Name: an integrated workflow of identification and quantification on fdr control-based untargeted metabolome
Uploaded: 2022-09-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Workflow of Identification and Quantification on FDR Control-Based Untargeted Metabolome at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית למפתחות (2018YFC0910200/2017YFA0505001) ותוכנית המו"פ של מפתח גואנגדונג (2019B020226001).

1. הכינו מערכי נתונים של מטבוליקה לניתוח
הערה: בהדגמה זו, אנו משתמשים בערכות נתונים מטבוליות ללא דגימת QC. יש צורך בנתונים עבור מקרים וקבוצות ביקורת. לצורך הדגמה, אנו משתמשים במערך נתונים ציבורי במסד נתוניםGNPS 27.
<ol><li>עבור אל דף האינטרנט https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe...

<ol>
	<li>Misra, B. B., Fahrmann, J. F., Grapov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+emerging+metabolomic+tools+and+resources:+2015-2016.">Review of emerging metabolomic tools and resources: 2015-2016.</a> Electrophoresis. 38 (18), 2257-2274 (2017).</li><li>Idle, J. R., Gonzalez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics.">Metabolomics.</a> Cell Metabolism. 6 (5), 348-351 (2007).</li><li>Fiehn, O., Town, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+&#8212;+the+link+between+genotypes+and+phenotypes.">Metabolomics &#8212; the link between genotypes and phenotypes.</a> Functional Genomics. , 155-171 (2002).</li><li>Town, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Functional Genomics. , (2002).</li><li>Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+metabolomics.">Mass spectrometry-based metabolomics.</a> Mass Spectrometry Reviews. 26 (1), 51-78 (2007).</li><li>Vinayavekhin, N., Saghatelian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+metabolomics.">Untargeted metabolomics.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 1-24 (2010).</li><li>Chaleckis, R., Meister, I., Zhang, P., Wheelock, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges,+progress+and+promises+of+metabolite+annotation+for+LC-MS-based+metabolomics.">Challenges, progress and promises of metabolite annotation for LC-MS-based metabolomics.</a> Current Opinion in Biotechnology. 55, 44-50 (2019).</li><li>Palmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDR-controlled+metabolite+annotation+for+high-resolution+imaging+mass+spectrometry.">FDR-controlled metabolite annotation for high-resolution imaging mass spectrometry.</a> Nature Methods. 14 (1), 57-60 (2017).</li><li>Scheubert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+estimation+for+large+scale+metabolomics+annotations+by+spectral+matching.">Significance estimation for large scale metabolomics annotations by spectral matching.</a> Nature Communications. 8 (1), 1494 (2017).</li><li>Schrimpe-Rutledge, A. C., Codreanu, S. G., Sherrod, S. D., McLean, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+metabolomics+strategies-challenges+and+emerging+directions.">Untargeted metabolomics strategies-challenges and emerging directions.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (12), 1897-1905 (2016).</li><li>Bla&#382;enovi&#263;, I., Kind, T., Ji, J., Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+and+approaches+for+compound+identification+of+LC-MS/MS+data+in+metabolomics.">Software tools and approaches for compound identification of LC-MS/MS data in metabolomics.</a> Metabolites. 8 (2), (2018).</li><li>Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MZmine:+toolbox+for+processing+and+visualization+of+mass+spectrometry+based+molecular+profile+data.">MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data.</a> Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).</li><li>Tsugawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+rearrangement+rules:+computational+MS/MS+fragmentation+and+structure+elucidation+using+MS-FINDER+software.">Hydrogen rearrangement rules: computational MS/MS fragmentation and structure elucidation using MS-FINDER software.</a> Analytical chemistry. 88 (16), 7946-7958 (2016).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFM-ID+4.0:+More+accurate+ESI-MS/MS+spectral+prediction+and+compound+identification.">CFM-ID 4.0: More accurate ESI-MS/MS spectral prediction and compound identification.</a> Analytical Chemistry. 93 (34), 11692-11700 (2021).</li><li>Ruttkies, C., Schymanski, E. L., Wolf, S., Hollender, J., Neumann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetFrag+relaunched:+incorporating+strategies+beyond+in+silico+fragmentation.">MetFrag relaunched: incorporating strategies beyond in silico fragmentation.</a> Journal of Cheminformatics. 8, 3 (2016).</li><li>Delabriere, A., Warmer, P., Brennsteiner, V., Zamboni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAW:+A+scalable+and+self-optimizing+processing+workflow+for+untargeted+LC-MS.">SLAW: A scalable and self-optimizing processing workflow for untargeted LC-MS.</a> Analytical chemistry. 93 (45), 15024-15032 (2021).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-decoy-based+false+discovery+rate+estimation+for+large-scale+metabolite+identification.">Target-decoy-based false discovery rate estimation for large-scale metabolite identification.</a> Journal of Proteome Research. 17 (7), 2328-2334 (2018).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XY-Meta:+a+high-efficiency+search+engine+for+large-scale+metabolome+annotation+with+accurate+FDR+estimation.">XY-Meta: a high-efficiency search engine for large-scale metabolome annotation with accurate FDR estimation.</a> Analytical Chemistry. 92 (8), 5701-5707 (2020).</li><li>Wen, B., Mei, Z., Zeng, C., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=metaX:+a+flexible+and+comprehensive+software+for+processing+metabolomics+data.">metaX: a flexible and comprehensive software for processing metabolomics data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 183 (2017).</li><li>Aberg, K. M., Torgrip, R. J. O., Kolmert, J., Schuppe-Koistinen, I., Lindberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+detection+and+alignment+of+hyphenated+chromatographic-mass+spectrometric+data.+Extraction+of+pure+ion+chromatograms+using+Kalman+tracking.">Feature detection and alignment of hyphenated chromatographic-mass spectrometric data. Extraction of pure ion chromatograms using Kalman tracking.</a> Journal of Chromatography. A. 1192 (1), 139-146 (2008).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+the+batch+effect+issue+for+LC/MS+metabolomics+data+in+data+preprocessing.">Addressing the batch effect issue for LC/MS metabolomics data in data preprocessing.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13856 (2020).</li><li>Han, W., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+and+minimizing+batch+effects+in+metabolomics.">Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics.</a> Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).</li><li>Fei, F., Bowdish, D. M. E., McCarry, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+and+simultaneous+coverage+of+lipid+and+polar+metabolites+for+endogenous+cellular+metabolomics+using+HILIC-TOF-MS.">Comprehensive and simultaneous coverage of lipid and polar metabolites for endogenous cellular metabolomics using HILIC-TOF-MS.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (15), 3723-3733 (2014).</li><li>Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XCMS:+processing+mass+spectrometry+data+for+metabolite+profiling+using+nonlinear+peak+alignment,+matching,+and+identification.">XCMS: processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification.</a> Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).</li><li>Giacomoni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Workflow4Metabolomics:+a+collaborative+research+infrastructure+for+computational+metabolomics.">Workflow4Metabolomics: a collaborative research infrastructure for computational metabolomics.</a> Bioinformatics. 31 (9), 1493-1495 (2015).</li><li>Chang, H. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iMet-Q:+A+user-friendly+tool+for+label-free+metabolomics+quantitation+using+dynamic+peak-width+determination.">iMet-Q: A user-friendly tool for label-free metabolomics quantitation using dynamic peak-width determination.</a> PloS One. 11 (1), 0146112 (2016).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking.">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).</li><li>Schmid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+identity+molecular+networking+for+mass+spectrometry-based+metabolomics+in+the+GNPS+environment.">Ion identity molecular networking for mass spectrometry-based metabolomics in the GNPS environment.</a> Nature Communications. 12 (1), 3832 (2021).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).</li><li>Johnson, S. R., Lange, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-access+metabolomics+databases+for+natural+product+research:+present+capabilities+and+future+potential.">Open-access metabolomics databases for natural product research: present capabilities and future potential.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 22 (2015).</li><li>Horai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MassBank:+a+public+repository+for+sharing+mass+spectral+data+for+life+sciences.">MassBank: a public repository for sharing mass spectral data for life sciences.</a> Journal of Mass Spectrometry: JMS. 45 (7), 703-714 (2010).</li><li>Rawlinson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+clustering+of+MS/MS+spectra+from+the+firefly+metabolome+identifies+new+lucibufagin+compounds.">Hierarchical clustering of MS/MS spectra from the firefly metabolome identifies new lucibufagin compounds.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6043 (2020).</li></ol>

בקרת ה- FDR של מטבוליטים לא ממוקדים הייתה אתגר גדול. כאן, הדגמנו צינור שלם של ניתוח מטבוליקה לא ממוקדת בקנה מידה גדול (איכותי וכמותי) עם בקרת FDR. זה למעשה מפחית את התוצאות החיוביות הכוזבות, הנפוצות מאוד בניתוח טרשת נפוצה.
הכנת ספריית ייחוס ספקטרלית מתאימה למחקר שלך היא נקודת מפת...

מטבוליטים ממלאים תפקידים חשובים בתהליכים ביולוגיים. מטבוליטים הם לעתים קרובות מווסתים של תהליכים שונים כמו העברת אנרגיה, ויסות הורמונים, ויסות של נוירוטרנסמיטורים, תקשורת תאית ושינויים לאחר תרגום של חלבונים וכו '1,2,3,4. מטבוליזם לא ממוקד מספק מבט גלובלי על מטבוליטים רבים 5,6. עם ההתקדמות בטכנולוגיות ספקטרומטריית מסה וכרומטוגרפיה, התפוקה של ספקטרום MS/MS מטבוליום עולה במהירות בשנים האחרונות 7,8,9,10,11. כדי לזהות מטבוליטים ממערכי נתונים ענקיים אלה, פותחו תוכנות ביאור שונות11, כגון MZmine12, MS-FINDER13, CFM-ID14, MetFrag15 ו- SLAW16. עם זאת, זיהויים אלה מכילים לעתים קרובות תוצאות חיוביות כוזבות רבות. הסיבות כוללות: (1) ספקטרום MS/MS מכיל רעש אקראי, שעלול להטעות את התאמת השיא. (2) איזומרים והבדלים באנרגיות הפיצול גורמים לטביעות אצבעות ספקטרום מרובות ובכך מגדילים את נפח ספריית ההפניות. (3) איכות ספריות העיון משתנה. יש צורך בתקן מתאים לבניית ספריית ייחוס ספקטרלית טובה. לכן, בקרת קצב גילוי שגוי שיטתית (FDR) עבור מטבוליקה לא ממוקדת חיונית למחקר מטבוליזם פונקציונלי 7,8,9,17.
הן גישת ה-Empirical Bayes והן אסטרטגיית ה-Target-Decoy התמודדו עם בעיית השליטה ב-FDR באופן כללי. Kerstin Scheubert et al. הראו כי אסטרטגיית Target-Decoy על מסד נתונים של דמה שנוצרה משיטה מבוססת עץ פיצול היא השיטה הטובה ביותר לבקרת FDR9. Xusheng Wang et al. תכננו שיטה ליצירת דמה המבוססת על כלל השמינייה בכימיה ושיפרו את הדיוק של הערכת FDR17. הספרייה הספקטרלית ליצירת מסד נתונים של דמה הודגמה לביצועים טובים יותר18. כאן, שיפרנו את השיטה מבוססת הספרייה הספקטרלית ופיתחנו תוכנה בשם XY-Meta19 שיכולה לשפר עוד יותר את הדיוק של הערכת FDR. הוא משתמש בספרייה הספקטרלית הקיימת של הפניות כדי ליצור ספריית דמה עבור פקד FDR תחת ערכת Target-Decoy. XY-Meta תומך באלגוריתמי התאמת ספקטרום ודמיון קוסינוס משלו. זה מאפשר חיפוש קונבנציונלי ומצבי חיפוש איטרטיביים. בשלב של הערכת FDR, הוא תומך במצב שרשור Target-Decoy ובמצב מופרד. לגמישות טובה יותר, XY-Meta מקבלת ספריות דמה חיצוניות.
זיהוי שיא וכימות של מטבוליטים הוא גם שלב חשוב בניתוח מטבוליזם לא ממוקד. זיהוי שיא הוא השיטה העיקרית לזיהוי מטבוליזם. באופן כללי, הדיוק של גילוי שיא של מטבוליטים הושפע מגורמים רבים, כגון אותות רעש של ספקטרומטריית מסה, שפע נמוך של מטבוליטים, מזהמים ותוצרי פירוק של מטבוליטים20. כאשר מספר הדגימות של גדול מדי או שעמודת הכרומטוגרפיה הנוזלית הוחלפה בניסויים של מטבוליזם לא ממוקד, עשויים להופיע אפקטים יוצאי דופן של אצווה, המהווים אתגר גדול לכמות המטבולומים 21,22,23. נכון לעכשיו, תוכנות כמו XCMS24, Workflow4Metabolomic25, iMet-Q26 ו- metaX19 יכולות לבצע זיהוי שיא וכמות של מטבוליום לא ממוקד, אך אנו מציעים שהצינור של metaX שלם יותר וקל יותר לשימוש. כאן, אנו מדגימים את תהליך הזיהוי ובקרת ה-FDR עבור מערך נתונים זמין לציבור msv000084112 באמצעות XY-Meta, ואת שיא הזיהוי והכימות של מטבוליטים באמצעות metaX. זרימת עבודה זו דורשת רק שתי קבוצות, וכל קבוצה זקוקה לפחות לשתי דוגמאות. יש צורך בנתוני ספקטרום MS/MS, ללא קשר לפלטפורמת ספקטרומטר המסה, מצב היינון, מצב הטעינה וסוג הדגימה, ויכולים לתמוך בנורמליזציה מבוססת דגימה ובנורמליזציה מבוססת שיא. בעקבות דוגמה זו, חוקרים יכולים לבצע זיהוי וכימות של מטבוליקה בצורה קלה לטיפול. שימוש בצינור זה דורש יכולת תכנות R. כדי לסייע לחוקר ללא כל ידע בתכנות, פיתחנו גם פלטפורמת ניתוח ענן לניתוח מטבוליקה. הדגמנו את פלטפורמת ניתוח הענן הזו בחומר משלים 5.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>GNPS</td>
			<td>open source</td>
			<td>n/a</td>
			<td>https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY-Meta</td>
			<td>open source</td>
			<td>n/a</td>
			<td>https://github.com/DLI-ShenZhen/XY-Meta</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>metaX</td>
			<td>open source</td>
			<td>n/a</td>
			<td>https://github.com/wenbostar/metaX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoWizard</td>
			<td>Free Download</td>
			<td>3.0.22116.18c918b-x86_64</td>
			<td>https://proteowizard.sourceforge.io/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHI.Client</td>
			<td>Free Download</td>
			<td>ndp48-x86-x64-allos-enu</td>
			<td>http://www.chi-biotech.com/technology.html?ty=ypt</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an integrated workflow of identification and quantification on fdr control-based untargeted metabolome

טכניקות מטבוליות לא ממוקדות נמצאות בשימוש נרחב בשנים האחרונות. עם זאת, התפוקה ההולכת וגדלה במהירות ומספר הדגימות יוצרים כמות עצומה של ספקטרום, מה שמציב אתגרים לבקרת איכות של ספקטרום ספקטרומטריית המסה. כדי להפחית את התוצאות החיוביות הכוזבות, יש צורך בבקרת איכות של שיעור גילוי כוזב (FDR). לאחרונה, פיתחנו תוכנה לבקרת FDR של זיהוי מטבוליזם לא ממוקד המבוססת על אסטרטגיית Target-Decoy בשם XY-Meta. כאן הדגמנו צינור אנליזה שלם המשלב XY-Meta ו-metaX יחד. פרוטוקול זה מראה כיצד להשתמש ב- XY-meta כדי ליצור מסד נתונים של דמה ממסד נתונים קיים של ייחוס ולבצע בקרת FDR באמצעות אסטרטגיית Target-Decoy לזיהוי מטבוליזם בקנה מידה גדול בערכת נתונים בגישה פתוחה. הניתוח הדיפרנציאלי וביאור המטבוליטים בוצעו לאחר הרצת metaX לזיהוי וכמות שיאים של מטבוליטים. על מנת לסייע לחוקרים נוספים, פיתחנו גם פלטפורמת ניתוח מבוססת ענן ידידותית למשתמש עבור ניתוחים אלה, ללא צורך במיומנויות ביואינפורמטיקה או בשפות מחשב כלשהן.

הנתונים הגולמיים של msv000084112 הומרו על ידי msconvert.exe ויצרו קבצי mgf (חומר משלים S6).
XY-Meta יצר קובץ GNPS-NIST14-MATCHES_Decoy.mgf תחת /תיקיית מסד נתונים. זוהי ספריית ההטעיה שנוצרה מספריית הייחוס הספקטרלית המקורית GNPS-NIST14-MATCHES.mgf. ניתן לעשות שימוש חוזר בספריית דמה זו. בעת שימוש חוזר בספריית ד?...

Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Workflow of Identification and Quantification on FDR Control-Based Untargeted Metabolome at JoVE.com

An Integrated Workflow of Identification and Quantification on FDR Control-Based Untargeted Metabolome

בנינו זרימת עבודה מטבולית לא ממוקדת ששילבה את XY-Meta ו-metaX יחד. בפרוטוקול זה, הצגנו כיצד להשתמש ב- XY-Meta כדי ליצור ספרייה ספקטרלית מתוך הפניה לספקטרה בגישה פתוחה, ולאחר מכן ביצענו בקרת FDR והשתמשנו במטה-X כדי להגדיל את המטבוליטים לאחר זיהוי ספקטרום המטבולומיקה.

זרימת עבודה משולבת של זיהוי וכימות במטבולום לא ממוקד מבוסס בקרת FDR

Untargeted metabolomics techniques are being widely used in recent years. However, the rapidly increasing throughput and number of samples create an ...

פרוטוקול זה מאפשר ניתוח איכותי וכמותי של מטבוליזם לא ממוקד המבוסס על בקרת איכות FDR אשר מפחיתה ביעילות את התוצאות החיוביות הכוזבות של זיהוי מטבוליטים. זרימת עבודה זו משלבת XY-Meta המשתמשת באסטרטגיית ההטעיה של המטרה כדי להעריך את FDR בצורה מדויקת יותר לזיהוי מטבוליזם במודול הניתוח האיכותי. מדד זה יכול לסנן ביעילות תוצאות חיוביות שגויות של זיהוי מטבוליזם לא ממוקד, מה שמשפר את החוסן של גילוי סמנים ביולוגיים או מולקולות מפתח.אנו מצפים שחוקרים יוכלו להבין ולשלוט באסטרטגיית ההטעיה של המטרה לבקרת FDR ועליהם לנסות להפעיל בקפדנות את הצינור הזה מספר פעמים עם פרמטרי ברירת המחדל של הפרוטוקול. התחל על-ידי מעבר לדף האינטרנט של מסד הנתונים של GNPS ולחץ על עיון בערכות נתונים. חפש את מילת המפתח בעמודת הכותרת ולאחר מכן לחץ/י על מספר המזהה של ערכת הנתונים.הורד את ערכת הנתונים באמצעות FTP ושמור את הנתונים הגולמיים בתיקיה המתאימה. כדי להמיר את הפורמט של נתונים גולמיים, תחילה להתקין את תוכנת ProteoWizard. תחת נתיב ההתקנה ProteoWizard, הקלד msconvert.exe, ואחריו הפרמטרים הספציפיים להמרת תבנית הנתונים הגולמיים לתבנית mzXML. שוב, באמצעות msconvert. exe להמיר נתונים אלה לתבנית MGF ולאחסן אותם בתיקייה MGF.כדי להכין את הספריה הספקטרלית של ההפניות עבור המטבוליטים, עבור אל דף האינטרנט של התל"ג. חפש את מילת המפתח NIST, לחץ על תצוגה לקבלת הפרטים והורד את הספריה. שמור את הספריה בתיקיית מסד הנתונים.הורד את תוכנית XY-Meta. מצא את קובץ תצורת הפרמטרים תחת תיקיית התצורה ושנה את תוכנו כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הגדר את סוג התוספות כרשימה בתיקיית adduct.בצע את זיהוי המטבוליטים ואת בקרת קצב גילוי השווא באמצעות הפקודה XY-Meta.exe. הורד והתקן את חבילת התוכנה metaX. לאחר מכן ערוך את רשימת הדוגמאות.קובץ txt כדי לציין את המדגם ואת נתוני ספקטרומטריית המסה המתאימים לו כמתואר בפרוטוקול הטקסט. השתמש בקובץ R שסופק עם פרוטוקול הטקסט כדי להפעיל את הסקריפט לכימות של קבוצות Mock וקבוצות מסוג פראי באמצעות תוכנת metaX. בדוק את תיקיית הפלט שבה מאוחסנות תוצאות הניתוח הכמותי כגון תרשים PCA.לאחר מכן, שנה את הפרמטרים בסקריפט R כדי לבאר את השיאים בניתוח איכותי וכמותי באמצעות זיהוי מטבוליט על מנת לשלב הן את התוצאות ולהפעיל את סקריפט R. חלקות קופסה של מטבוליטים מכמתים הראו שההתפלגות הכללית של דגימות בריאות ומחלות הייתה דומה עם תנודות נמוכות של הערכים הממוצעים. רק ל-3.39% מהמטבוליטים היו יותר מ-30% מהערכים החסרים.תרשים ניתוח המרכיבים העיקריים של הדגימות משתי הקבוצות הראה כי metaX הגדיל באופן מדהים את שיעור המטבוליטים עם CV פחות מ-0.3. דיאגרמת Venn של מטבוליטים שזוהו באופן דיפרנציאלי משלוש שיטות בדיקה סטטיסטיות חשפה 119 מטבוליטים נפוצים. זמן השימור והמסה לפי התפלגות מטען של כל המטבוליטים המבוארים תוכננו עם שיעור גילוי כוזב של פחות מ-0.01, והראו שישה מטבוליטים משמעותיים וזוהו באופן דיפרנציאלי.חשוב להגביל את הזמן לבדיקת זרימת עבודה. זכור, לא לבחור יותר מדי דגימות לניתוח ולשמור לפחות שתי דגימות בכל קבוצה. טכניקה זו מאפשרת בקרת איכות של זיהוי מטבוליזם מנתוני רכישה בלתי תלויים של נתונים, תוך בניית ספרייה ספקטרלית חזקה יותר של ספקטרום ייחוס באמצעות תוצאות התאמת הספקטרום המבוססות על בקרת FDR.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

זיהוי של קינאז תלוי-Cyclin 1 אתרי זירחון ספציפיים על-ידי קינאז במבחנה Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

כימות של היפופיגמנטציה הפעילות במבחנה

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

קוונפיקציה של קואנזים A בתאים ורקמות

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Immunoprecipitation ללא תווית של זרימת עבודה בהיקפים גדולים של החברה ליצירת פרופיל רב-ממדי של Interactome גרעינית

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

ספקטרוסקופיית ראמאן משולבת ופלטפורמת ספקטרומטר המסה ללימוד תא יחיד קליטת סמים, מטבוליזם, ואפקטים

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

בדיקות מבוססות-כרומטוגרפיה של נוזלים מבוססי-המסה של טבולומיקס חיטה

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Evaluating the Effect of Pesticides on the Larvae of the Solitary Bees

הערכת ההשפעה של חומרי הדברה על הזחלים של הדבורים הבודדות

Current ecological risk assessments of pesticides on pollinators have primarily considered only laboratory conditions. For the larvae of solitary bees, ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

כימות של התפלגות גליקוגן תת-תאית בסיבי שריר השלד באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...