Name: quantitative analysis of viscoelastic properties of red blood cells using optical tweezers and defocusing microscopy
Uploaded: 2022-03-25T14:30:00
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Die Autoren bedanken sich bei allen Mitgliedern der CENABIO Advanced Microscopy Facility für ihre wichtige Hilfe. Diese Arbeit wurde von den brasilianischen Agenturen Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Financial Code 001, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) und Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluidos Complexos (INCT-FCx) zusammen mit der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) unterstützt. B.P. wurde durch ein JCNE-Stipendium von FAPERJ unterstützt.

Menschliche Blutproben wurden von erwachsenen Männern und Frauen gemäß den von der Forschungsethikkommission der Bundesuniversität von Rio de Janeiro genehmigten Protokollen (Protokoll 2.889.952) zur Verfügung gestellt und auf der brasilianischen Plattform unter der CAAE-Nummer 88140418.5.0000.5699 registriert. Allen Freiwilligen wurde eine schriftliche Einverständniserklärung erteilt und von ihnen eingeholt. Personen mit einer Hämoglobinopathie und/oder der Einnahme kontrollierter Medikamente wurden ausgeschloss...

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cytoskeletal+drugs+on+actin+cortex+elasticity.">Effects of cytoskeletal drugs on actin cortex elasticity.</a> Experimental Cell Research. 351 (2), 173-181 (2017).</li></ol>

In diesem Protokoll wird eine integrierte Methode vorgestellt, die auf einer optischen Pinzette und Defokussierungsmikroskopie basiert, um die viskoelastischen Eigenschaften von Erythrozyten quantitativ abzubilden. Die Ergebnisse für die Speicher- und Verlustschermodule sowie der Skalierungsexponent, der die weiche Glasrheologie von Erythrozyten charakterisiert, werden bestimmt. Die Anwendung dieses Protokolls für verschiedene experimentelle Bedingungen, wie z.B. in physiologischer Situation8 od...

Reife rote Blutkörperchen (RBCs), auch Erythrozyten genannt, sind in der Lage, sich mehr als doppelt so groß auszudehnen, wenn sie die engsten Kapillaren des menschlichen Körpers passieren1. Diese Fähigkeit wird auf ihre einzigartige Fähigkeit zurückgeführt, sich bei äußeren Belastungen zu verformen.
In den letzten Jahren haben verschiedene Studien dieses Merkmal in Erythrozytenoberflächencharakterisiert 2,3. Das Gebiet der Physik, das die elastischen und viskosen Reaktionen von Materialien aufgrund äußerer Belastungen beschreibt, wird als Rheologie bezeichnet. Wenn eine äußere Kraft ausgeübt wird, hängt die resultierende Verformung im Allgemeinen von den Eigenschaften des Materials ab und kann in elastische Verformungen, die Energie speichern, oder viskose Verformungen, die Energie abführen, unterteilt werden4. Alle Zellen, einschließlich der Erythrozyten, zeigen ein viskoelastisches Verhalten; Mit anderen Worten: Energie wird sowohl gespeichert als auch abgeführt. Die viskoelastische Reaktion einer Zelle kann somit durch ihren komplexen Schermodul G*(ω) = G'(ω) + iG"(ω) charakterisiert werden, wobei G' (ω) der Speichermodul ist, bezogen auf das elastische Verhalten, und G" (ω) der Verlustmodul, bezogen auf ihre Viskosität4. Darüber hinaus wurden phänomenologische Modelle verwendet, um Zellantworten zu beschreiben, eines der am häufigsten verwendeten ist das weiche Glasrheologiemodell5, das durch eine Potenzgesetzabhängigkeit des komplexen Schermoduls mit der Lastfrequenz gekennzeichnet ist.
Einzelzellbasierte Methoden wurden verwendet, um die viskoelastischen Eigenschaften von Erythrozyten zu charakterisieren, indem Kraft aufgebracht und die Verschiebung in Abhängigkeit von der Nutzlast gemessen wurde 2,3. Für den komplexen Schubmodul finden sich in der Literatur jedoch nur wenige Ergebnisse. Mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung wurden Werte für die Erythrozytenspeicherung und die Verlustmodule im Frequenzbereich von 1-100 Hz6 berichtet, die zwischen 0,01 und 1 Pa lagen. Mit Hilfe der optischen magnetischen Verdrillungszytometrie wurde ein scheinbarer komplexer Elastizitätsmodul7 erhalten, und zu Vergleichszwecken wurde ein multiplikativer Faktor beansprucht, um die Diskrepanzen möglicherweise zu klären.
In jüngerer Zeit wurde eine neue Methodik entwickelt, die auf einer optischen Pinzette (OT) zusammen mit der Defokussierungsmikroskopie (DM) als integriertes Werkzeug zur quantitativen Kartierung der Speicherung und des Verlusts von Schermodulen menschlicher Erythrozyten über zeitabhängige Belastungen basiert 8,9. Darüber hinaus wurde ein weiches, glasartiges Rheologiemodell verwendet, um die Ergebnisse anzupassen und einen Potenzgesetzkoeffizienten zu erhalten, der die Erythrozyten charakterisiert 8,9.
Insgesamt klärt die entwickelte Methodik8,9, deren Protokoll im Folgenden ausführlich beschrieben wird, bisherige Diskrepanzen durch die Verwendung der Messwerte für den Formfaktor Ff, der Kräfte und Verformungen mit Spannungen und Dehnungen in der Erythrozytenoberfläche in Beziehung setzt und als neuartiges diagnostisches Verfahren verwendet werden kann, das in der Lage ist, die viskoelastischen Parameter und weichglasigen Merkmale von Erythrozyten quantitativ zu bestimmen, die von Personen mit unterschiedlichem Blut erhalten wurden Pathologien. Eine solche Charakterisierung unter Verwendung des unten beschriebenen Protokolls könnte neue Möglichkeiten eröffnen, das Verhalten von Erythrozyten aus mechanobiologischer Sicht zu verstehen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom dishes</td>
			<td>MatTek Life Sciences</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MXA22165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KaleidaGraph</td>
			<td>Synergy Software</td>
			<td>https://www.synergy.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR717805-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T1020CK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT laser</td>
			<td>IPG Photonics</td>
			<td>YLR-5-1064-LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17134-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber ring</td>
			<td>Forever Seals</td>
			<td>NBR O-Ring</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Z273554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage positioning</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-545.3R8S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>P1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of viscoelastic properties of red blood cells using optical tweezers and defocusing microscopy

Die viskoelastischen Eigenschaften von Erythrozyten wurden mit einer Reihe von Techniken untersucht. Die berichteten experimentellen Daten variieren jedoch. Dies wird nicht nur auf die normale Variabilität der Zellen zurückgeführt, sondern auch auf die Unterschiede in den Methoden und Modellen der Zellantwort. Hier wird ein integriertes Protokoll mit optischer Pinzette und Defokussierungsmikroskopie verwendet, um die rheologischen Eigenschaften roter Blutkörperchen im Frequenzbereich von 1 Hz bis 35 Hz zu erhalten. Während optische Pinzetten verwendet werden, um die elastische Konstante des Erythrozytenkomplexes zu messen, ist die Defokussierungsmikroskopie in der Lage, das Zellhöhenprofil, das Volumen und den Formfaktor zu ermitteln, einen Parameter, der die Umwandlung der komplexen elastischen Konstante in einen komplexen Schermodul ermöglicht. Darüber hinaus kann durch Anwendung eines Weichglas-Rheologiemodells der Skalierungsexponent für beide Module erhalten werden. Die entwickelte Methodik ermöglicht es, das mechanische Verhalten roter Blutkörperchen zu untersuchen und ihre viskoelastischen Parameter zu charakterisieren, die unter genau definierten experimentellen Bedingungen für verschiedene physiologische und pathologische Bedingungen ermittelt wurden.

Abbildung 1 zeigt die schematische Darstellung des OT-Systems, das für die Rheologiemessungen verwendet wird. Abbildung 2 zeigt die schematische Darstellung des Mikrorheologie-Experiments mit beiden Kugeln und ein repräsentatives RBC. Abbildung 3 zeigt eine typische Kurve für die Amplituden beider Kugeln in Abhängigkeit von der Zeit, wenn die sinusförmigen Bewegungen von der piezoelektrischen Stufe erzeugt werden. Während die ...

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Quantitative Analysis of Viscoelastic Properties of Red Blood Cells Using Optical Tweezers and Defocusing Microscopy

Hier wird ein integriertes Protokoll beschrieben, das auf einer optischen Pinzette und Defokussierungsmikroskopie basiert, um die rheologischen Eigenschaften von Zellen zu messen. Dieses Protokoll ist breit anwendbar bei der Untersuchung der viskoelastischen Eigenschaften von Erythrozyten unter variablen physiopathologischen Bedingungen.

Quantitative Analyse der viskoelastischen Eigenschaften roter Blutkörperchen mittels optischer Pinzette und Defokussierungsmikroskopie

The viscoelastic properties of erythrocytes have been investigated by a range of techniques. However, the reported experimental data vary. This is not ...

Diese Methodik ermöglicht es, das mechanische Verhalten von Erythrozyten zu untersuchen und ihre viskoelastischen Parameter und weichglasartigen Eigenschaften für verschiedene physiologische und pathologische Bedingungen zu charakterisieren. Unsere einzelzellbasierte Methode verifiziert Videoreferenzen, indem sie die Metallwerte für den Formfaktor verwendet, der Kräfte und Verschiebungen, die Spannungen und Kratzer in der Erythrozytenoberfläche in Beziehung setzt. Beginnen Sie damit, Silikonfett so über die Oberfläche des Gummirings zu gießen, dass der gesamte Umfang bedeckt ist.Legen Sie als Nächstes den Gummiring mit der Fettseite zum Deckglas auf das Deckglas. Warten Sie fünf Minuten auf die ordnungsgemäße Befestigung, und die Probenhalter sind dann bereit, die Zellkultur zu erhalten. Als nächstes werden die Zellen mit der Lösung der zuvor nach dem schriftlichen Protokoll hergestellten Zellen in den Probenhalter eingesät.Fügen Sie der Probe 0,2 Mikroliter einer 10-prozentigen Polystyrolkugellösung hinzu. Legen Sie das zweite Deckglas über den Gummiring. Schließen Sie das Setup und beenden Sie die Probenvorbereitung.Zum Schluss legen Sie die gesamte Probe in das Mikroskop. Um mit dem Experimentieren zu beginnen, verwenden Sie das OT-System, fangen Sie die Kugel mit dem OT-Laser ein und befestigen Sie sie dann am Deckglas in der Nähe der Zelle. Fangen Sie dann eine andere Kugel ein und wiederholen Sie den gleichen Anbringungsvorgang, indem Sie die Kugel gegen die Zelloberfläche, nahe der Oberseite und nahe am Zellrand drücken.Fügen Sie eine sinusförmige Funktion der Amplitude und der variierenden Frequenzen hinzu. Drücken Sie anschließend die "Start"-Taste und verwenden Sie den piezoelektrischen Tisch, um die piezoelektrische Verschiebung zuzulassen. Lassen Sie die RBC-Kugel in der Falle und unterziehen Sie die Probe einem Bewegungszyklus mit der zuvor eingestellten Sinusfunktion.Öffnen Sie zur Analyse die ImageJ-Software und importieren Sie den gesamten Film, der während der sinusförmigen Bewegungen aufgenommen wurde. Klicken Sie auf Anpassen und wählen Sie dann den Optionsschwellenwert. Passen Sie den Schwellenwert mit beiden Bildlaufleisten an und wählen Sie die Referenzkugel aus, indem Sie auf Datei und dann auf Rechteck klicken.Klicken Sie dann auf der Registerkarte "Analysieren" auf Messungen festlegen"und wählen Sie den Massenmittelpunkt"Möglichkeit. Klicken Sie erneut auf die Registerkarte "Analysieren" und wählen Sie "Partikel analysieren". Es erscheint ein neues Fenster mit einer Tabelle mit XY-Koordinaten für den Massenmittelpunkt.Wiederholen Sie den Vorgang für die andere Kugel, die an der RBC-Oberfläche befestigt ist. Öffnen Sie die Analysesoftware und importieren Sie die zuvor erhaltenen txt-Dateien. Generieren Sie ein Diagramm mit den Massenschwerpunkten auf der y-Achse und der Zeit auf der x-Achse.Stellen Sie die Ergebnisse in einem Diagramm dar, indem Sie die x-Achse für die Verlustkonstante, die mit der doppelten Primzahl K gekennzeichnet ist, und die y-Achse für die Speicherkonstante, die mit der Primzahl K bezeichnet wird, verwenden. Bewegen Sie zunächst für die Videoaufnahme den piezoelektrischen Tisch in xy-Richtung und suchen Sie mit der Software nach einer isolierten Zelle, die am Deckglas befestigt ist. Fangen Sie eine Styroporkugel mit bekanntem Durchmesser ein und befestigen Sie sie an der Erythrozytenoberfläche.Bewegen Sie als Nächstes mit dem piezoelektrischen Tisch die eingeschlossene Perle, die an der RBC-Oberfläche befestigt ist, um die Zelle zu verformen, und befestigen Sie dann die Perle an der Abdecklippe. Ändern Sie nun die Position der Z-Achse, um das fokussierte Bild zu finden. Nachdem Sie die Position festgelegt haben, verwenden Sie die Kamerasoftware, um einen Film der gesamten Zelle zu erstellen.Verschieben Sie dann die Position der Z-Achse um zwei Mikrometer nach unten oder oben, um ein unscharfes Bild für die ausgewählte Zelle zu erhalten. Suchen Sie schließlich, ohne die Position der Z-Achse zu ändern, nach einem Bereich ohne Zellen, um den gleichen Vorgang zu wiederholen, und erstellen Sie einen Film des Bildhintergrunds. Suchen Sie für die Kontrastbildaufnahme zuerst den Wert von N Null, klicken Sie auf das Polygonauswahlsymbol, klicken Sie dann auf die Registerkarte "Analysieren" und wählen Sie "Messen".Verwenden Sie als Nächstes die Kontrastgleichung, um N Bild minus N Null zu bestimmen, und führen Sie dies aus, indem Sie math"under process, gefolgt von subtract" auswählen. Teilen Sie später das Ergebnis durch N, Null minus B.Finden Sie schließlich den Kontrast für die fokussierten und unscharfen Bilder. Verwenden Sie nun die Hartley-Transformation, um die RBC-Dicke zu erhalten.Klicken Sie in ImageJ auf "Prozess", gefolgt von "FFT"und FFT-Optionen, und wählen Sie dann FHT. Führen Sie dann die inverse Transformation FHT durch, indem Sie Prozess auswählen, gefolgt von FFT" und FFT. Verwenden Sie das resultierende Bild, um das Höhenprofil zu erhalten.Nachdem Sie das Bild gefunden haben, das das RBC-Höhenprofil enthält, verwenden Sie den defokussierten Kontrast von zwei Mikrometern, um einen Satz von zwei Bildern in ImageJ zu erstellen. Um den Formfaktor zu finden, verwenden Sie ein benutzerdefiniertes ImageJ-Makro, um den Stapel zu analysieren. Das Makro liefert eine Tabelle mit der Position der Kante, dem Umfang, der Umkehrung des Umfangs und einem Bild der analysierten Zelle.Prüfen Sie, ob die Kanten dieses Bildes den Kanten der Referenzfigur ähneln. Wiederholen Sie andernfalls den Vorgang, und verwenden Sie die Summe der Umkehrung des Umfangs, um den Formfaktor zu ermitteln. Beginnen Sie damit, die experimentellen Daten in einer Tabelle zu organisieren.Erstellen Sie eine neue Tabelle in der Analysesoftware, indem Sie auf den Reiter Datei klicken. Bestimmen Sie 10 verschiedene Spalten für die Parameter. Um die Kurve G prime und G double prime in der Analysesoftware darzustellen, verwenden Sie die Daten aus der vorherigen Tabelle und klicken Sie auf die Schaltfläche "Plot".Um die Parameter Gamma und GM zu erhalten, klicken Sie auf die Registerkarte Kurvenanpassung und wählen Sie fit1", um ein neues Fenster zu öffnen. Wählen Sie das Quadrat aus, klicken Sie auf die Schaltfläche "Definieren" und geben Sie die Gleichung ein. Klicken Sie in beiden Fenstern auf die Schaltfläche "okay", und die Armatur wird angezeigt.Erstellen Sie als Nächstes zwei weitere Diagramme, nämlich G prime und G double prime als Funktion von omega. Platzieren Sie die Fehlerbalken nur auf der y-Achse, wie zuvor gezeigt. Wiederholen Sie den Kurvenanpassungsvorgang und wählen Sie die Option G.Klicken Sie unter "Allgemeine Anpassung" auf "Kurvendefinition" und schreiben Sie dann die betreffende Gleichung. Klicken Sie abschließend auf OK, und eine Kurvenanpassung wird zusammen mit den Werten für Alpha und G Null angezeigt. Führen Sie erneut eine Kurvenanpassung durch.Wählen Sie G"Option, klicken Sie auf Kurvendefinition" unter Allgemeine Anpassung und schreiben Sie dann die betreffende Gleichung. Klicken Sie abschließend auf OK, und eine Kurvenanpassung wird angezeigt. Die Abbildung zeigt die speicherelastische Konstante in Abhängigkeit von der verlustelastischen Konstante.Die beobachtete lineare Abhängigkeit zeigt, dass die Erythrozytenoberfläche als weiches, glasartiges Material betrachtet werden kann. Durch Anwendung der Werte für den Gesamtzellformfaktor und die RBC-Oberflächendicke können die Werte für den Exponenten Alpha bestimmt werden. Diese Technik könnte die Grundlage für neuartige diagnostische Methoden bilden, die Veränderungen der viskoelastischen Eigenschaften von Erythrozyten mit Veränderungen des Blutflusses von Personen mit unterschiedlichen Pathologien korrelieren.

Research

JoVE Journal

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