Name: an integrated workflow of identification and quantification on fdr control-based untargeted metabolome
Uploaded: 2022-09-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Workflow of Identification and Quantification on FDR Control-Based Untargeted Metabolome at JoVE.com

Detta arbete stöds av National Key Research and Development Program (2018YFC0910200/2017YFA0505001) och Guangdong Key R&D Program (2019B020226001).

1. Förbered metabolomikdatauppsättningar för analys
I den här demonstrationen använder vi metabolomikdatauppsättningar utan QC-exempel. Data för ärende- och kontrollgrupper behövs. För demonstration använder vi en offentlig datauppsättning i GNPS-databas27.
<ol><li>Gå till webbsidan https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp. Klicka på Bläddra bland datauppsättningar.</li>
	<li>Sök på nyckelordet "msv000...

<ol>
	<li>Misra, B. B., Fahrmann, J. F., Grapov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+emerging+metabolomic+tools+and+resources:+2015-2016.">Review of emerging metabolomic tools and resources: 2015-2016.</a> Electrophoresis. 38 (18), 2257-2274 (2017).</li><li>Idle, J. R., Gonzalez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics.">Metabolomics.</a> Cell Metabolism. 6 (5), 348-351 (2007).</li><li>Fiehn, O., Town, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+&#8212;+the+link+between+genotypes+and+phenotypes.">Metabolomics &#8212; the link between genotypes and phenotypes.</a> Functional Genomics. , 155-171 (2002).</li><li>Town, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Functional Genomics. , (2002).</li><li>Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+metabolomics.">Mass spectrometry-based metabolomics.</a> Mass Spectrometry Reviews. 26 (1), 51-78 (2007).</li><li>Vinayavekhin, N., Saghatelian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+metabolomics.">Untargeted metabolomics.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 1-24 (2010).</li><li>Chaleckis, R., Meister, I., Zhang, P., Wheelock, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges,+progress+and+promises+of+metabolite+annotation+for+LC-MS-based+metabolomics.">Challenges, progress and promises of metabolite annotation for LC-MS-based metabolomics.</a> Current Opinion in Biotechnology. 55, 44-50 (2019).</li><li>Palmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDR-controlled+metabolite+annotation+for+high-resolution+imaging+mass+spectrometry.">FDR-controlled metabolite annotation for high-resolution imaging mass spectrometry.</a> Nature Methods. 14 (1), 57-60 (2017).</li><li>Scheubert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+estimation+for+large+scale+metabolomics+annotations+by+spectral+matching.">Significance estimation for large scale metabolomics annotations by spectral matching.</a> Nature Communications. 8 (1), 1494 (2017).</li><li>Schrimpe-Rutledge, A. C., Codreanu, S. G., Sherrod, S. D., McLean, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+metabolomics+strategies-challenges+and+emerging+directions.">Untargeted metabolomics strategies-challenges and emerging directions.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (12), 1897-1905 (2016).</li><li>Bla&#382;enovi&#263;, I., Kind, T., Ji, J., Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+and+approaches+for+compound+identification+of+LC-MS/MS+data+in+metabolomics.">Software tools and approaches for compound identification of LC-MS/MS data in metabolomics.</a> Metabolites. 8 (2), (2018).</li><li>Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MZmine:+toolbox+for+processing+and+visualization+of+mass+spectrometry+based+molecular+profile+data.">MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data.</a> Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).</li><li>Tsugawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+rearrangement+rules:+computational+MS/MS+fragmentation+and+structure+elucidation+using+MS-FINDER+software.">Hydrogen rearrangement rules: computational MS/MS fragmentation and structure elucidation using MS-FINDER software.</a> Analytical chemistry. 88 (16), 7946-7958 (2016).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFM-ID+4.0:+More+accurate+ESI-MS/MS+spectral+prediction+and+compound+identification.">CFM-ID 4.0: More accurate ESI-MS/MS spectral prediction and compound identification.</a> Analytical Chemistry. 93 (34), 11692-11700 (2021).</li><li>Ruttkies, C., Schymanski, E. L., Wolf, S., Hollender, J., Neumann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetFrag+relaunched:+incorporating+strategies+beyond+in+silico+fragmentation.">MetFrag relaunched: incorporating strategies beyond in silico fragmentation.</a> Journal of Cheminformatics. 8, 3 (2016).</li><li>Delabriere, A., Warmer, P., Brennsteiner, V., Zamboni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAW:+A+scalable+and+self-optimizing+processing+workflow+for+untargeted+LC-MS.">SLAW: A scalable and self-optimizing processing workflow for untargeted LC-MS.</a> Analytical chemistry. 93 (45), 15024-15032 (2021).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-decoy-based+false+discovery+rate+estimation+for+large-scale+metabolite+identification.">Target-decoy-based false discovery rate estimation for large-scale metabolite identification.</a> Journal of Proteome Research. 17 (7), 2328-2334 (2018).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XY-Meta:+a+high-efficiency+search+engine+for+large-scale+metabolome+annotation+with+accurate+FDR+estimation.">XY-Meta: a high-efficiency search engine for large-scale metabolome annotation with accurate FDR estimation.</a> Analytical Chemistry. 92 (8), 5701-5707 (2020).</li><li>Wen, B., Mei, Z., Zeng, C., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=metaX:+a+flexible+and+comprehensive+software+for+processing+metabolomics+data.">metaX: a flexible and comprehensive software for processing metabolomics data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 183 (2017).</li><li>Aberg, K. M., Torgrip, R. J. O., Kolmert, J., Schuppe-Koistinen, I., Lindberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+detection+and+alignment+of+hyphenated+chromatographic-mass+spectrometric+data.+Extraction+of+pure+ion+chromatograms+using+Kalman+tracking.">Feature detection and alignment of hyphenated chromatographic-mass spectrometric data. Extraction of pure ion chromatograms using Kalman tracking.</a> Journal of Chromatography. A. 1192 (1), 139-146 (2008).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+the+batch+effect+issue+for+LC/MS+metabolomics+data+in+data+preprocessing.">Addressing the batch effect issue for LC/MS metabolomics data in data preprocessing.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13856 (2020).</li><li>Han, W., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+and+minimizing+batch+effects+in+metabolomics.">Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics.</a> Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).</li><li>Fei, F., Bowdish, D. M. E., McCarry, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+and+simultaneous+coverage+of+lipid+and+polar+metabolites+for+endogenous+cellular+metabolomics+using+HILIC-TOF-MS.">Comprehensive and simultaneous coverage of lipid and polar metabolites for endogenous cellular metabolomics using HILIC-TOF-MS.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (15), 3723-3733 (2014).</li><li>Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XCMS:+processing+mass+spectrometry+data+for+metabolite+profiling+using+nonlinear+peak+alignment,+matching,+and+identification.">XCMS: processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification.</a> Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).</li><li>Giacomoni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Workflow4Metabolomics:+a+collaborative+research+infrastructure+for+computational+metabolomics.">Workflow4Metabolomics: a collaborative research infrastructure for computational metabolomics.</a> Bioinformatics. 31 (9), 1493-1495 (2015).</li><li>Chang, H. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iMet-Q:+A+user-friendly+tool+for+label-free+metabolomics+quantitation+using+dynamic+peak-width+determination.">iMet-Q: A user-friendly tool for label-free metabolomics quantitation using dynamic peak-width determination.</a> PloS One. 11 (1), 0146112 (2016).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking.">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).</li><li>Schmid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+identity+molecular+networking+for+mass+spectrometry-based+metabolomics+in+the+GNPS+environment.">Ion identity molecular networking for mass spectrometry-based metabolomics in the GNPS environment.</a> Nature Communications. 12 (1), 3832 (2021).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).</li><li>Johnson, S. R., Lange, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-access+metabolomics+databases+for+natural+product+research:+present+capabilities+and+future+potential.">Open-access metabolomics databases for natural product research: present capabilities and future potential.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 22 (2015).</li><li>Horai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MassBank:+a+public+repository+for+sharing+mass+spectral+data+for+life+sciences.">MassBank: a public repository for sharing mass spectral data for life sciences.</a> Journal of Mass Spectrometry: JMS. 45 (7), 703-714 (2010).</li><li>Rawlinson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+clustering+of+MS/MS+spectra+from+the+firefly+metabolome+identifies+new+lucibufagin+compounds.">Hierarchical clustering of MS/MS spectra from the firefly metabolome identifies new lucibufagin compounds.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6043 (2020).</li></ol>

FDR-kontrollen av oriktade metaboliter har varit en stor utmaning. Här demonstrerade vi en komplett pipeline av storskalig oriktad metabolomikanalys (kvalitativ och kvantitativ) med FDR-kontroll. Detta minskar effektivt de falska positiva resultaten, som är mycket vanliga vid MS-analys.
Att förbereda ett lämpligt referensspektralbibliotek för din studie är en viktig punkt. En framgångsrik och känslig MS/MS-identifiering kräver inte bara korrekta matchningsalgoritmer utan också korrek...

Metaboliter spelar viktiga roller i biologiska processer. Metaboliter är ofta regulatorer för olika processer som energiöverföring, hormonregler, reglering av neurotransmittorer, cellulär kommunikation och protein post-translationella modifieringar, etc 1,2,3,4. Oriktad metabolomik ger en global bild av många metaboliter 5,6. Med framsteg inom masspektrometri och kromatografiteknik ökar genomströmningen av metabolom MS / MS-spektra snabbt de senaste åren 7,8,9,10,11. För att identifiera metaboliter från dessa enorma datamängder utvecklades olika anteckningsprogram11, såsom MZmine12, MS-FINDER13, CFM-ID14, MetFrag15 och SLAW16. Dessa identifieringar innehåller dock ofta många falska positiva resultat. Anledningarna inkluderar: (1) MS / MS-spektra innehåller slumpmässigt brus, vilket kan vilseleda toppmatchningen. (2) Isomerer och skillnader i fragmenteringsenergier orsakar flera spektrafingeravtryck och ökar därmed referensbibliotekets volym. (3) Kvaliteten på referensbiblioteken varierar. En ordentlig standard för att bygga ett bra referensspektralbibliotek behövs. Därför är en systematisk falsk upptäcktshastighet (FDR) -kontroll för oriktad metabolomik avgörande för funktionell metabolomforskning 7,8,9,17.
Både den empiriska Bayes-metoden och Target-Decoy-strategin tog itu med FDR-kontrollproblemet i allmänhet. visade att Target-Decoy-strategin på lockbetedatabasen genererad från fragmenteringsträdbaserad metod är den bästa metoden för FDR-kontroll9. konstruerade en metod för lockgenerering baserad på oktettregeln i kemi och förbättrade precisionen i FDR-uppskattning17. Spektralbiblioteket för att generera lockbetesdatabas demonstrerades för bättre prestanda18. Här förbättrade vi den spektrala biblioteksbaserade metoden och utvecklade en programvara som heter XY-Meta19 som ytterligare kan förbättra FDR-uppskattningens precision. Den använder det befintliga referensspektralbiblioteket för att generera ett lockbibliotek för FDR-kontrollen under Target-Decoy-schemat. XY-Meta stöder sina egna spektramatchnings- och cosinuslikhetsalgoritmer. Det tillåter konventionell sökning och iterativa söklägen. I steget för FDR-utvärdering stöder den Target-Decoy-sammanfogat läge och separerat läge. För bättre flexibilitet accepterar XY-Meta externa lockbibliotek.
Toppdetektion och kvantifiering av metaboliter är också ett viktigt steg i oriktad metabolomanalys. Toppdetektering är den huvudsakliga metoden för metabolomidentifiering. I allmänhet påverkades noggrannheten för toppdetektering av metaboliter av flera faktorer, såsom brussignaler från masspektrometri, låg förekomst av metaboliter, föroreningar och nedbrytningsprodukter av metaboliter20. När antalet prover av är för stort eller vätskekromatografikolonnen ersattes i experiment med oriktat metabolom kan anmärkningsvärda batcheffekter uppstå, vilket är en stor utmaning för metabolomkvantifiering 21,22,23. För närvarande kan programvara som XCMS24, Workflow4Metabolomic25, iMet-Q26 och metaX19 utföra toppdetektering och kvantifiering av oriktad metabolom, men vi föreslår att pipelinen för metaX är mer komplett och lättare att använda. Här demonstrerar vi processen för identifiering och FDR-kontroll för en offentligt tillgänglig datauppsättning msv000084112 med XY-Meta, och toppdetektering och kvantifiering av metaboliter med metaX. Det här arbetsflödet kräver bara två grupper och varje grupp behöver minst två exempel. MS / MS-spektradata behövs, oavsett masspektrometerplattform, joniseringsläge, laddningsläge och provtyp, och kan stödja provbaserad normalisering och toppbaserad normalisering. Efter detta exempel kan forskare utföra metabolomikidentifiering och kvantifiering på ett lätthanterligt sätt. Att använda den här pipelinen kräver R-programmeringskapacitet. För att hjälpa forskaren utan programmeringskunskap utvecklade vi också en molnanalysplattform för metabolomikanalys. Vi demonstrerade denna molnanalysplattform i kompletterande material 5.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>GNPS</td>
			<td>open source</td>
			<td>n/a</td>
			<td>https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY-Meta</td>
			<td>open source</td>
			<td>n/a</td>
			<td>https://github.com/DLI-ShenZhen/XY-Meta</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>metaX</td>
			<td>open source</td>
			<td>n/a</td>
			<td>https://github.com/wenbostar/metaX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoWizard</td>
			<td>Free Download</td>
			<td>3.0.22116.18c918b-x86_64</td>
			<td>https://proteowizard.sourceforge.io/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHI.Client</td>
			<td>Free Download</td>
			<td>ndp48-x86-x64-allos-enu</td>
			<td>http://www.chi-biotech.com/technology.html?ty=ypt</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an integrated workflow of identification and quantification on fdr control-based untargeted metabolome

Oriktade metabolomiktekniker används i stor utsträckning de senaste åren. Den snabbt ökande genomströmningen och antalet prover skapar dock en enorm mängd spektra, vilket ställer utmaningar för kvalitetskontroll av masspektrometrispektra. För att minska de falska positiva resultaten krävs kvalitetskontroll av falsk identifieringsfrekvens (FDR). Nyligen utvecklade vi en programvara för FDR-kontroll av oriktad metabolomidentifiering som är baserad på en Target-Decoy-strategi som heter XY-Meta. Här demonstrerade vi en komplett analyspipeline som integrerar XY-Meta och metaX tillsammans. Detta protokoll visar hur man använder XY-meta för att generera en lockbete-databas från en befintlig referensdatabas och utföra FDR-kontroll med hjälp av Target-Decoy-strategin för storskalig metabolomidentifiering på en open access-datauppsättning. Differentialanalysen och metabolitennoteringen utfördes efter körning av metaX för metaboliter toppar detektion och kvantifiering. För att hjälpa fler forskare utvecklade vi också en användarvänlig molnbaserad analysplattform för dessa analyser, utan behov av bioinformatikkunskaper eller några datorspråk.

Rådata för msv000084112 konverterades av msconvert.exe och genererade mgf-filer (Supplementary Material S6).
XY-Meta-genererad GNPS-NIST14-MATCHES_Decoy.mgf-fil under / databasmapp. Detta är lockbetebiblioteket som genereras från det ursprungliga referensspektralbiblioteket GNPS-NIST14-MATCHES.mgf. Detta lockbibliotek kan återanvändas. När du återanvänder det här lockbetebiblioteket ska användaren ställa in decoy_pattern som 1 i parameter.default-filen och ange dec...

Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Workflow of Identification and Quantification on FDR Control-Based Untargeted Metabolome at JoVE.com

An Integrated Workflow of Identification and Quantification on FDR Control-Based Untargeted Metabolome

Vi konstruerade ett oriktat metabolomiskt arbetsflöde som integrerade XY-Meta och metaX tillsammans. I detta protokoll visade vi hur man använder XY-Meta för att generera ett lockbete spektralbibliotek från open access-spektrareferens och utförde sedan FDR-kontroll och använde metaX för att kvantifiera metaboliterna efter att ha identifierat metabolomicspektra.

Ett integrerat arbetsflöde för identifiering och kvantifiering på FDR-kontrollbaserat oriktat metabolom

Untargeted metabolomics techniques are being widely used in recent years. However, the rapidly increasing throughput and number of samples create an ...

Detta protokoll möjliggör kvalitativ och kvantitativ analys av oriktat metabolom baserat på FDR-kvalitetskontroll som effektivt minskar de falska positiva resultaten av metabolitidentifiering. Detta arbetsflöde integrerar XY-Meta som använder target-decoy-strategin för att utvärdera FDR mer exakt för metabolomidentifiering i den kvalitativa analysmodulen. Detta mått kan effektivt filtrera falska positiva resultat av oriktad metabolomidentifiering, vilket förbättrar robustheten hos att upptäcka biomarkörer eller nyckelmolekyler.Vi förväntar oss att forskare kan förstå och behärska target-decoy-strategin för FDR-kontroll och bör försöka strikt köra denna pipeline flera gånger med protokollets standardparametrar. Börja med att gå till GNPS-databasens webbsida och klicka på bläddra bland datauppsättningar. Sök på nyckelordet i rubrikkolumnen och klicka sedan på datauppsättningens ID-nummer.Ladda ner datauppsättningen med FTP och spara rådata i respektive mapp. För att konvertera formatet på rådata, installera först ProteoWizard-programvaran. Under installationssökvägen proteoWizard skriver du msconvert.exe, följt av de specifika parametrarna för att konvertera rådataformatet till mzXML-format. Återigen, med hjälp av msconvert. exe konvertera dessa data till MGF-format och lagra dem i MGF-mappen.För att förbereda referensspektralbiblioteket för metaboliterna, gå till GNPS-webbsidan. Sök på nyckelordet NIST, klicka på visa för mer information och ladda ner biblioteket. Spara biblioteket i databasmappen.Ladda ner XY-Meta-programmet. Hitta parameterkonfigurationsfilen under konfigurationsmappen och ändra dess innehåll enligt beskrivningen i textprotokollet. Ställ in typen av addukter som en lista i adduktmappen.Utför metabolitidentifiering och falsk upptäcktshastighetskontroll med kommandot XY-Meta.exe. Ladda ner och installera metaX-programvarupaketet. Redigera sedan exempellistan.txt-fil för att ange provet och dess motsvarande masspektrometridata enligt beskrivningen i textprotokollet. Använd R-filen som medföljer textprotokollet för att köra skriptet för kvantifiering av Mock- och wild-type-grupper med hjälp av metaX-programvaran. Kontrollera utdatamappen där resultaten av den kvantitativa analysen lagras, till exempel PCA-diagrammet.Ändra sedan parametrarna i R-skriptet för att kommentera topparna i kvalitativ och kvantitativ analys med hjälp av metabolitidentifieringar för att integrera både resultaten och köra R-skriptet. Rutdiagram över kvantifierade metaboliter visade att den allmänna fördelningen av friska prover och sjukdomsprover var liknande med låga fluktuationer i medelvärdena. Endast 3,39% av metaboliterna hade mer än 30% av de saknade värdena.Principkomponentanalysdiagram för proverna från båda grupperna visade att metaX anmärkningsvärt ökade andelen metaboliter med CV mindre än 0,3. Ett Venndiagram över differentiellt detekterade metaboliter från tre statistiska testmetoder avslöjade 119 vanliga metaboliter. Retentionstid och massa genom laddningsfördelning av alla kommenterade metaboliter plottades med en falsk upptäcktshastighet på mindre än 0,01, vilket visade sex signifikanta och differentiellt detekterade metaboliter.Det är viktigt att begränsa tiden för arbetsflödestestning. Kom ihåg att inte välja för många prover för analys och behålla minst två prover i varje grupp. Denna teknik möjliggör kvalitetskontroll av metaboliserad identifiering från dataoberoende insamlingsdata som konstruerar ett mer robust referensspektrumspektralbibliotek med hjälp av spektrummatchningsresultaten baserat på FDR-kontroll.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metod för hög genomströmning kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifiering av cyklin-beroende Kinase 1 särskilda fosforylering platser av ett In Vitro -Kinas Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Kvantifiering av hypopigmentering aktivitet In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Kvantifiering av coenzym A i celler och vävnader

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Label-fri immunoprecipitation masspektrometri arbetsflöde för storskalig nukleär Interactome profilering

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

En integrerad Raman spektroskopi och masspektrometri plattform för att studera Single-cell drog upptag, metabolism, och effekter

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Oriktad flytande kromatografi-Mass Pektrometri-Baserade metabolomika analys av vetekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Evaluating the Effect of Pesticides on the Larvae of the Solitary Bees

Utvärdering av effekten av bekämpningsmedel på larverna hos de ensamma bina

Current ecological risk assessments of pesticides on pollinators have primarily considered only laboratory conditions. For the larvae of solitary bees, ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Kvantifiering av subcellulär glykogenfördelning i skelettmuskelfibrer med hjälp av transmissionselektronmikroskopi

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...