Name: quantitative analysis of viscoelastic properties of red blood cells using optical tweezers and defocusing microscopy
Uploaded: 2022-03-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Viscoelastic Properties of Red Blood Cells Using Optical Tweezers and Defocusing Microscopy at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier tous les membres de l’installation de microscopie avancée CENABIO pour leur aide précieuse. Ce travail a été soutenu par les agences brésiliennes Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Code financier 001, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) et Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluidos Complexos (INCT-FCx) ainsi que Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). B.P. a été soutenu par une subvention JCNE de FAPERJ.

Des échantillons de sang humain ont été fournis par des hommes et des femmes adultes volontaires selon les protocoles approuvés par le Comité d’éthique de la recherche de l’Université fédérale de Rio de Janeiro (Protocole 2.889.952) et enregistrés sur la plate-forme brésilienne sous le numéro CAAE 88140418.5.0000.5699. Un formulaire écrit de consentement a été délivré à tous les bénévoles et recueilli auprès d’eux. Les personnes atteintes d’hémoglobinopathie et/ou prenant des médicaments co...

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	<li>Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+erythrocyte+plasma+membrane:+a+Rosetta+Stone+for+decoding+membrane-cytoskeleton+structure.">The human erythrocyte plasma membrane: a Rosetta Stone for decoding membrane-cytoskeleton structure.</a> Current Topics in Membranes. 72, 39-88 (2013).</li><li>Tomaiuolo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+properties+of+red+blood+cells+in+health+and+disease+towards+microfluidics.">Biomechanical properties of red blood cells in health and disease towards microfluidics.</a> Biomicrofluidics. 8 (5), 051501 (2014).</li><li>Depond, M., Henry, B., Buffet, P., Ndour, P. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+ultrastructure+of+the+red+cell+cytoskeleton+by+cryo-electron+tomography.">Native ultrastructure of the red cell cytoskeleton by cryo-electron tomography.</a> Biophysical Journal. 101 (10), 2341-2350 (2011).</li><li>Ayala, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+properties+of+cells+measured+by+optical+tweezers.">Rheological properties of cells measured by optical tweezers.</a> BMC Biophysics. 9, 5 (2016).</li><li>Ayala, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cytoskeletal+drugs+on+actin+cortex+elasticity.">Effects of cytoskeletal drugs on actin cortex elasticity.</a> Experimental Cell Research. 351 (2), 173-181 (2017).</li></ol>

Dans ce protocole, une méthode intégrée basée sur des pinces optiques et une microscopie à défocalisation est présentée pour cartographier quantitativement les propriétés viscoélastiques des globules rouges. Les résultats pour les modules de cisaillement de stockage et de perte, ainsi que l’exposant de mise à l’échelle qui caractérise la rhéologie vitreuse molle des globules rouges sont déterminés. L’application de ce protocole pour différentes conditions expérimentales, telles que dans la situa...

Les globules rouges matures (GR), également appelés érythrocytes, sont capables de s’étendre plus de deux fois leur taille lorsqu’ils traversent les capillaires les plus étroits du corps humain1. Cette capacité est attribuée à leur capacité unique à se déformer lorsqu’ils sont soumis à des charges externes.
Au cours des dernières années, différentes études ont caractérisé cette caractéristique dans les surfaces de globules rouges 2,3. Le domaine de la physique qui décrit les réponses élastiques et visqueuses des matériaux dues aux charges externes est appelé rhéologie. En général, lorsqu’une force externe est appliquée, la déformation résultante dépend des propriétés du matériau et peut être divisée en déformations élastiques, qui stockent de l’énergie, ou déformations visqueuses, qui dissipent l’énergie4. Toutes les cellules, y compris les globules rouges, présentent un comportement viscoélastique; En d’autres termes, l’énergie est à la fois stockée et dissipée. La réponse viscoélastique d’une cellule peut ainsi être caractérisée par son module de cisaillement complexe G*(ω) = G'(ω) + iG"(ω), où G'(ω) est le module de stockage, lié au comportement élastique, et G » (ω) est le module de perte, lié à sa viscosité4. De plus, des modèles phénoménologiques ont été utilisés pour décrire les réponses cellulaires, l’un des plus utilisés est appelé le modèle de rhéologie vitreusedouce 5, caractérisé par une dépendance de la loi de puissance du module de cisaillement complexe avec la fréquence de charge.
Des méthodes à cellule unique ont été utilisées pour caractériser les propriétés viscoélastiques des globules rouges, en appliquant une force et en mesurant le déplacement en fonction de la charge imposée 2,3. Cependant, pour le module de cisaillement complexe, peu de résultats peuvent être trouvés dans la littérature. En utilisant la diffusion dynamique de la lumière, les valeurs des modules de stockage et de perte de globules rouges ont été rapportées variant de 0,01 à 1 Pa, dans la gamme de fréquences de 1 à 100 Hz6. En utilisant la cytométrie optique de torsion magnétique, un module d’élasticité complexe apparent a été obtenu7, et à des fins de comparaison, un facteur multiplicatif a été revendiqué pour éventuellement clarifier les écarts.
Plus récemment, une nouvelle méthodologie basée sur les pinces optiques (OT) ainsi que la microscopie de défocalisation (DM), en tant qu’outil intégré pour cartographier quantitativement le stockage et la perte des modules de cisaillement des érythrocytes humains sur des charges dépendantes du temps, a été établie 8,9. De plus, un modèle de rhéologie vitreuse souple a été utilisé pour ajuster les résultats et obtenir un coefficient de loi de puissance qui caractérise les globules rouges 8,9.
Dans l’ensemble, la méthodologie développée8,9, dont le protocole est décrit en détail ci-dessous, clarifie les divergences précédentes en utilisant les valeurs mesurées pour le facteur de forme, Ff, qui relie les forces et les déformations aux contraintes et aux déformations dans la surface des globules rouges et peut être utilisée comme nouvelle méthode de diagnostic capable de déterminer quantitativement les paramètres viscoélastiques et les caractéristiques vitreuses molles des globules rouges obtenus à partir de personnes ayant du sang différent. Pathologies. Une telle caractérisation, à l’aide du protocole décrit ci-dessous, peut ouvrir de nouvelles possibilités pour comprendre le comportement des globules rouges d’un point de vue mécanobiologique.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom dishes</td>
			<td>MatTek Life Sciences</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MXA22165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KaleidaGraph</td>
			<td>Synergy Software</td>
			<td>https://www.synergy.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR717805-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T1020CK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT laser</td>
			<td>IPG Photonics</td>
			<td>YLR-5-1064-LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17134-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber ring</td>
			<td>Forever Seals</td>
			<td>NBR O-Ring</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Z273554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage positioning</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-545.3R8S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>P1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of viscoelastic properties of red blood cells using optical tweezers and defocusing microscopy

Les propriétés viscoélastiques des érythrocytes ont été étudiées par une gamme de techniques. Cependant, les données expérimentales rapportées varient. Ceci n’est pas seulement attribué à la variabilité normale des cellules, mais aussi aux différences dans les méthodes et les modèles de réponse cellulaire. Ici, un protocole intégré utilisant des pinces optiques et une microscopie défocalisante est utilisé pour obtenir les caractéristiques rhéologiques des globules rouges dans la gamme de fréquences de 1 Hz à 35 Hz. Alors que des pincettes optiques sont utilisées pour mesurer la constante élastique du complexe érythrocytaire, la microscopie de défocalisation est capable d’obtenir le profil de hauteur de la cellule, le volume et son facteur de forme, un paramètre qui permet la conversion de la constante élastique complexe en module de cisaillement complexe. De plus, en appliquant un modèle de rhéologie vitreuse douce, l’exposant de mise à l’échelle pour les deux modules peut être obtenu. La méthodologie développée permet d’explorer le comportement mécanique des globules rouges, en caractérisant leurs paramètres viscoélastiques, obtenus dans des conditions expérimentales bien définies, pour plusieurs conditions physiologiques et pathologiques.

La figure 1 représente les schémas du système OT utilisé pour les mesures rhéologiques. La figure 2 montre les schémas de l’expérience de microrhéologie avec les deux sphères et une CRE représentative est également montrée. La figure 3 montre une courbe typique des amplitudes des deux sphères en fonction du temps où les mouvements sinusoïdaux sont produits par l’étage piézoélectrique. Alors que la sphère de r?...

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Quantitative Analysis of Viscoelastic Properties of Red Blood Cells Using Optical Tweezers and Defocusing Microscopy

Ici, un protocole intégré basé sur des pinces optiques et une microscopie de défocalisation est décrit pour mesurer les propriétés rhéologiques des cellules. Ce protocole a une large applicabilité dans l’étude des propriétés viscoélastiques des érythrocytes dans des conditions physiopathologiques variables.

Analyse quantitative des propriétés viscoélastiques des globules rouges à l’aide de pinces optiques et de microscopie à défocalisation

The viscoelastic properties of erythrocytes have been investigated by a range of techniques. However, the reported experimental data vary. This is not ...

Cette méthodologie permet d’explorer le comportement mécanique des érythrocytes, en caractérisant leurs paramètres viscoélastiques et leurs caractéristiques vitreuses molles pour plusieurs conditions physiologiques et pathologiques. Notre méthode basée sur une seule cellule vérifie les références vidéo en utilisant les valeurs métalliques pour le facteur de forme qui relie les forces et les déplacements, les contraintes et les éraflures dans la surface érythrocytes. Commencez par verser de la graisse de silicone sur la surface de l’anneau en caoutchouc de manière à couvrir tout le périmètre.Ensuite, placez l’anneau en caoutchouc sur le couvercle avec le côté gras face au couvercle. Attendez cinq minutes pour une fixation correcte, et les détenteurs d’échantillons sont alors prêts à recevoir la culture cellulaire. Ensuite, avec la solution de cellules préalablement préparée suivant le protocole écrit, ensemencez les cellules dans le porte-échantillon.Ajouter 0,2 microlitre d’une solution de sphère de polystyrène à 10 % en volume à l’échantillon. Placez le deuxième couvercle au-dessus de l’anneau en caoutchouc. Fermez la configuration et terminez la préparation de l’échantillon.Enfin, déplacez l’échantillon entier au microscope. Pour commencer l’expérimentation, utilisez le système OT, piégez la sphère avec le laser OT, puis fixez-la à la lamelle de couverture, près de la cellule. Ensuite, interceptez une autre sphère et répétez la même procédure de fixation en appuyant la sphère contre la surface de la cellule, près de la surface supérieure et près du bord de la cellule.Ajouter une fonction sinusoïdale d’amplitude et de fréquences variables. Ensuite, appuyez sur le bouton « start », en utilisant l’étage piézoélectrique pour permettre le déplacement piézoélectrique. Gardez la sphère de globule rouge dans le piège et soumettez l’échantillon à un cycle de mouvements en utilisant la fonction sinusoïdale précédemment définie.Pour l’analyse, ouvrez le logiciel ImageJ et importez le film entier obtenu lors des mouvements sinusoïdaux. Cliquez sur Ajuster, puis sélectionnez le seuil d’option. Ajustez le seuil avec les deux barres de défilement et sélectionnez la sphère de référence en cliquant sur fichier, suivi d’un rectangle.Ensuite, dans l’onglet analyser, cliquez sur l’option « définir les mesures"et sélectionnez le centre de masse ». Cliquez à nouveau sur l’onglet Analyser et sélectionnez Analyser les particules. Une nouvelle fenêtre contenant un tableau avec les coordonnées xy pour le centre de la masse apparaîtra.Répétez la procédure pour l’autre sphère fixée à la surface RBC. Ouvrez le logiciel d’analyse et importez les fichiers txt précédemment obtenus. Générez un tracé avec les centres de masse sur l’axe des y et le temps sur l’axe des abscisses.Tracez les résultats sur un graphique en utilisant l’axe des x pour la constante de perte, noté K double nombre, et l’axe des y pour la constante de stockage, noté K premier. Tout d’abord, pour l’acquisition vidéo, déplacez l’étage piézoélectrique dans la direction xy, en utilisant le logiciel pour rechercher une cellule isolée attachée à la lame. Pièger et fixer une sphère de polystyrène de diamètre connu à la surface des globules rouges.Ensuite, à l’aide de l’étage piézoélectrique, déplacez le cordon piégé attaché à la surface de la globule rouge pour déformer la cellule, puis fixez le cordon à la lèvre de couverture. Maintenant, changez la position de l’axe z pour trouver l’image nette. Après avoir fixé la position, utilisez le logiciel de la caméra pour créer un film de la cellule entière.Ensuite, déplacez la position de l’axe z de deux micromètres vers le bas ou vers le haut pour obtenir une image défocalisée pour la cellule choisie. Enfin, sans modifier la position de l’axe z, recherchez une région sans cellules pour répéter la même procédure et créez un film de l’arrière-plan de l’image. Pour l’acquisition d’images de contraste, recherchez d’abord la valeur de N zéro, cliquez sur l’icône de sélection de polygone, puis cliquez sur l’onglet analyser et sélectionnez mesure.Ensuite, utilisez l’équation de contraste pour déterminer N image moins N zéro, et exécutez-la en sélectionnant math"under process, puis soustraire. Plus tard, divisez le résultat par N zéro moins B.Enfin, trouvez le contraste pour les images focalisées et défocalisées. Maintenant, utilisez la transformée de Hartley pour obtenir l’épaisseur RBC.Dans ImageJ, cliquez sur processus, suivi des options FFT et FFT, puis choisissez FHT. Effectuez ensuite la transformation inverse FHT en sélectionnant processus, suivi de FFT"et FFT. Utilisez l’image résultante pour obtenir le profil de hauteur.Après avoir trouvé l’image qui contient le profil de hauteur RBC, utilisez le contraste flou de deux micromètres pour créer un ensemble de deux images dans ImageJ. Pour trouver le facteur de forme, utilisez une macro personnalisée ImageJ pour analyser la pile. La macro fournit un tableau avec la position de l’arête, le périmètre, l’inverse du périmètre et une image de la cellule analysée.Vérifiez si les bords de cette image sont similaires à ceux de la figure de référence. Sinon, répétez la procédure et utilisez la somme de l’inverse du périmètre pour trouver le facteur de forme. Commencez par organiser les données expérimentales dans un tableau.Créez une nouvelle table dans le logiciel d’analyse en cliquant sur l’onglet fichier. Déterminez 10 colonnes différentes pour les paramètres. Pour tracer la courbe G nombre premier et G double nombre premier dans le logiciel d’analyse, utilisez les données du tableau précédent et cliquez sur le bouton plot.Pour obtenir les paramètres Gamma et GM, cliquez sur l’onglet ajustement de la courbe et sélectionnez fit1"pour ouvrir une nouvelle fenêtre. Sélectionnez le carré, cliquez sur le bouton Définir et tapez l’équation. Cliquez sur le bouton « OK » dans les deux fenêtres, et le raccord apparaîtra.Ensuite, créez deux autres tracés, à savoir G premier et G double nombre premier en fonction de l’oméga. Placez les barres d’erreur uniquement sur l’axe y, comme illustré précédemment. Répétez la procédure d’ajustement de courbe, sélectionnez G"option.Cliquez sur Définition de la courbe » sous ajustement général, puis écrivez l’équation concernée. Enfin, cliquez sur OK, et un ajustement de courbe apparaîtra avec les valeurs pour Alpha et G zéro. Encore une fois, effectuez une autre procédure d’ajustement de courbe.Sélectionnez G"option, cliquez sur définition de courbe"sous ajustement général, puis écrivez l’équation concernée. Enfin, cliquez sur OK et un ajustement de courbe apparaîtra. La figure montre la constante élastique de stockage en fonction de la constante élastique de perte.La dépendance linéaire observée démontre que la surface des globules rouges peut être considérée comme un matériau vitreux souple. En appliquant les valeurs du facteur de forme global de la cellule et de l’épaisseur de surface des globules rouges, les valeurs de l’exposant Alpha peuvent être déterminées. Cette technique peut fournir la base de nouvelles méthodes de diagnostic qui corrélent les changements dans les propriétés viscoélastiques des érythrocytes avec des modifications du flux sanguin d’individus atteints de pathologies différentes.

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