Name: formulating and characterizing an exosome-based dopamine carrier system
Uploaded: 2022-04-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System at JoVE.com

Arbetet stöddes främst av forskningsfinansiering från Yıldız Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713).

OBS: Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla material och utrustning som används i detta protokoll.
1. Odling och kryokonservering av Whartons gelémesenkymala stamceller
<ol><li>Ta bort WJ-MSC (från ATCC) från frysen -80 °C. Frö cellerna i en kolv som innehåller DMEM-F12 medium kompletterat med 10 % fetalt bovint serum (FBS). Inkubera dem vid 37 °C i en inkubator som innehåller 5 % CO2 .</li>
	<li>Byt odlingsmedium varannan...

Exosomer är små membranvesiklar med dimensioner på 40-200 nm som utsöndras av de flesta celltyper, t.ex. MSC1. Exosomer kan möjliggöra kommunikation mellan celler och kan komma in i celler på olika sätt såsom endocytos, fagocytos, mikropinocytos, lipidmedierad internalisering och fusion33,44. Jämfört med andra nanobärarsystem ger lipiderna och kolesterolet som finns på exosomens yta förmågan att bära både hydrofila och hyd...

Exosomer, bioaktiva vesiklar med betydande egenskaper, varierar i storlek från 40 nm till 200 nm. Exosomer härstammar från cellmembranet och bildas på grund av frisättningen av endosomerna1. Dessa strukturer fungerar som cell-till-cell-kommunikatörer och interagerar med närliggande celler för att underlätta överföringen av aktiva molekyler. Exosomer kan isoleras från många olika källor. Dessa inkluderar kroppsvätskor som plasma, urin, cerebrospinalvätska, saliv samt cellinjer odlade under in vitro-förhållanden . Exosomer har en viktig roll i elimineringen av nervskador, tack vare de biomakromolekyler de innehåller, såsom lipider, proteiner och nukleinsyror2. Glia, som är stödcellerna i nervsystemet3, överför proteiner och mikro-RNA till nervcellernas axoner via exosomer4.
Lipider som bildar myelinskidan, som är ett karakteristiskt drag i nervledning, frisätts också från oligodendrocyter via exosomer 4,5. Exosomer är också involverade i processer som synaptisk plasticitet, neuronal stressrespons, cell-cell-kommunikation och neurogenes i hjärnan 6,7. Det faktum att exosomer har nanodimensioner gör det möjligt för dem att passera genom BBB. Det finns en speciell övergångsväg från interstitialvätskan till cerebrospinalvätskan efter att ha penetrerat detta membran8. Tack vare sina ytegenskaper kan exosomer interagera effektivt med målceller som ett system för läkemedelstillförsel och aktivt leverera de laddade läkemedlen.
På grund av uttrycket av olika vidhäftande proteiner (tetraspaniner och integriner) på exosomernas yta kan dessa extracellulära vesiklar lätt interagera och smälta samman med värdcellmembran9. Man tror att exosomer kan användas som ett system för läkemedelstillförsel, särskilt vid behandling av sjukdomar i centrala nervsystemet på grund av deras förmåga att tränga igenom BBB och deras ytegenskaper. Mesenkymala stamceller (MSC)-härledda exosomer har en lägre risk för immunavstötning jämfört med allogena cellterapier, och i detta avseende kan de vara en viktig komponent i cellfria behandlingsapplikationer10.
Dopamin är en molekyl vars brist i hjärnan är det karakteristiska kännetecknet för Parkinsons sjukdom (PD), som förvärras dag för dag11,12,13. Det är känt att PD är associerat med degeneration av dopaminerga neuroner i substantia nigra av mesencephalon och förlust av motorneuronfunktioner14,15. Döden av dopaminerga nervceller förhindrar tillförseln av signalsubstansen dopamin till hjärnans striatum. Detta resulterar i sin tur i uppkomsten av PD-specifika symtom16. Dessa symtom på PD är bradykinesi, postural instabilitet, stelhet och särskilt vilotremor12,13. Även om PD först beskrevs för mer än två århundraden sedan, pågår fortfarande studier för att förstå sjukdomens patologi och etiologi och det är för närvarande accepterat att PD är en komplex systemisk sjukdom17. Det förutspås att dopaminbrist uppstår, och kliniska PD-symtom observeras när mer än 80 % av neuronerna degenererar18. Vid behandling av sjukdomen är ofullständigt dopamintillskott att föredra för att minska motoriska symtom. In vivo-studier har visat att direkt infusion av dopamin i hjärnan avsevärt minskar symtomen hos djur19. Dopaminprekursorer som L-DOPA (L-3,4-dihydroxifenylalanin) och dopaminreceptorläkemedel används i kliniken eftersom den direkta infusionen av dopamin i hjärnan inte är möjlig hos människor och dopamin som kommer in i systemet inte kan passera BBB20. Dessa typer av läkemedel förlorar sin effektivitet med tiden. Det finns dock fortfarande ingen botande behandlingsmetod för Parkinsons sjukdom. Därför finns det ett stort behov av att utveckla nya terapeutiska strategier och behandlingsmetoder för att avslöja sjukdomens patofysiologi och minska effekterna av PD på patienter.
Exosombaserade studier har nyligen uppmärksammats för att samla in information om både terapeutiska metoder och patologier för sjukdomar i nervsystemet. MSC-härledda exosomer har visat sig minska inflammation i nervskador och bidra till neuronal regenerering21,22,23. Dessutom har det rapporterats att MSC-härledda exosomsekretomer minskar apoptos genom att visa neurotrofiska och neuroprotektiva effekter, särskilt på dopaminerga neuroner24,25. Forskningen om plattformar där exosomer används som terapeutiska system för läkemedelstillförsel har accelererat intensivt de senaste åren. I många studier har det observerats att relevanta läkemedel lätt kan kapslas in i exosomer och levereras säkert till målceller, vävnader och organ26,27. Olika metoder såsom inkubation, frysning/upptining cykler, ultraljudsbehandling och extrudering kan användas för läkemedelsladdning i exosomer28.
Sammanföring med exosomer eller exosomliknande vesiklar gör det möjligt för lipofila små molekyler att passivt kapslas in i dessa leveranssystem28,29,30. I synnerhet laddades olika molekyler som curcumin31, katalas 30, doxorubicin 32 och paklitaxel33 effektivt in i exosomer. Det har observerats att exosomer som innehåller katalas, som har antioxidantaktivitet, effektivt ackumulerades i neuroner och mikrogliaceller i hjärnan och uppvisade starka neuroprotektiva aktiviteter30. I samma studie visade det sig att saponin, som tillsattes i komplexet för att öka laddningseffektiviteten, ökade läkemedelsladdningsprocenten under inkubation30,34. Ytterligare studier behövs dock för att fastställa standarderna för läkemedelsladdning i exosomer.
Denna artikel beskriver utvecklingen av ett nanobärarsystem genom inkapsling av dopamin i exosomer som isolerades från WJ-MSC. Alla steg, inklusive odling av WJ-MSCs, isolering och karakterisering av exosomer, läkemedelsladdningsexperiment, karakterisering av dopaminladdade exosomer med olika tekniker och in vitro cytotoxicitetsanalys förklaras i detalj.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td>Aisimo</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Aisimo</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates (Falcon, TPP microplates)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271004-1L</td>
			<td>Used for HPLC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>NUVE-OT 90L</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Cabin</td>
			<td>Hera Safe KS</td>
			<td></td>
			<td>Used for the cell culture process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td>Used in the exosome isolation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator with Safe Cell UV</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td>Used for the cell culture process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine hydrochloride H8502-10G</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8502-10G</td>
			<td>Used in exosome dopamine loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Mixture-F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBJ7249</td>
			<td>Used as cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum-FBS</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>FBS-16A</td>
			<td>It was used by adding to the cell culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U5386S-PE</td>
			<td>To store cells and the resulting exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MPR-215-PE</td>
			<td>Used to store cell culture and other materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance liquid chromatography-HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope- Primovert</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used to observe cells in cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT Assay</td>
			<td>Biomatik</td>
			<td></td>
			<td>Used to measure cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern panalytical</td>
			<td>Malvern panalytical</td>
			<td>Used for exosome characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-100 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Used in the exosome isolation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablet</td>
			<td>Biomatik</td>
			<td>43602</td>
			<td>In the preparation of the PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin Solution</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>PB-S</td>
			<td>It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Aid</td>
			<td>Isolab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance-Kern</td>
			<td>Kern-ABJ220-4NM</td>
			<td></td>
			<td>Used in the preparation of solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q500 Sonicator</td>
			<td>Qsonica, LLC</td>
			<td></td>
			<td>Used to digest exosomes in HPLC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47036-50G-F</td>
			<td>It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrostar-Nano-Spectrophotometry</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td>Used for MTT and drug release analyzes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPSS 22</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>statistical package program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vorteks-FinePCR</td>
			<td>FinePCR-FineVortex</td>
			<td></td>
			<td>Used to mix solutions homogeneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath 37 &#176;C-Senova</td>
			<td>Senova</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wharton&#8217;s jelly mesenchymal stem cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer</td>
			<td>Malvern Nano ZS</td>
			<td>Malvern Nano ZS</td>
			<td>Used for exosome characterization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulating and characterizing an exosome-based dopamine carrier system

Exosomer mellan 40 och 200 nm i storlek utgör den minsta undergruppen av extracellulära vesiklar. Dessa bioaktiva vesiklar som utsöndras av celler spelar en aktiv roll i intercellulär last och kommunikation. Exosomer finns främst i kroppsvätskor som plasma, cerebrospinalvätska, urin, saliv, fostervatten, råmjölk, bröstmjölk, ledvätska, sperma och pleurasyra. Med tanke på exosomernas storlek tror man att de kan spela en viktig roll vid sjukdomar i centrala nervsystemet eftersom de kan passera genom blod-hjärnbarriären (BBB). Därför syftade denna studie till att utveckla ett exosombaserat nanobärarsystem genom att kapsla in dopamin i exosomer isolerade från Whartons gelémesenkymala stamceller (WJ-MSC). Exosomer som klarade karakteriseringsprocessen inkuberades med dopamin. De dopaminladdade exosomerna omkarakteriserades i slutet av inkubationen. Dopaminladdade exosomer undersöktes i läkemedelsfrisättnings- och cytotoxicitetsanalyser. Resultaten visade att dopamin framgångsrikt kunde kapslas in i exosomerna och att de dopaminladdade exosomerna inte påverkade fibroblasternas viabilitet.

Exosomisolering och karakterisering Wharton geléstamceller odlas och inkuberas i ett serumfritt medium i 48 timmar när kulturen når tillräcklig densitet. Efter inkubationens slut förvaras supernatanten vid -20 °C. De uppsamlade supernatanterna späds med PBS och genomgår ultracentrifugering (figur 1). Den erhållna lösningen analyseras med NTA- och DLS-analyser. Exosomerna steriliseras genom att passera genom ett 0,22 μm filter. Den genomsnittliga storleken på ...

Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System at JoVE.com

Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System

Här syftade vi till att erhålla en formulering genom dopaminladdning av de isolerade exosomerna av stamceller från Whartons gelémesenkymala stamceller. Exosomisolering och karakterisering, läkemedelsladdning i de resulterande exosomerna och den cytotoxiska aktiviteten hos den utvecklade formuleringen beskrivs i detta protokoll.

Formulering och karakterisering av ett exosombaserat dopaminbärarsystem

Exosomes between 40 and 200 nm in size constitute the smallest subgroup of extracellular vesicles. These bioactive vesicles secreted by cells play an ...

Exosomer kan reagera på vesiklar som utsöndras av en cell mellan 14 och 200 nanometer i storlek och splittras från den intracellulära lasten och kommunikationen, som kommer till den minsta undergruppen av extracellulära vesiklar. Exosomer som bildas som ett resultat av differentiering av endosomen härstammar från cellmembranet. Stamcellerna kan isoleras från olika källor som benmärg eller fettvävnad.men vuxna vävnadstorkade stamceller har högre immunogen potential Nackdelar med storleken på exosomer, det berättas att det har gjort en viktig roll i sjukdomar i centrala nervsystemet eftersom det kan passera igenom till blod-hjärnbarriären. Till att börja med, tvätta de fröade Whartons gelémesenkymala stamcellerna med fem milliliter PBS. Tillsätt sedan fem milliliter trypsin EDTA-lösning innan kolven placeras i en inkubator.Efter inkubationen samlas cellerna upp och centrifugeras vid 1 500 g i fem minuter. Ta sedan bort supernatanten och tillsätt en milliliter DMEM-F12 som innehåller 10%FBS till röret. Tvätta odlade celler med PBS.Efter tvätt, tillsätt serumfritt DMEM-F12-medium till cellerna och placera det i inkubatorn. För att isolera exosomerna, samla upp det serumfria mediet och centrifugera vid 300 G vid fyra grader Celsius i 10 minuter. Överför supernatanten till ett annat rör och bearbeta det genom seriell centrifugering med högre hastigheter.Efter den sista centrifugeringen, ta långsamt bort supernatanten och lös upp pelleten i en milliliter PBS. Blanda genom virvel och fortsätt med ultracentrifugering vid 110 000 G i 70 minuter vid fyra grader Celsius. Tillsätt tre milliliter PBS till exosomsuspensionen som samlats upp tidigare genom ultracentrifugering och sterilisera den utspädda suspensionen genom filtrering med ett 0,22 mikronfilter.Överför sedan 500 mikroliter av den steriliserade exosomsuspensionen till ett annat rör. Tillsätt sedan 500 mikroliter 0,5 milligram per milliliter dopaminlösning och saponin i den steriliserade suspensionen. Efter inkubationen ultracentrifugerar du suspensionen.Provet kan antingen användas för NTA- och DLS-analys för att karakterisera dopaminladdade exosomer eller förvaras vid minus 20 grader Celsius tills vidare användning. I NTA-analysen bestämdes den genomsnittliga storleken på Wharton-geléhärledda exosomer till 98 nanometer och dopaminladdade exosomer till 110 nanometer. Antalet nanopartiklar som avslöjades av NTA- och DLS-analyser överensstämde med varandra.Zetapotentialen för Wharton-geléhärledda exosomer uppmättes till minus 15,7 och dopaminladdade exosomer som minus 17,6 millivolt. HPLC-analysen av de dopaminladdade exosomerna detekterade toppen för dopamin vid 6,45 minuter. Den kumulativa frisättningsprofilen visade att 74,8 % av det inkapslade dopaminet frigjordes från exosomerna inom de första åtta timmarna.Cytotoxiciteten hos de dopaminladdade och fria exosomerna på fibroblaster undersöktes. Även om de dopaminladdade exosomerna inte uppvisade några cytotoxiska effekter, minskade saponin fibroblastviabiliteten. MTT-analysen visade ökad cellviabilitet när fibroblasterna behandlades med de dopaminladdade exosomerna.Den statistiska signifikansen av resultaten utvärderades genom att utföra envägsanova. Dessutom undersöktes de cytotoxiska effekterna av olika koncentrationer av fria exosomer på fibroblasterna. Fibroblastviabiliteten var högre med fria exosomer vid en koncentration av 25 mikroliter per milliliter.Det är verkligen viktigt för det centrala nervsystemet är patientstorlekarna, spelar roll i processer som plasticitet, neurosvar, kommunikation från sida till sida och neurogenes i hjärnan. Dessutom, tack vare ytan av exosomer, står det, har observerats att de kan interagera med målcellläkemedlet och aktiviteten som levereras under läkemedlet är en komplettering. För första gången i studien utvecklade vi en ny läkemedelsformulering genom att kapsla in dopamin i stamcellshärledda exosomer.Han föreslog att denna formulering kommer att vara så lovande för behandling av Parkinsons sjukdom.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Ett experimentellt system för att studera Mechanotransduction i fetal lunga Celler

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Metoder för att karakterisera Co-utveckling Biofilm och Habitat Heterogen

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Design och implementering av en automatisk Lysande, Odling och provtagningssystemet för Microbial optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

Riktade Plasma Membrane Leverans av en hydrofob Cargo inkapslad i en Liquid Crystal nanopartiklar Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Karaktärisera cellmigration inom tredimensionell In Vitro sår miljöer

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Syntesen av infektiös bakteriofager i en E. coli -baserade Cell-free uttryck systemet

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

En Orbital skakar kultur av däggdjursceller i O-formade fartyg att producera enhetliga aggregat

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

En ny kirurgisk teknik som en grund för In Vivo delvis lever Engineering i råtta

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

Realtid visualisering och analys av Chondrocyte skada på grund av mekanisk belastning i helt intakt murina brosk bladsticklingar

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

Screening och identifiering av små peptider riktade fibroblast tillväxtfaktor Receptor2 använda en phage display peptid bibliotek

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...