Name: quantitative analysis of viscoelastic properties of red blood cells using optical tweezers and defocusing microscopy
Uploaded: 2022-03-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Viscoelastic Properties of Red Blood Cells Using Optical Tweezers and Defocusing Microscopy at JoVE.com

作者要感谢CENABIO高级显微镜设施的所有成员提供的所有重要帮助。这项工作得到了巴西国家科学和技术发展委员会（CNPq）、高级财政编码001、里约热内卢国家宪法权利保护令基金会（FAPERJ）和圣保罗国家宪法权利保护基金会（FAPESP）的支持。B.P.得到了FAPERJ的JCNE资助。

人类血液样本由成年男性和女性志愿者根据里约热内卢联邦大学研究伦理委员会批准的协议（协议2.889.952）提供，并在巴西平台注册，CAAE编号为88140418.5.0000.5699。向所有志愿者发出书面同意书，并从所有志愿者那里收集了同意书。患有任何血红蛋白病和/或服用受控药物的人被排除在外。整个过程遵循研究所伦理委员会批准的指导方针。
1. 样品架的制备
<ol><li>为...

<ol>
	<li>Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+erythrocyte+plasma+membrane:+a+Rosetta+Stone+for+decoding+membrane-cytoskeleton+structure.">The human erythrocyte plasma membrane: a Rosetta Stone for decoding membrane-cytoskeleton structure.</a> Current Topics in Membranes. 72, 39-88 (2013).</li><li>Tomaiuolo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+properties+of+red+blood+cells+in+health+and+disease+towards+microfluidics.">Biomechanical properties of red blood cells in health and disease towards microfluidics.</a> Biomicrofluidics. 8 (5), 051501 (2014).</li><li>Depond, M., Henry, B., Buffet, P., Ndour, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+investigate+the+deformability+of+RBC+during+malaria.">Methods to investigate the deformability of RBC during malaria.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1613 (2019).</li><li>Boal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mechanics of the Cell. 2 edn. , (2012).</li><li>Balland, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+laws+in+microrheology+experiments+on+living+cells:+Comparative+analysis+and+modeling.">Power laws in microrheology experiments on living cells: Comparative analysis and modeling.</a> Physical Review E. 74 (2), 021911 (2006).</li><li>Amin, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microrheology+of+red+blood+cell+membranes+using+dynamic+scattering+microscopy.">Microrheology of red blood cell membranes using dynamic scattering microscopy.</a> Optics Express. 15 (25), 17001-17009 (2007).</li><li>Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelasticity+of+the+human+red+blood+cell.">Viscoelasticity of the human red blood cell.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 293 (2), 597-605 (2007).</li><li>Gomez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cell+geometry+in+the+evaluation+of+erythrocyte+viscoelastic+properties.">Effect of cell geometry in the evaluation of erythrocyte viscoelastic properties.</a> Physical Review E. 101 (6-1), 062403 (2020).</li><li>Gomez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+maturation+across+the+intra-erythrocytic+cycle+shifts+the+soft+glassy+viscoelastic+properties+of+red+blood+cells+from+a+liquid-like+towards+a+solid-like+behavior.">Plasmodium falciparum maturation across the intra-erythrocytic cycle shifts the soft glassy viscoelastic properties of red blood cells from a liquid-like towards a solid-like behavior.</a> Experimental Cell Research. 397 (2), 112370 (2020).</li><li>Pompeu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+to+measure+the+membrane+tension+and+bending+modulus+of+cells+using+optical+tweezers+and+scanning+electron+microscopy.">Protocol to measure the membrane tension and bending modulus of cells using optical tweezers and scanning electron microscopy.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100283 (2021).</li><li>Agero, U., Mesquita, L. G., Neves, B. R., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defocusing+microscopy.">Defocusing microscopy.</a> Microscopy Research and Technique. 65 (3), 159-165 (2004).</li><li>Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+fluctuations+studied+with+defocusing+microscopy.">Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy.</a> Physical Review E. 67 (5), 051904 (2003).</li><li>Roma, P. M. S., Siman, L., Amaral, F. T., Agero, U., Mesquita, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+three-dimensional+imaging+of+phase+objects+using+defocusing+microscopy:+Application+to+red+blood+cells.">Total three-dimensional imaging of phase objects using defocusing microscopy: Application to red blood cells.</a> Applied Physics Letters. 104 (25), 251107 (2014).</li><li>K&#246;hler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+of+illumination+for+photomicrographical+purposes.">New method of illumination for photomicrographical purposes.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 (1894).</li><li>Nans, A., Mohandas, N., Stokes, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+ultrastructure+of+the+red+cell+cytoskeleton+by+cryo-electron+tomography.">Native ultrastructure of the red cell cytoskeleton by cryo-electron tomography.</a> Biophysical Journal. 101 (10), 2341-2350 (2011).</li><li>Ayala, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+properties+of+cells+measured+by+optical+tweezers.">Rheological properties of cells measured by optical tweezers.</a> BMC Biophysics. 9, 5 (2016).</li><li>Ayala, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cytoskeletal+drugs+on+actin+cortex+elasticity.">Effects of cytoskeletal drugs on actin cortex elasticity.</a> Experimental Cell Research. 351 (2), 173-181 (2017).</li></ol>

在该协议中，提出了一种基于光学镊子和散焦显微镜的集成方法，以定量映射RBC的粘弹性。 确定存储和损失剪切模量的结果，以及表征RBC软玻璃流变学的缩放指数。该协议应用于不同的实验条件，例如在生理情况8 或沿着 恶性疟原虫 红细胞内循环9 的每个阶段已经进行。
文献中的参考文献指出了红细胞流变学的差异，部分归因于在?...

成熟的红细胞（RBC），也称为红细胞，在通过人体最窄的毛细血管时能够延长其大小的两倍以上1。这种能力归因于它们在承受外部载荷时独特的变形能力。
近年来，不同的研究在红细胞表面表征了这一特征2，3。描述材料在外部载荷下的弹性和粘性响应的物理领域称为流变学。通常，当施加外力时，产生的变形取决于材料的性质，可分为存储能量的弹性变形或耗散能量的粘性变形4。所有细胞，包括红细胞，都表现出粘弹性行为;换句话说，能量既被储存又被耗散。因此，电池的粘弹性响应可以通过其复剪切模量 G*（ω） = G'（ω） + iG“（ω） 来表征，其中 G' （ω） 是与其弹性行为相关的存储模量，G”（ω） 是与其粘度相关的损耗模量4.此外，现象学模型已被用于描述细胞响应，其中最常用的一种称为软玻璃流变模型5，其特征在于复剪切模量随负载频率的幂律依赖性。
基于单细胞的方法已被采用来表征红细胞的粘弹性，通过施加力和测量位移作为施加载荷的函数2，3。然而，对于复杂的剪切模量，在文献中找不到的结果很少。使用动态光散射，报告的RBC存储和损耗模量值在0.01-1 Pa之间变化，频率范围为1-100 Hz6。通过使用光学磁扭曲细胞术，获得了明显的复合弹性模量7，并且为了比较目的，声称乘法因子可能澄清差异。
最近，建立了一种基于光学镊子（OT）和散焦显微镜（DM）的新方法，作为定量绘制人红细胞在时间依赖性负荷下的剪切模量的存储和损失的集成工具8，9。此外，使用软玻璃流变模型来拟合结果并获得表征红细胞8，9的幂律系数。
总体而言，开发的方法8，9（其协议将在下面详细描述）通过使用形状因子F f的测量值来阐明以前的差异，该测量值将力和变形与RBC表面的应力和应变相关联，并且可以用作一种新的诊断方法，能够定量确定从具有不同血液的个体获得的红细胞的粘弹性参数和软玻璃状特征病症。使用下面描述的方案进行这种表征，可能会为从机械生物学角度理解红细胞的行为开辟新的可能性。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom dishes</td>
			<td>MatTek Life Sciences</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MXA22165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KaleidaGraph</td>
			<td>Synergy Software</td>
			<td>https://www.synergy.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR717805-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T1020CK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT laser</td>
			<td>IPG Photonics</td>
			<td>YLR-5-1064-LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17134-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber ring</td>
			<td>Forever Seals</td>
			<td>NBR O-Ring</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Z273554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage positioning</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-545.3R8S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>P1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of viscoelastic properties of red blood cells using optical tweezers and defocusing microscopy

红细胞的粘弹性性已经通过一系列技术进行了研究。但是，报告的实验数据各不相同。这不仅归因于细胞的正常变异性，还归因于细胞反应方法和模型的差异。在这里，采用使用光学镊子和散焦显微镜的集成协议来获得频率范围为1 Hz至35 Hz的红细胞流变特征。虽然光学镊子用于测量红细胞复合弹性常数，但散焦显微镜能够获得细胞高度分布、体积及其形状因子的参数，该参数允许将复杂的弹性常数转换为复杂的剪切模量。此外，应用软玻璃流变学模型，可以获得两种模量的缩放指数。开发的方法允许探索红细胞的机械行为，表征其粘弹性参数，在明确定义的实验条件下获得，用于几种生理和病理条件。

图 1 显示了用于流变测量的 OT 系统的原理图。图2显示了两个球体的微流变学实验示意图，还显示了代表性的RBC。图3显示了两个球体振幅随时间变化的典型曲线，当正弦运动由压电级产生时。当参考球体（图3 - 红色曲线）随着载物台移动而振荡时，RBC球体（图3 - 蓝色曲线）以不同的?...

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Quantitative Analysis of Viscoelastic Properties of Red Blood Cells Using Optical Tweezers and Defocusing Microscopy

本文描述了一种基于光学镊子和散焦显微镜的集成协议，以测量细胞的流变特性。该方案在研究不同生理病理条件下红细胞的粘弹性特性方面具有广泛的适用性。

使用光学镊子和散焦显微镜定量分析红细胞的粘弹性

The viscoelastic properties of erythrocytes have been investigated by a range of techniques. However, the reported experimental data vary. This is not ...

该方法允许探索红细胞的机械行为，表征其粘弹性参数和几种生理和病理条件下的软玻璃状特征。我们基于单细胞的方法通过使用与力和位移、红细胞表面的应力和刮擦相关的形状因子的金属值来验证视频参考。首先将硅脂倒在橡胶圈表面上，以覆盖整个周边的方式。接下来，将橡胶圈放在盖玻片上，润滑脂面朝向盖玻片。等待五分钟以正确连接，然后样品架准备好接收细胞培养物。接下来，用先前按照书面方案制备的细胞溶液，将细胞接种在样品架中。向样品中加入0.2微升10%体积比的聚苯乙烯球溶液。将第二个盖玻片放在橡胶圈上方。关闭设置并完成样品制备。最后，将整个样品移至显微镜。要从实验开始，请使用OT系统，用OT激光捕获球体，然后将其连接到靠近细胞的盖玻片上。然后，捕获另一个球体并通过将球体压在细胞表面、靠近顶面并靠近细胞边缘来重复相同的附着过程。添加幅度和变化频率的正弦函数。接下来，按下“开始”按钮，使用压电级允许压电位移。将红细胞球体保持在陷阱中，并使用先前设置的正弦函数将样品提交到运动周期中。要进行分析，请打开 ImageJ 软件并导入在正弦运动期间获得的整个电影。单击“调整”，然后选择选项阈值。使用两个滚动条调整阈值，然后单击文件，然后单击矩形来选择参考球体。然后在分析选项卡中，单击设置测量值“并选择质心”选项。在分析选项卡上再次单击，然后选择分析粒子。将出现一个新窗口，其中包含一个以 xy 坐标表示质量中心的表。对附着在 RBC 曲面上的另一个球体重复此过程。打开分析软件，导入之前获取的txt文件。生成质心在 y 轴上，时间在 x 轴上的图。使用 x 轴表示损耗常数（用 K 双素数表示）和 y 轴表示存储常数（用 K 素数表示）在图形上绘制结果。首先，对于视频采集，沿xy方向移动压电平台，使用软件搜索连接到盖玻片的隔离单元。捕获已知直径的聚苯乙烯球并将其附着到RBC表面。接下来，使用压电平台，移动附着在RBC表面上的捕获珠以使细胞变形，然后将珠子连接到盖唇上。现在，更改 z 轴位置以查找聚焦图像。固定位置后，使用相机软件创建整个细胞的电影。然后，将z轴位置向下或向上移动两微米，以获得所选细胞的散焦图像。最后，在不更改z轴位置的情况下，搜索没有单元格的区域以重复相同的过程，并创建图像背景的电影。对于对比度图像采集，首先找到N零的值，单击多边形选择图标，然后单击分析选项卡并选择测量。接下来，使用对比度方程确定 N 图像减去 N 零，并通过在处理下选择 math“，然后减去来执行此操作。之后，将结果除以N零减去B.最后，找到聚焦和散焦图像的对比度。现在，使用哈特利变换获得红细胞厚度。在 ImageJ 中，单击进程，然后单击 FFT“和 FFT 选项，然后选择 FHT。然后通过选择过程执行逆变换FHT，然后选择FFT“和FFT。使用生成的图像获取高度剖面图。找到包含 RBC 高度剖面的图像后，使用两微米散焦对比度在 ImageJ 中创建一组两个图像。要查找外形规格，请使用 ImageJ 自定义宏来分析堆栈。宏将提供一个表，其中包含边缘的位置、周长、周长的反转以及所分析单元格的图像。检查此图像的边缘是否与参考图的边缘相似。否则，请重复该过程，并使用周长反数的总和来查找外形规格。首先在表格中组织实验数据。通过单击文件选项卡在分析软件中创建新表。为参数确定 10 个不同的列。要在分析软件中绘制曲线G素数和G双素数，请使用上表中的数据并单击绘图“按钮。要获取参数 Gamma 和 GM，请单击曲线拟合选项卡并选择 fit1“以打开一个新窗口。选择正方形，单击定义按钮，然后键入公式。单击两个窗口中的“确定”按钮，将出现配件。接下来，创建另外两个图，即 G 素数和 G 双素数作为 omega 的函数。如前所述，仅将误差线放在 y 轴上。重复曲线拟合过程，选择 G“选项。单击“曲线定义”在一般拟合下，然后编写相关方程。最后，单击确定，将出现曲线拟合以及 Alpha 和 G 零的值。再次执行另一个曲线拟合过程。选择G“选项，单击”曲线定义“在一般拟合下，然后编写相关方程。最后，单击“确定”，将出现曲线拟合。该图显示了存储弹性常数与损失弹性常数的函数关系。观察到的线性依赖性表明，红细胞表面可以被认为是一种柔软的玻璃状材料。通过应用整体细胞外形尺寸和 RBC 表面厚度的值，可以确定指数 Alpha 的值。该技术可以为新的诊断方法提供基础，该方法将红细胞粘弹性的变化与具有不同病理的个体血流的改变相关联。

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