humanos y la dopamina que entra en el sistema no puede atravesar la barrera hematoencefálica20. Este tipo de medicamentos pierden su eficacia con el tiempo. Sin embargo, todavía no existe un enfoque de tratamiento curativo para la EP, por lo que existe una gran necesidad de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas y modalidades de tratamiento para revelar la fisiopatología de la enfermedad y reducir el impacto de la EP en los pacientes.
Los estudios basados en exosomas han atraído recientemente la atención por recopilar información sobre enfoques terapéuticos y patologías de enfermedades del sistema nervioso. Se ha demostrado que los exosomas derivados de MSC reducen la inflamación en el daño nervioso y contribuyen a la regeneración neuronal21,22,23. Además, se ha reportado que los secretomas de exosomas derivados de MSC reducen la apoptosis al mostrar efectos neurotróficos y neuroprotectores, especialmente en las neuronas dopaminérgicas24,25. La investigación sobre plataformas en las que se utilizan exosomas como sistemas de administración de fármacos terapéuticos se ha acelerado intensamente en los últimos años. En numerosos estudios, se ha observado que los fármacos relevantes pueden encapsularse fácilmente en exosomas y administrarse de forma segura en células, tejidos y órganos diana26,27. Podrían utilizarse diferentes métodos, como la incubación, los ciclos de congelación/descongelación, la sonicación y la extrusión, para la carga de fármacos en los exosomas28.
La coincubación con exosomas o vesículas similares a exosomas permite encapsular pasivamente pequeñas moléculas lipofílicas en estos sistemas de administración28,29,30. En particular, varias moléculas como la curcumina31, la catalasa 30, la doxorrubicina 32 y el paclitaxel33 se cargaron eficazmente en los exosomas. Se ha observado que los exosomas que contienen catalasa, que tienen actividad antioxidante, se acumulan eficientemente en las neuronas y células microgliales del cerebro y exhiben fuertes actividades neuroprotectoras30. En el mismo estudio, se encontró que la saponina, añadida al complejo para aumentar la eficiencia de carga, aumenta el porcentaje de carga del fármaco durante la incubación30,34. Sin embargo, se necesitan más estudios para establecer los estándares para la carga de fármacos en los exosomas.
En este artículo se describe el desarrollo de un sistema de nanoportadores mediante la encapsulación de dopamina en exosomas que se aislaron de WJ-MSC. Se explican en detalle todos los pasos, incluido el cultivo de WJ-MSC, el aislamiento y la caracterización de exosomas, los experimentos de carga de fármacos, la caracterización de exosomas cargados de dopamina con diversas técnicas y el análisis de citotoxicidad in vitro .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td>Aisimo</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Aisimo</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates (Falcon, TPP microplates)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271004-1L</td>
			<td>Used for HPLC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>NUVE-OT 90L</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Cabin</td>
			<td>Hera Safe KS</td>
			<td></td>
			<td>Used for the cell culture process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td>Used in the exosome isolation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator with Safe Cell UV</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td>Used for the cell culture process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine hydrochloride H8502-10G</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8502-10G</td>
			<td>Used in exosome dopamine loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Mixture-F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBJ7249</td>
			<td>Used as cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum-FBS</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>FBS-16A</td>
			<td>It was used by adding to the cell culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U5386S-PE</td>
			<td>To store cells and the resulting exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MPR-215-PE</td>
			<td>Used to store cell culture and other materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance liquid chromatography-HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope- Primovert</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used to observe cells in cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT Assay</td>
			<td>Biomatik</td>
			<td></td>
			<td>Used to measure cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern panalytical</td>
			<td>Malvern panalytical</td>
			<td>Used for exosome characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-100 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Used in the exosome isolation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablet</td>
			<td>Biomatik</td>
			<td>43602</td>
			<td>In the preparation of the PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin Solution</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>PB-S</td>
			<td>It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Aid</td>
			<td>Isolab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance-Kern</td>
			<td>Kern-ABJ220-4NM</td>
			<td></td>
			<td>Used in the preparation of solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q500 Sonicator</td>
			<td>Qsonica, LLC</td>
			<td></td>
			<td>Used to digest exosomes in HPLC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47036-50G-F</td>
			<td>It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrostar-Nano-Spectrophotometry</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td>Used for MTT and drug release analyzes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPSS 22</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>statistical package program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vorteks-FinePCR</td>
			<td>FinePCR-FineVortex</td>
			<td></td>
			<td>Used to mix solutions homogeneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath 37 &#176;C-Senova</td>
			<td>Senova</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wharton&#8217;s jelly mesenchymal stem cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer</td>
			<td>Malvern Nano ZS</td>
			<td>Malvern Nano ZS</td>
			<td>Used for exosome characterization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulating and characterizing an exosome-based dopamine carrier system

Los exosomas de entre 40 y 200 nm de tamaño constituyen el subgrupo más pequeño de vesículas extracelulares. Estas vesículas bioactivas secretadas por las células desempeñan un papel activo en la carga y la comunicación intercelular. Los exosomas se encuentran principalmente en fluidos corporales como el plasma, el líquido cefalorraquídeo, la orina, la saliva, el líquido amniótico, el calostro, la leche materna, el líquido articular, el semen y el ácido pleural. Teniendo en cuenta el tamaño de los exosomas, se cree que pueden desempeñar un papel importante en las enfermedades del sistema nervioso central porque pueden atravesar la barrera hematoencefálica (BHE). Por lo tanto, este estudio tenía como objetivo desarrollar un sistema de nanoportadores basado en exosomas encapsulando la dopamina en exosomas aislados de células madre mesenquimales de gelatina de Wharton (WJ-MSC). Los exosomas que pasaron el proceso de caracterización fueron incubados con dopamina. Los exosomas cargados de dopamina se recaracterizaron al final de la incubación. Los exosomas cargados de dopamina se investigaron en ensayos de liberación de fármacos y citotoxicidad. Los resultados mostraron que la dopamina podía encapsularse con éxito dentro de los exosomas y que los exosomas cargados de dopamina no afectaban a la viabilidad de los fibroblastos.

Aislamiento y caracterización de exosomas Las células madre gelatinosas de Wharton se cultivan e incuban en un medio sin suero durante 48 h cuando el cultivo alcanza una densidad suficiente. Una vez finalizada la incubación, el sobrenadante se almacena a -20 °C. Los sobrenadantes recolectados se diluyen con PBS y se someten a ultracentrifugación (Figura 1). La solución obtenida se analiza mediante análisis NTA y DLS. Los exosomas se esterilizan pasando a través d...

Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System at JoVE.com

Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System

En este trabajo, nuestro objetivo era obtener una formulación mediante la carga de dopamina de los exosomas aislados de células madre de las células madre mesenquimales de la gelatina de Wharton. En este protocolo se describen el aislamiento y la caracterización de los exosomas, la carga del fármaco en los exosomas resultantes y la actividad citotóxica de la formulación desarrollada.

Formulación y caracterización de un sistema portador de dopamina basado en exosomas

Exosomes between 40 and 200 nm in size constitute the smallest subgroup of extracellular vesicles. These bioactive vesicles secreted by cells play an ...

Los exosomas pueden reaccionar a las vesículas secretadas por una célula de entre 14 y 200 nanómetros de tamaño, y separarse de la carga intracelular y la comunicación, que llega al subgrupo más pequeño de vesículas extracelulares. Los exosomas que se forman como resultado de la diferenciación del endosoma, se originan en la membrana celular. Las células madre se pueden aislar de diferentes fuentes como la médula ósea o los tejidos adiposos.pero las células madre secas de tejido adulto tienen un mayor potencial inmunogénico Contras del tamaño de los exosomas, se dice que ha desempeñado un papel importante en la enfermedad del sistema nervioso central porque puede pasar a través de la barrera hematoencefálica. Para comenzar, lave las células madre mesenquimales de gelatina de Wharton con semillas con cinco mililitros de PBS. A continuación, añada cinco mililitros de solución de tripsina EDTA antes de colocar el matraz en una incubadora.Después de la incubación, recoja las células y centrifugue a 1.500 G durante cinco minutos. A continuación, retire el sobrenadante y añada al tubo un mililitro de DMEM-F12 que contenga un 10% de FBS. Lave las células cultivadas con PBS.Después del lavado, agregue medio DMEM-F12 libre de suero a las células y colóquelo en la incubadora. Para aislar los exosomas, recoja el medio libre de suero y centrifugue a 300 G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Transfiera el sobrenadante a otro tubo y procéselo por centrifugación en serie a velocidades más altas.Después de la centrifugación final, retire lentamente el sobrenadante y disuelva el gránulo en un mililitro de PBS. Mezclar por vórtice y proceder a la ultracentrifugación a 110.000 G durante 70 minutos a cuatro grados centígrados. Añadir tres mililitros de PBS a la suspensión de exosomas recogida previamente por ultracentrifugación y esterilizar la suspensión diluida por filtración utilizando un filtro de 0,22 micras.A continuación, transfiera 500 microlitros de la suspensión de exosomas esterilizada a otro tubo. A continuación, de forma secuencial, agregue 500 microlitros de 0,5 miligramos por mililitro de solución de dopamina y saponina en la suspensión esterilizada. Después de la incubación, ultracentrifugar la suspensión.La muestra puede utilizarse para el análisis de NTA y DLS para caracterizar los exosomas cargados de dopamina o almacenarse a menos 20 grados centígrados hasta su uso posterior. En el análisis de NTA, se determinó que el tamaño medio de los exosomas derivados de la gelatina de Wharton era de 98 nanómetros y el de los exosomas cargados de dopamina de 110 nanómetros. El número de nanopartículas reveladas por los análisis de NTA y DLS fue consistente entre sí.El potencial zeta de los exosomas derivados de la gelatina de Wharton se midió en menos 15,7 y los exosomas cargados de dopamina en menos 17,6 milivoltios. El análisis por HPLC de los exosomas cargados de dopamina detectó el pico de dopamina a los 6,45 minutos. El perfil acumulativo de liberación del fármaco reveló que el 74,8% de la dopamina encapsulada se liberó de los exosomas en las primeras ocho horas.Se investigó la citotoxicidad de los exosomas libres y cargados de dopamina en fibroblastos. Aunque los exosomas cargados de dopamina no demostraron ningún efecto citotóxico, la saponina disminuyó la viabilidad de los fibroblastos. El ensayo MTT mostró una mayor viabilidad celular cuando los fibroblastos fueron tratados con los exosomas cargados de dopamina.La significación estadística de los resultados se evaluó mediante la realización de un anova de un factor. Además, se investigaron los efectos citotóxicos de diferentes concentraciones de exosomas libres en los fibroblastos. La viabilidad de los fibroblastos fue mayor con los exosomas libres a la concentración de 25 microlitros por mililitro.Es muy importante para el sistema nervioso central el tamaño de los pacientes, el papel que desempeña en procesos como la plasticidad, la respuesta neurológica, la comunicación de lado a lado y la neurogénesis en el cerebro. Además, gracias a la superficie de los exosomas, se ha observado que pueden interactuar con el fármaco de la célula diana y la actividad administrada durante la finalización del fármaco. Por primera vez en el estudio, desarrollamos una nueva formulación de fármaco encapsulando la dopamina en exosomas derivados de células madre.Propuso que esta formulación será muy prometedora para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Un sistema experimental para estudiar Mecanotransducción en células de pulmón fetal

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Investigación

Bioingeniería

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Los métodos para la caracterización de la Co-desarrollo de la biopelícula y Hábitat Heterogeneidad

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Diseño e implementación de un sistema automatizado de Iluminador, cultivo y sistema de muestreo para Aplicaciones microbiana Optogenética

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

Targeted membrana plasmática Entrega de cargo encapsulado hidrofóbico en un cristal líquido portador de nanopartículas

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Caracterización de la migración de la célula en tres dimensiones In Vitro herida ambientes

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Síntesis de bacteriófagos infecciosas en una e. coli -basan sistema de expresión libre

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Un Orbital agitación cultivo de células mamíferas en vasos en forma de O para producir agregados uniforme

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Una novedosa técnica quirúrgica como base para In Vivo parcial ingeniería hígado de rata

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

Visualización en tiempo real y análisis de la lesión de condrocitos debido a cargas mecánicas en explantes de cartílago murino intacta

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

Detección e identificación de pequeños péptidos dirigidos al receptor de factor de crecimiento de fibroblastos2 utilizando una biblioteca de péptidos de pantalla de fago

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...