Name: an integrated workflow of identification and quantification on fdr control-based untargeted metabolome
Uploaded: 2022-09-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Workflow of Identification and Quantification on FDR Control-Based Untargeted Metabolome at JoVE.com

Dette arbejde understøttes af National Key Research and Development Program (2018YFC0910200/2017YFA0505001) og Guangdong Key R&D Program (2019B020226001).

1. Forbered metabolomics datasæt til analyse
BEMÆRK: I denne demonstration bruger vi metabolomics datasæt uden QC-prøve. Der er behov for data for sags- og kontrolgrupper. Til demonstration bruger vi et offentligt datasæt i GNPS-database27.
<ol><li>Gå til websiden https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp. Klik på Gennemse datasæt.</li>
	<li>Søg på nøgleordet "msv000084112" i kolonnen Titel . ...

<ol>
	<li>Misra, B. B., Fahrmann, J. F., Grapov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+emerging+metabolomic+tools+and+resources:+2015-2016.">Review of emerging metabolomic tools and resources: 2015-2016.</a> Electrophoresis. 38 (18), 2257-2274 (2017).</li><li>Idle, J. R., Gonzalez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics.">Metabolomics.</a> Cell Metabolism. 6 (5), 348-351 (2007).</li><li>Fiehn, O., Town, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+&#8212;+the+link+between+genotypes+and+phenotypes.">Metabolomics &#8212; the link between genotypes and phenotypes.</a> Functional Genomics. , 155-171 (2002).</li><li>Town, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Functional Genomics. , (2002).</li><li>Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+metabolomics.">Mass spectrometry-based metabolomics.</a> Mass Spectrometry Reviews. 26 (1), 51-78 (2007).</li><li>Vinayavekhin, N., Saghatelian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+metabolomics.">Untargeted metabolomics.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 1-24 (2010).</li><li>Chaleckis, R., Meister, I., Zhang, P., Wheelock, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges,+progress+and+promises+of+metabolite+annotation+for+LC-MS-based+metabolomics.">Challenges, progress and promises of metabolite annotation for LC-MS-based metabolomics.</a> Current Opinion in Biotechnology. 55, 44-50 (2019).</li><li>Palmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDR-controlled+metabolite+annotation+for+high-resolution+imaging+mass+spectrometry.">FDR-controlled metabolite annotation for high-resolution imaging mass spectrometry.</a> Nature Methods. 14 (1), 57-60 (2017).</li><li>Scheubert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+estimation+for+large+scale+metabolomics+annotations+by+spectral+matching.">Significance estimation for large scale metabolomics annotations by spectral matching.</a> Nature Communications. 8 (1), 1494 (2017).</li><li>Schrimpe-Rutledge, A. C., Codreanu, S. G., Sherrod, S. D., McLean, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+metabolomics+strategies-challenges+and+emerging+directions.">Untargeted metabolomics strategies-challenges and emerging directions.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (12), 1897-1905 (2016).</li><li>Bla&#382;enovi&#263;, I., Kind, T., Ji, J., Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+and+approaches+for+compound+identification+of+LC-MS/MS+data+in+metabolomics.">Software tools and approaches for compound identification of LC-MS/MS data in metabolomics.</a> Metabolites. 8 (2), (2018).</li><li>Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MZmine:+toolbox+for+processing+and+visualization+of+mass+spectrometry+based+molecular+profile+data.">MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data.</a> Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).</li><li>Tsugawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+rearrangement+rules:+computational+MS/MS+fragmentation+and+structure+elucidation+using+MS-FINDER+software.">Hydrogen rearrangement rules: computational MS/MS fragmentation and structure elucidation using MS-FINDER software.</a> Analytical chemistry. 88 (16), 7946-7958 (2016).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFM-ID+4.0:+More+accurate+ESI-MS/MS+spectral+prediction+and+compound+identification.">CFM-ID 4.0: More accurate ESI-MS/MS spectral prediction and compound identification.</a> Analytical Chemistry. 93 (34), 11692-11700 (2021).</li><li>Ruttkies, C., Schymanski, E. L., Wolf, S., Hollender, J., Neumann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetFrag+relaunched:+incorporating+strategies+beyond+in+silico+fragmentation.">MetFrag relaunched: incorporating strategies beyond in silico fragmentation.</a> Journal of Cheminformatics. 8, 3 (2016).</li><li>Delabriere, A., Warmer, P., Brennsteiner, V., Zamboni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAW:+A+scalable+and+self-optimizing+processing+workflow+for+untargeted+LC-MS.">SLAW: A scalable and self-optimizing processing workflow for untargeted LC-MS.</a> Analytical chemistry. 93 (45), 15024-15032 (2021).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-decoy-based+false+discovery+rate+estimation+for+large-scale+metabolite+identification.">Target-decoy-based false discovery rate estimation for large-scale metabolite identification.</a> Journal of Proteome Research. 17 (7), 2328-2334 (2018).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XY-Meta:+a+high-efficiency+search+engine+for+large-scale+metabolome+annotation+with+accurate+FDR+estimation.">XY-Meta: a high-efficiency search engine for large-scale metabolome annotation with accurate FDR estimation.</a> Analytical Chemistry. 92 (8), 5701-5707 (2020).</li><li>Wen, B., Mei, Z., Zeng, C., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=metaX:+a+flexible+and+comprehensive+software+for+processing+metabolomics+data.">metaX: a flexible and comprehensive software for processing metabolomics data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 183 (2017).</li><li>Aberg, K. M., Torgrip, R. J. O., Kolmert, J., Schuppe-Koistinen, I., Lindberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+detection+and+alignment+of+hyphenated+chromatographic-mass+spectrometric+data.+Extraction+of+pure+ion+chromatograms+using+Kalman+tracking.">Feature detection and alignment of hyphenated chromatographic-mass spectrometric data. Extraction of pure ion chromatograms using Kalman tracking.</a> Journal of Chromatography. A. 1192 (1), 139-146 (2008).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+the+batch+effect+issue+for+LC/MS+metabolomics+data+in+data+preprocessing.">Addressing the batch effect issue for LC/MS metabolomics data in data preprocessing.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13856 (2020).</li><li>Han, W., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+and+minimizing+batch+effects+in+metabolomics.">Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics.</a> Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).</li><li>Fei, F., Bowdish, D. M. E., McCarry, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+and+simultaneous+coverage+of+lipid+and+polar+metabolites+for+endogenous+cellular+metabolomics+using+HILIC-TOF-MS.">Comprehensive and simultaneous coverage of lipid and polar metabolites for endogenous cellular metabolomics using HILIC-TOF-MS.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (15), 3723-3733 (2014).</li><li>Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XCMS:+processing+mass+spectrometry+data+for+metabolite+profiling+using+nonlinear+peak+alignment,+matching,+and+identification.">XCMS: processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification.</a> Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).</li><li>Giacomoni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Workflow4Metabolomics:+a+collaborative+research+infrastructure+for+computational+metabolomics.">Workflow4Metabolomics: a collaborative research infrastructure for computational metabolomics.</a> Bioinformatics. 31 (9), 1493-1495 (2015).</li><li>Chang, H. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iMet-Q:+A+user-friendly+tool+for+label-free+metabolomics+quantitation+using+dynamic+peak-width+determination.">iMet-Q: A user-friendly tool for label-free metabolomics quantitation using dynamic peak-width determination.</a> PloS One. 11 (1), 0146112 (2016).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking.">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).</li><li>Schmid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+identity+molecular+networking+for+mass+spectrometry-based+metabolomics+in+the+GNPS+environment.">Ion identity molecular networking for mass spectrometry-based metabolomics in the GNPS environment.</a> Nature Communications. 12 (1), 3832 (2021).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).</li><li>Johnson, S. R., Lange, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-access+metabolomics+databases+for+natural+product+research:+present+capabilities+and+future+potential.">Open-access metabolomics databases for natural product research: present capabilities and future potential.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 22 (2015).</li><li>Horai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MassBank:+a+public+repository+for+sharing+mass+spectral+data+for+life+sciences.">MassBank: a public repository for sharing mass spectral data for life sciences.</a> Journal of Mass Spectrometry: JMS. 45 (7), 703-714 (2010).</li><li>Rawlinson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+clustering+of+MS/MS+spectra+from+the+firefly+metabolome+identifies+new+lucibufagin+compounds.">Hierarchical clustering of MS/MS spectra from the firefly metabolome identifies new lucibufagin compounds.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6043 (2020).</li></ol>

FDR-kontrollen af ikke-målrettede metabolitter har været en stor udfordring. Her demonstrerede vi en komplet pipeline af storstilet ikke-målrettet metabolomics-analyse (kvalitativ og kvantitativ) med FDR-kontrol. Dette reducerer effektivt de falske positiver, som er meget almindelige i MS-analyse.
Forberedelse af et passende referencespektralbibliotek til din undersøgelse er et centralt punkt. En vellykket og følsom MS/MS-identifikation kræver ikke kun korrekte matchningsalgoritmer, men ...

Metabolitter spiller vigtige roller i biologiske processer. Metabolitter er ofte regulatorer af forskellige processer som energioverførsel, hormonreguleringer, regulering af neurotransmittere, cellulær kommunikation og protein posttranslationelle modifikationer osv. 1,2,3,4. Ikke-målrettet metabolomics giver et globalt overblik over talrige metabolitter 5,6. Med fremskridt inden for massespektrometri og kromatografiteknologier er gennemstrømningen af metabolom MS / MS-spektre hurtigt stigende i de senere år 7,8,9,10,11. For at identificere metabolitter fra disse enorme datasæt blev der udviklet forskellige annotationssoftware11, såsom MZmine12, MS-FINDER13, CFM-ID14, MetFrag15 og SLAW16. Disse identifikationer indeholder dog ofte mange falske positiver. Årsagerne omfatter: (1) MS/MS-spektrene indeholder tilfældig støj, som kan vildlede peak matching. (2) Isomerer og forskelle i fragmenteringsenergier forårsager flere spektre fingeraftryk og øger dermed volumenet af referencebiblioteket. (3) Referencebibliotekernes kvalitet varierer. En ordentlig standard til at opbygge et godt referencespektralbibliotek er nødvendig. Derfor er en systematisk falsk opdagelseshastighed (FDR) kontrol for ikke-målrettet metabolomics afgørende for funktionel metabolomforskning 7,8,9,17.
Både Empirical Bayes-tilgangen og Target-Decoy-strategien tacklede FDR-kontrolproblemet generelt. Kerstin Scheubert et al. viste, at Target-Decoy-strategien på lokkedatabase genereret fra fragmenteringstræbaseret metode er den bedste metode til FDR-kontrol9. Xusheng Wang et al. designede en metode til lokkemadsgenerering baseret på oktetreglen i kemi og forbedrede præcisionen af FDR-estimering17. Spektralbiblioteket til generering af lokkedatabase blev demonstreret for bedre ydeevne18. Her forbedrede vi den spektrale biblioteksbaserede metode og udviklede en software kaldet XY-Meta19 , der yderligere kan forbedre FDR-estimeringens præcision. Det bruger det eksisterende referencespektralbibliotek til at generere et lokkebibliotek til FDR-kontrollen under Target-Decoy-ordningen. XY-Meta understøtter sine egne spektrematchnings- og cosinuslighedsalgoritmer. Det tillader konventionelle søge- og iterative søgetilstande. I trinnet med FDR-vurdering understøtter den Target-Decoy-sammenkædet tilstand og adskilt tilstand. For bedre fleksibilitet accepterer XY-Meta eksterne lokkebiblioteker.
Peak-detektion og kvantificering af metabolitter er også et vigtigt trin i ikke-målrettet metabolomanalyse. Peak detektion er den vigtigste metode til metabolomidentifikation. Generelt blev nøjagtigheden af maksimal påvisning af metabolitter påvirket af flere faktorer, såsom støjsignaler fra massespektrometri, lav forekomst af metabolitter, forurenende stoffer og nedbrydningsprodukter af metabolitter20. Når antallet af prøver af er for stort, eller væskekromatografikolonnen blev erstattet i forsøg med ikke-målrettet metabolom, kan der forekomme bemærkelsesværdige batcheffekter, hvilket er en stor udfordring for metabolomkvantificering 21,22,23. I øjeblikket kan software som XCMS24, Workflow4Metabolomic25, iMet-Q26 og metaX19 udføre peak detection og kvantificering af ikke-målrettet metabolom, men vi foreslår, at pipelinen af metaX er mere komplet og lettere at bruge. Her demonstrerer vi processen med identifikation og FDR-kontrol for et offentligt tilgængeligt datasæt msv000084112 ved hjælp af XY-Meta og peak-detektion og kvantificering af metabolitter ved hjælp af metaX. Denne arbejdsproces kræver kun to grupper, og hver gruppe skal bruge mindst to eksempler. MS/MS-spektredata er nødvendige, uanset massespektrometerplatform, ioniseringstilstand, opladningstilstand og prøvetype, og kan understøtte prøvebaseret normalisering og peak-baseret normalisering. Efter dette eksempel kan forskere udføre metabolomics identifikation og kvantificering på en let at håndtere måde. Brug af denne pipeline kræver R-programmeringskapacitet. For at hjælpe forskeren uden nogen programmeringskendskab udviklede vi også en cloud-analyseplatform til metabolomics-analyse. Vi demonstrerede denne cloud-analyseplatform i Supplementary Material 5.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>GNPS</td>
			<td>open source</td>
			<td>n/a</td>
			<td>https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY-Meta</td>
			<td>open source</td>
			<td>n/a</td>
			<td>https://github.com/DLI-ShenZhen/XY-Meta</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>metaX</td>
			<td>open source</td>
			<td>n/a</td>
			<td>https://github.com/wenbostar/metaX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoWizard</td>
			<td>Free Download</td>
			<td>3.0.22116.18c918b-x86_64</td>
			<td>https://proteowizard.sourceforge.io/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHI.Client</td>
			<td>Free Download</td>
			<td>ndp48-x86-x64-allos-enu</td>
			<td>http://www.chi-biotech.com/technology.html?ty=ypt</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an integrated workflow of identification and quantification on fdr control-based untargeted metabolome

Ikke-målrettede metabolomics teknikker er blevet udbredt i de senere år. Den hurtigt stigende gennemstrømning og antallet af prøver skaber imidlertid en enorm mængde spektre, hvilket giver udfordringer for kvalitetskontrol af massespektrometrispektrene. For at reducere de falske positiver er falsk opdagelsesrate (FDR) kvalitetskontrol nødvendig. For nylig udviklede vi en software til FDR-kontrol af ikke-målrettet metabolomidentifikation, der er baseret på en Target-Decoy-strategi ved navn XY-Meta. Her demonstrerede vi en komplet analysepipeline, der integrerer XY-Meta og metaX sammen. Denne protokol viser, hvordan man bruger XY-meta til at generere en lokkedatabase fra en eksisterende referencedatabase og udføre FDR-kontrol ved hjælp af Target-Decoy-strategien til storstilet metabolomidentifikation på et open-access datasæt. Differentialanalysen og metabolitannoteringen blev udført efter at have kørt metaX for påvisning og kvantificering af metabolitter. For at hjælpe flere forskere udviklede vi også en brugervenlig cloud-baseret analyseplatform til disse analyser uden behov for bioinformatikfærdigheder eller computersprog.

De rå data for msv000084112 blev konverteret af msconvert.exe og genererede mgf-filer (Supplementary Material S6).
XY-Meta genereret GNPS-NIST14-MATCHES_Decoy.mgf fil under /database mappe. Dette er lokkebiblioteket genereret fra det originale referencespektralbibliotek GNPS-NIST14-MATCHES.mgf. Dette lokkebibliotek kan genbruges. Når du genbruger dette lokkebibliotek, skal brugeren indstille decoy_pattern som 1 i parameter.default-filen og indstille decoyinput som den absolu...

Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Workflow of Identification and Quantification on FDR Control-Based Untargeted Metabolome at JoVE.com

An Integrated Workflow of Identification and Quantification on FDR Control-Based Untargeted Metabolome

Vi konstruerede en ikke-målrettet metabolomisk arbejdsgang, der integrerede XY-Meta og metaX sammen. I denne protokol viste vi, hvordan man bruger XY-Meta til at generere et lokkespektralbibliotek fra open access-spektrereference, og udførte derefter FDR-kontrol og brugte metaX til at kvantificere metabolitterne efter at have identificeret metabolomics-spektrene.

En integreret arbejdsgang med identifikation og kvantificering på FDR-kontrolbaseret ikke-målrettet metabolom

Untargeted metabolomics techniques are being widely used in recent years. However, the rapidly increasing throughput and number of samples create an ...

Denne protokol muliggør kvalitativ og kvantitativ analyse af ikke-målrettet metabolom baseret på FDR-kvalitetskontrol, som effektivt reducerer de falske positiver ved metabolitidentifikation. Denne arbejdsgang integrerer XY-Meta, der bruger mål-lokkestrategien til at evaluere FDR mere præcist til metabolomidentifikation i det kvalitative analysemodul. Denne foranstaltning kan effektivt filtrere falske positive resultater af ikke-målrettet metabolomidentifikation, hvilket forbedrer robustheden af at opdage biomarkører eller nøglemolekyler.Vi forventer, at forskere kan forstå og mestre mål-lokkestrategien for FDR-kontrol og bør forsøge at strengt køre denne pipeline flere gange med standardparametrene i protokollen. Begynd med at gå til GNPS-databasens webside, og klik på Gennemse datasæt. Søg efter nøgleordet i titelkolonnen, og klik derefter på datasættets id-nummer.Download datasættet ved hjælp af FTP, og gem de rå data i den respektive mappe. For at konvertere formatet af rå data skal du først installere ProteoWizard-softwaren. Under ProteoWizard-installationsstien skal du skrive msconvert.exe, efterfulgt af de specifikke parametre til at konvertere det rå dataformat til mzXML-format. Igen ved hjælp af msconvert. exe konvertere disse data til MGF format og gemme dem i MGF mappe.For at forberede referencespektralbiblioteket for metabolitterne skal du gå til GNPS-websiden. Søg på nøgleordet NIST, klik på vis for detaljerne og download biblioteket. Gem biblioteket i databasemappen.Download XY-Meta-programmet. Find parameterkonfigurationsfilen under konfigurationsmappen, og skift dens indhold som beskrevet i tekstprotokollen. Indstil typen af addukter som en liste i adduktmappen.Udfør metabolitidentifikation og falsk opdagelseshastighedskontrol ved hjælp af kommandoen XY-Meta.exe. Download og installer metaX-softwarepakken. Rediger derefter eksempellisten.txt-fil for at angive prøven og dens tilsvarende massespektrometridata som beskrevet i tekstprotokollen. Brug R-filen, der følger med tekstprotokollen, til at køre scriptet til kvantificering af Mock- og vildtypegrupper ved hjælp af metaX-softwaren. Kontroller outputmappen, hvor resultaterne af den kvantitative analyse er gemt, såsom PCA-plottet.Derefter skal du ændre parametrene i R-scriptet for at kommentere toppe i kvalitativ og kvantitativ analyse ved hjælp af metabolitidentifikationer for at integrere både resultaterne og køre R-scriptet. Boksdiagrammer for kvantificerede metabolitter viste, at den generelle fordeling af raske prøver og sygdomsprøver var den samme med lave udsving i middelværdierne. Kun 3,39 % af metabolitterne havde mere end 30 % af de manglende værdier.Principkomponentanalysediagram af prøverne fra begge grupper viste, at metaX bemærkelsesværdigt øgede andelen af metabolitter med CV mindre end 0,3. Et Venn-diagram over differentielt påviste metabolitter fra tre statistiske testmetoder afslørede 119 almindelige metabolitter. Retentionstid og masse efter ladningsfordeling af alle annoterede metabolitter blev plottet med en falsk opdagelseshastighed på mindre end 0,01, hvilket viste seks signifikante og differentielt påviste metabolitter.Det er vigtigt at begrænse tiden for test af arbejdsgange. Husk ikke at vælge for mange prøver til analyse og holde mindst to prøver i hver gruppe. Denne teknik muliggør kvalitetskontrol af metaboliseret identifikation fra datauafhængige indsamlingsdata, der konstruerer et mere robust referencespektrumspektralbibliotek ved hjælp af spektrummatchningsresultaterne baseret på FDR-kontrol.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En simpel metode til High Throughput kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifikation af Cyclin-afhængig Kinase 1 specifikke fosforylering websteder ved en In Vitro -Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Kvantificering af hypopigmentering aktivitet In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Kvantificering af coenzym A i celler og væv

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Label-fri Immunoprecipitation massespektrometri workflow for storstilet nuklear Interactome profilering

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

En integreret Raman spektroskopi og massespektrometri platform til at studere enkelt-celle stof optagelse, metabolisme, og effekter

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Umålrettet flydende kromatografi-massespektrometri-baserede metabolomiske analyse af hvedekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Evaluating the Effect of Pesticides on the Larvae of the Solitary Bees

Evaluering af pesticidernes virkning på larverne fra de ensomme bier

Current ecological risk assessments of pesticides on pollinators have primarily considered only laboratory conditions. For the larvae of solitary bees, ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Kvantificering af subcellulær glykogenfordeling i skeletmuskelfibre ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...