Name: quantitative analysis of viscoelastic properties of red blood cells using optical tweezers and defocusing microscopy
Uploaded: 2022-03-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Viscoelastic Properties of Red Blood Cells Using Optical Tweezers and Defocusing Microscopy at JoVE.com

يود المؤلفون أن يشكروا جميع أعضاء مرفق الفحص المجهري المتقدم CENABIO للمساعدة المهمة للغاية. وحظي هذا العمل بدعم الوكالات البرازيلية "المجلس الوطني للتنمية المدنية والتكنولوجية (CNPq)، والمجلس الوطني لإنفاذ الحقوق الدستورية (CAPES) - القانون المالي رقم 001، ومؤسسة إنفاذ الحقوق الدستورية في مجال التنمية في ولاية ريو دي جانيرو، والمعهد الوطني للعلوم والتكنولوجيا في فلويدوس كومبلكس، جنبا إلى جنب مع مؤسسة إنفاذ الحقوق الدستورية (PESPI) جنبا إلى جنب مع مؤسسة إنفاذ الحقوق الدستورية (Pesquisa do Estado de São Paulo). تم دعم BP بمنحة JCNE من FAPERJ.

تم تقديم عينات الدم البشري من قبل متطوعين بالغين من الرجال والنساء وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة أخلاقيات البحث في الجامعة الفيدرالية في ريو دي جانيرو (البروتوكول 2.889.952) والمسجلة في منصة البرازيل تحت رقم CAAE 88140418.5.0000.5699. تم إصدار نموذج خطي للموافقة على جميع المتطوعين وجمعها منهم. ت...

<ol>
	<li>Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+erythrocyte+plasma+membrane:+a+Rosetta+Stone+for+decoding+membrane-cytoskeleton+structure.">The human erythrocyte plasma membrane: a Rosetta Stone for decoding membrane-cytoskeleton structure.</a> Current Topics in Membranes. 72, 39-88 (2013).</li><li>Tomaiuolo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+properties+of+red+blood+cells+in+health+and+disease+towards+microfluidics.">Biomechanical properties of red blood cells in health and disease towards microfluidics.</a> Biomicrofluidics. 8 (5), 051501 (2014).</li><li>Depond, M., Henry, B., Buffet, P., Ndour, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+investigate+the+deformability+of+RBC+during+malaria.">Methods to investigate the deformability of RBC during malaria.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1613 (2019).</li><li>Boal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mechanics of the Cell. 2 edn. , (2012).</li><li>Balland, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+laws+in+microrheology+experiments+on+living+cells:+Comparative+analysis+and+modeling.">Power laws in microrheology experiments on living cells: Comparative analysis and modeling.</a> Physical Review E. 74 (2), 021911 (2006).</li><li>Amin, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microrheology+of+red+blood+cell+membranes+using+dynamic+scattering+microscopy.">Microrheology of red blood cell membranes using dynamic scattering microscopy.</a> Optics Express. 15 (25), 17001-17009 (2007).</li><li>Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelasticity+of+the+human+red+blood+cell.">Viscoelasticity of the human red blood cell.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 293 (2), 597-605 (2007).</li><li>Gomez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cell+geometry+in+the+evaluation+of+erythrocyte+viscoelastic+properties.">Effect of cell geometry in the evaluation of erythrocyte viscoelastic properties.</a> Physical Review E. 101 (6-1), 062403 (2020).</li><li>Gomez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+maturation+across+the+intra-erythrocytic+cycle+shifts+the+soft+glassy+viscoelastic+properties+of+red+blood+cells+from+a+liquid-like+towards+a+solid-like+behavior.">Plasmodium falciparum maturation across the intra-erythrocytic cycle shifts the soft glassy viscoelastic properties of red blood cells from a liquid-like towards a solid-like behavior.</a> Experimental Cell Research. 397 (2), 112370 (2020).</li><li>Pompeu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+to+measure+the+membrane+tension+and+bending+modulus+of+cells+using+optical+tweezers+and+scanning+electron+microscopy.">Protocol to measure the membrane tension and bending modulus of cells using optical tweezers and scanning electron microscopy.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100283 (2021).</li><li>Agero, U., Mesquita, L. G., Neves, B. R., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defocusing+microscopy.">Defocusing microscopy.</a> Microscopy Research and Technique. 65 (3), 159-165 (2004).</li><li>Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+fluctuations+studied+with+defocusing+microscopy.">Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy.</a> Physical Review E. 67 (5), 051904 (2003).</li><li>Roma, P. M. S., Siman, L., Amaral, F. T., Agero, U., Mesquita, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+three-dimensional+imaging+of+phase+objects+using+defocusing+microscopy:+Application+to+red+blood+cells.">Total three-dimensional imaging of phase objects using defocusing microscopy: Application to red blood cells.</a> Applied Physics Letters. 104 (25), 251107 (2014).</li><li>K&#246;hler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+of+illumination+for+photomicrographical+purposes.">New method of illumination for photomicrographical purposes.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 (1894).</li><li>Nans, A., Mohandas, N., Stokes, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+ultrastructure+of+the+red+cell+cytoskeleton+by+cryo-electron+tomography.">Native ultrastructure of the red cell cytoskeleton by cryo-electron tomography.</a> Biophysical Journal. 101 (10), 2341-2350 (2011).</li><li>Ayala, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+properties+of+cells+measured+by+optical+tweezers.">Rheological properties of cells measured by optical tweezers.</a> BMC Biophysics. 9, 5 (2016).</li><li>Ayala, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cytoskeletal+drugs+on+actin+cortex+elasticity.">Effects of cytoskeletal drugs on actin cortex elasticity.</a> Experimental Cell Research. 351 (2), 173-181 (2017).</li></ol>

في هذا البروتوكول ، يتم تقديم طريقة متكاملة تعتمد على الملقط البصري والفحص المجهري اللابؤري لرسم خريطة كمية للخصائص اللزجة المرنة لكرات الدم الحمراء. يتم تحديد نتائج وحدات قص التخزين والخسارة ، جنبا إلى جنب مع أس التحجيم الذي يميز الريولوجيا الزجاجية الناعمة لكرات الدم الحمراء. تم بالفع?...

خلايا الدم الحمراء الناضجة (RBCs) ، والمعروفة أيضا باسم كريات الدم الحمراء ، قادرة على تمديد أكثر من ضعف حجمها عند المرور عبر أضيق الشعيرات الدموية في جسم الإنسان1. وتعزى هذه القدرة إلى قدرتها الفريدة على التشوه عند تعرضها لأحمال خارجية.
في السنوات الأخيرة ، ميزت دراسات مختلفة هذه الميزة في أسطح كرات الدم الحمراء 2,3. يسمى مجال الفيزياء الذي يصف الاستجابات المرنة واللزجة للمواد بسبب الأحمال الخارجية الريولوجيا. بشكل عام ، عندما يتم تطبيق قوة خارجية ، يعتمد التشوه الناتج على خصائص المادة ويمكن تقسيمه إلى تشوهات مرنة ، تخزن الطاقة ، أو التشوهات اللزجة ، التي تبدد الطاقة4. جميع الخلايا ، بما في ذلك كرات الدم الحمراء ، تظهر سلوكا لزجا مرنا. بمعنى آخر ، يتم تخزين الطاقة وتبديدها. وبالتالي يمكن وصف الاستجابة اللزجة المرنة للخلية بمعامل القص المعقد G * (ω) = G '(ω) + iG "(ω) ، حيث G ' (ω) هو معامل التخزين ، المرتبط بالسلوك المرن ، و G" (ω) هو معامل الفقد ، المتعلق بلزوجته4. علاوة على ذلك ، تم استخدام النماذج الظاهرية لوصف استجابات الخلايا ، ويطلق على أحد أكثرها استخداما نموذج الريولوجيا الزجاجيةالناعمة 5 ، والذي يتميز باعتماد قانون الطاقة لمعامل القص المعقد مع تردد الحمل.
تم استخدام الطرق القائمة على الخلية الواحدة لتوصيف الخصائص اللزجة المرنة لكرات الدم الحمراء ، من خلال تطبيق القوة وقياس الإزاحة كدالة للحمل المفروض 2,3. ومع ذلك ، بالنسبة لمعامل القص المعقد ، يمكن العثور على نتائج قليلة في الأدبيات. باستخدام تشتت الضوء الديناميكي ، تم الإبلاغ عن قيم تخزين كرات الدم الحمراء ووحدات الخسارة تتراوح من 0.01-1 باسكال ، في نطاق تردد 1-100 هرتز6. باستخدام القياس الخلوي الملتوي المغناطيسي البصري ، تم الحصول على معامل مرونة معقد ظاهر7 ، ولأغراض المقارنة ، زعم أن العامل المضاعف ربما يوضح التناقضات.
في الآونة الأخيرة ، تم إنشاء منهجية جديدة تعتمد على الملقط البصري (OT) جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري اللابؤري (DM) ، كأداة متكاملة لرسم خريطة كمية لتخزين وفقدان وحدات القص لكريات الدم الحمراء البشرية على الأحمال المعتمدة على الوقت ، 8,9. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام نموذج ريولوجي زجاجي ناعم لتناسب النتائج والحصول على معامل قانون الطاقة الذي يميز كرات الدمالحمراء 8,9.
بشكل عام ، توضح المنهجية المطورة 8,9 ، التي تم وصف البروتوكول بالتفصيل أدناه ، التناقضات السابقة باستخدام القيم المقاسة لعامل الشكل ، Ff ، الذي يربط القوى والتشوهات بالضغوط والإجهاد في سطح كرات الدم الحمراء ويمكن استخدامه كطريقة تشخيصية جديدة قادرة على تحديد المعلمات اللزجة المرنة والسمات الزجاجية الناعمة لكرات الدم الحمراء التي تم الحصول عليها من الأفراد ذوي الدم المختلف الامراض. مثل هذا التوصيف ، باستخدام البروتوكول الموضح أدناه ، قد يفتح إمكانيات جديدة لفهم سلوك كرات الدم الحمراء من منظور ميكانيكي بيولوجي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom dishes</td>
			<td>MatTek Life Sciences</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MXA22165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KaleidaGraph</td>
			<td>Synergy Software</td>
			<td>https://www.synergy.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR717805-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T1020CK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT laser</td>
			<td>IPG Photonics</td>
			<td>YLR-5-1064-LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17134-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber ring</td>
			<td>Forever Seals</td>
			<td>NBR O-Ring</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Z273554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage positioning</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-545.3R8S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>P1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of viscoelastic properties of red blood cells using optical tweezers and defocusing microscopy

تم التحقيق في الخصائص اللزجة المرنة لكريات الدم الحمراء من خلال مجموعة من التقنيات. ومع ذلك ، تختلف البيانات التجريبية المبلغ عنها. لا يعزى هذا فقط إلى التباين الطبيعي للخلايا ، ولكن أيضا إلى الاختلافات في طرق ونماذج استجابة الخلية. هنا ، يتم استخدام بروتوكول متكامل باستخدام ملاقط بصرية ومجهر إلغاء التركيز للحصول على السمات الريولوجية لخلايا الدم الحمراء في نطاق التردد من 1 هرتز إلى 35 هرتز. بينما يتم استخدام الملقط البصري لقياس الثابت المرن المعقد لكرات الدم الحمراء ، فإن الفحص المجهري اللابؤري قادر على الحصول على ملف تعريف ارتفاع الخلية وحجمها وعامل شكلها معلمة تسمح بتحويل ثابت المرونة المعقد إلى معامل قص معقد. علاوة على ذلك ، بتطبيق نموذج ريولوجي زجاجي ناعم ، يمكن الحصول على أس القياس لكلا المعيارين. تسمح المنهجية المطورة باستكشاف السلوك الميكانيكي لخلايا الدم الحمراء ، وتوصيف معلماتها اللزجة المرنة ، التي تم الحصول عليها في ظل ظروف تجريبية محددة جيدا ، للعديد من الحالات الفسيولوجية والمرضية.

يمثل الشكل 1 مخططات نظام OT المستخدم في قياسات الريولوجيا. يوضح الشكل 2 مخططات تجربة علم الريولوجيا الدقيقة مع كلا المجالين ويظهر أيضا كرات الدم الحمراء التمثيلية. يوضح الشكل 3 منحنى نموذجيا لسعة كلا الكرتين كدالة للوقت عندما تنتج الحركات ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Viscoelastic Properties of Red Blood Cells Using Optical Tweezers and Defocusing Microscopy at JoVE.com

Quantitative Analysis of Viscoelastic Properties of Red Blood Cells Using Optical Tweezers and Defocusing Microscopy

هنا ، يتم وصف بروتوكول متكامل يعتمد على الملقط البصري والفحص المجهري اللابؤري لقياس الخصائص الريولوجية للخلايا. هذا البروتوكول له قابلية تطبيق واسعة في دراسة الخصائص اللزجة المرنة لكريات الدم الحمراء في ظل ظروف فيزيائية مرضية متغيرة.

التحليل الكمي للخصائص اللزجة المرنة لخلايا الدم الحمراء باستخدام ملاقط بصرية والفحص المجهري اللابؤري

The viscoelastic properties of erythrocytes have been investigated by a range of techniques. However, the reported experimental data vary. This is not ...

تسمح هذه المنهجية باستكشاف السلوك الميكانيكي لكريات الدم الحمراء ، وتوصيف معلماتها اللزجة المرنة وخصائصها الزجاجية الناعمة للعديد من الحالات الفسيولوجية والمرضية. تتحقق طريقتنا القائمة على الخلية الواحدة من مراجع الفيديو باستخدام القيم المعدنية لعامل الشكل الذي يربط القوى والإزاحة والضغوط والخدوش في سطح كرات الدم الحمراء. ابدأ بصب شحم السيليكون على سطح الحلقة المطاطية بطريقة تغطي المحيط بأكمله.بعد ذلك ، ضع الحلقة المطاطية على غطاء الغطاء بحيث يكون جانب الشحوم مواجها لقسيمة الغطاء. انتظر لمدة خمس دقائق للتعلق المناسب ، ومن ثم يكون حاملو العينات جاهزين لتلقي مزرعة الخلية. بعد ذلك ، مع حل الخلايا المعدة مسبقا باتباع البروتوكول المكتوب ، قم بزرع الخلايا في حامل العينة.أضف 0.2 ميكرولتر من محلول كرة البوليسترين بحجم 10٪ إلى العينة. ضع غطاء الغطاء الثاني فوق الحلقة المطاطية. أغلق الإعداد وأكمل تحضير العينة.أخيرا ، انقل العينة بأكملها إلى المجهر. لبدء التجربة ، استخدم نظام OT ، وحبس الكرة باستخدام ليزر OT ، ثم قم بإرفاقها بغطاء الغطاء ، بالقرب من الخلية. بعد ذلك ، قم بملائمة كرة أخرى وكرر نفس إجراء التعلق بالضغط على الكرة مقابل سطح الخلية ، بالقرب من السطح العلوي وبالقرب من حافة الخلية.أضف دالة جيبية للسعة والترددات المتفاوتة. بعد ذلك ، اضغط على زر البدء ، باستخدام المرحلة الكهرضغطية للسماح بالإزاحة الكهرضغطية. احتفظ بكرة كرات الدم الحمراء في المصيدة وأرسل العينة إلى دورة من الحركات باستخدام الوظيفة الجيبية المحددة مسبقا.للتحليل ، افتح برنامج ImageJ واستورد الفيلم بأكمله الذي تم الحصول عليه أثناء الحركات الجيبية. انقر فوق ضبط ، ثم حدد عتبة الخيار. اضبط العتبة باستخدام كل من أشرطة التمرير ، وحدد المجال المرجعي بالنقر فوق ملف ، متبوعا بالمستطيل.ثم في علامة التبويب تحليل ، انقر فوق تعيين القياسات "وحدد مركز الكتلة"الخيار. انقر مرة أخرى على علامة التبويب تحليل وحدد تحليل الجسيمات. ستظهر نافذة جديدة تحتوي على جدول به إحداثيات xy لمركز الكتلة.كرر الإجراء الخاص بالكرة الأخرى المتصلة بسطح كرات الدم الحمراء. افتح برنامج التحليل واستورد ملفات txt التي تم الحصول عليها مسبقا. قم بإنشاء مخطط مع مراكز الكتلة على المحور ص والوقت على المحور السيني.ارسم النتائج على رسم بياني باستخدام المحور x لثابت الخسارة ، المشار إليه ب K عدد أولي مزدوج ، والمحور y لثابت التخزين ، المشار إليه ب K عدد أولي. أولا ، للحصول على الفيديو ، حرك المرحلة الكهرضغطية في الاتجاه xy ، باستخدام البرنامج للبحث عن خلية معزولة متصلة بغطاء الغطاء. فخ وأرفق كرة من البوليسترين ذات قطر معروف بسطح كرات الدم الحمراء.بعد ذلك ، باستخدام المرحلة الكهرضغطية ، حرك الخرزة المحاصرة المتصلة بسطح كرات الدم الحمراء لتشويه الخلية ، ثم قم بتوصيل الخرزة بالشفة الغطاء. الآن ، قم بتغيير موضع المحور z للعثور على الصورة المركزة. بعد تحديد الموضع ، استخدم برنامج الكاميرا لإنشاء فيلم للخلية بأكملها.بعد ذلك ، حرك موضع المحور z بمقدار ميكرومترين لأسفل أو لأعلى للحصول على صورة غير مركزة للخلية المختارة. أخيرا ، دون تغيير موضع المحور z ، ابحث عن منطقة بدون خلايا لتكرار نفس الإجراء ، وقم بإنشاء فيلم لخلفية الصورة. للحصول على صورة التباين ، ابحث أولا عن قيمة N صفر ، وانقر على أيقونة اختيار المضلع ، ثم انقر فوق علامة التبويب تحليل وحدد القياس.بعد ذلك ، استخدم معادلة التباين لتحديد صورة N ناقص N صفر ، وقم بتنفيذ ذلك عن طريق تحديد الرياضيات "قيد العملية ، متبوعة بالطرح. في وقت لاحق ، قسم النتيجة على N صفر ناقص B.أخيرا ، ابحث عن التباين للصور المركزة وغير المركزة. الآن ، استخدم تحويل هارتلي للحصول على سمك كرات الدم الحمراء.في ImageJ ، انقر فوق العملية ، متبوعا بخيارات FFT"و FFT ، ثم اختر FHT. ثم قم بإجراء التحويل العكسي FHT عن طريق تحديد العملية ، متبوعة ب FFT "و FFT. استخدم الصورة الناتجة للحصول على ملف تعريف الارتفاع.بعد العثور على الصورة التي تحتوي على ملف تعريف ارتفاع RBC ، استخدم التباين غير البؤري للميكرومتر لإنشاء مجموعة من صورتين في ImageJ. للعثور على عامل الشكل، استخدم ماكرو مخصص ل ImageJ لتحليل المكدس. سيقدم الماكرو جدولا بموضع الحافة والمحيط ومعكوس المحيط وصورة للخلية التي تم تحليلها.تحقق مما إذا كانت حواف هذه الصورة مشابهة لحواف الشكل المرجعي. خلاف ذلك ، كرر الإجراء ، واستخدم مجموع معكوس المحيط للعثور على عامل الشكل. ابدأ بتنظيم البيانات التجريبية في جدول.قم بإنشاء جدول جديد في برنامج التحليل بالنقر فوق علامة التبويب ملف. حدد 10 أعمدة مختلفة للمعلمات. لرسم المنحنى G Prime و G الرئيسي المزدوج في برنامج التحليل ، استخدم البيانات من الجدول السابق وانقر على زر "المؤامرة".للحصول على معلمات Gamma و GM ، انقر فوق علامة التبويب Curve fit وحدد fit1 "لفتح نافذة جديدة. حدد المربع ، وانقر فوق الزر تعريف ، واكتب المعادلة. انقر فوق الزر "موافق" في كلتا النافذتين ، وسيظهر التركيب.بعد ذلك ، قم بإنشاء مخططين آخرين ، وهما G prime و G double prime كدالة لأوميغا. ضع أشرطة الخطأ فقط على المحور ص ، كما هو موضح سابقا. كرر إجراء تركيب المنحنى ، حدد خيار G".انقر فوق تعريف المنحنى "ضمن الملاءمة العامة ، ثم اكتب المعادلة المعنية. أخيرا ، انقر فوق "موافق" ، وسيظهر تركيب منحنى مع قيم Alpha و G zero. مرة أخرى ، قم بإجراء تركيب منحنى آخر.حدد الخيار G ، وانقر فوق تعريف المنحنى "ضمن الملاءمة العامة ، ثم اكتب المعادلة المعنية. أخيرا ، انقر فوق "موافق" ، وسيظهر تركيب منحنى. يوضح الشكل ثابت مرونة التخزين كدالة لثابت مرونة الفقد.يوضح الاعتماد الخطي الملاحظ أن سطح كرات الدم الحمراء يمكن اعتباره مادة زجاجية ناعمة. من خلال تطبيق قيم عامل الشكل الكلي للخلية وسمك سطح كرات الدم الحمراء ، يمكن تحديد قيم الأس ألفا. قد توفر هذه التقنية الأساس لطرق تشخيصية جديدة تربط التغيرات في خصائص اللزوجة المرنة لكرات الدم الحمراء بتعديلات في تدفق الدم للأفراد الذين يعانون من أمراض مختلفة.

Research

JoVE Journal

Biology

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

وعلى النقيض من مرحلة التدخل التفاضلية المجهري التباين (DIC)

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

العزلة والثقافة في الخلايا البطانية الرئوي من الفئران حديثي الولادة

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

الكمية خلية حية الإسفار - المجهري تحليل الخميرة الانشطار

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

التحليل الكمي للهجرة عشوائية من الخلايا باستخدام الوقت الفاصل بين الميكروسكوب فيديو

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

التحليل الكمي الالتهام الذاتي باستخدام المجهر مضان المتقدم 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

في الجسم الحي تتبع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف تميزت خمسة البروتينات الفلورية باستخدام الميكروسكوب متحد البؤر وMultiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

تقنيات لتحليل خارج الخلية الحويصلات عن طريق التدفق الخلوي

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...