Name: quantitative analysis of viscoelastic properties of red blood cells using optical tweezers and defocusing microscopy
Uploaded: 2022-03-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Viscoelastic Properties of Red Blood Cells Using Optical Tweezers and Defocusing Microscopy at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri della struttura di microscopia avanzata CENABIO per l'importante aiuto. Questo lavoro è stato sostenuto dalle agenzie brasiliane Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Financial Code 001, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluidos Complexos (INCT-FCx) insieme a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). B.P. è stato sostenuto da una sovvenzione JCNE di FAPERJ.

I campioni di sangue umano sono stati forniti da volontari adulti uomini e donne secondo i protocolli approvati dal Comitato Etico di Ricerca dell'Università Federale di Rio de Janeiro (Protocollo 2.889.952) e registrati nella piattaforma brasiliana con il numero CAAE 88140418.5.0000.5699. Una forma scritta di consenso è stata rilasciata e raccolta da tutti i volontari. Sono stati esclusi quelli con emoglobinopatia e/o assunzione di farmaci controllati. L'intero processo ha seguito le linee guida approvate dal comitato...

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In questo protocollo, viene presentato un metodo integrato basato su pinzette ottiche e microscopia di defocalizzazione per mappare quantitativamente le proprietà viscoelastiche dei globuli rossi. Vengono determinati i risultati per i moduli di taglio di stoccaggio e perdita, insieme all'esponente di scala che caratterizza la reologia vetrosa morbida dei globuli rossi. L'applicazione di questo protocollo per diverse condizioni sperimentali, come nella situazione fisiologica8 o lungo ogni stadio<s...

I globuli rossi maturi (RBC), noti anche come eritrociti, sono in grado di estendersi più del doppio delle loro dimensioni quando passano attraverso i capillari più stretti del corpo umano1. Tale capacità è attribuita alla loro capacità unica di deformarsi quando sottoposta a carichi esterni.
Negli ultimi anni, diversi studi hanno caratterizzato questa caratteristica nelle superfici RBC 2,3. L'area della fisica che descrive le risposte elastiche e viscose dei materiali dovute a carichi esterni è chiamata reologia. In generale, quando viene applicata una forza esterna, la deformazione risultante dipende dalle proprietà del materiale e può essere suddivisa in deformazioni elastiche, che immagazzinano energia, o deformazioni viscose, che dissipano energia4. Tutte le cellule, compresi i globuli rossi, mostrano un comportamento viscoelastico; In altre parole, l'energia viene immagazzinata e dissipata. La risposta viscoelastica di una cellula può quindi essere caratterizzata dal suo modulo di taglio complesso G*(ω) = G'(ω) + iG"(ω), dove G' (ω) è il modulo di accumulo, correlato al comportamento elastico, e G" (ω) è il modulo di perdita, correlato alla sua viscosità4. Inoltre, sono stati utilizzati modelli fenomenologici per descrivere le risposte cellulari, uno dei più utilizzati è chiamato il modello 5 di reologia vetrosa morbida, caratterizzato da una dipendenza dalla legge di potenza del modulo di taglio complesso con la frequenza di carico.
Sono stati impiegati metodi basati su singole cellule per caratterizzare le proprietà viscoelastiche dei globuli rossi, applicando forza e misurando lo spostamento in funzione del carico imposto 2,3. Tuttavia, per il complesso modulo di taglio, pochi risultati possono essere trovati in letteratura. Utilizzando la diffusione dinamica della luce, sono stati riportati valori per i moduli di stoccaggio e perdita di RBC variabili da 0,01-1 Pa, nella gamma di frequenza 1-100 Hz6. Utilizzando la citometria a torsione magnetica ottica, è stato ottenuto un modulo elastico complesso apparente7 e, a scopo di confronto, è stato affermato un fattore moltiplicativo per chiarire eventualmente le discrepanze.
Più recentemente, è stata stabilita una nuova metodologia basata su pinzette ottiche (OT) insieme alla microscopia di defocalizzazione (DM), come strumento integrato per mappare quantitativamente l'immagazzinamento e la perdita dei moduli di taglio degli eritrociti umani su carichi dipendenti dal tempo 8,9. Inoltre, è stato utilizzato un modello reologico vetroso morbido per adattarsi ai risultati e ottenere un coefficiente di legge di potenza che caratterizza i globuli rossi 8,9.
Nel complesso, la metodologia sviluppata8,9, il cui protocollo è descritto in dettaglio di seguito, chiarisce le precedenti discrepanze utilizzando i valori misurati per il fattore di forma, Ff, che mette in relazione forze e deformazioni con sollecitazioni e deformazioni nella superficie dei globuli rossi e può essere utilizzato come nuovo metodo diagnostico in grado di determinare quantitativamente i parametri viscoelastici e le caratteristiche vetrose morbide dei globuli rossi ottenuti da individui con sangue diverso Patologie. Tale caratterizzazione, utilizzando il protocollo descritto di seguito, può aprire nuove possibilità per comprendere il comportamento dei globuli rossi da una prospettiva meccanobiologica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom dishes</td>
			<td>MatTek Life Sciences</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MXA22165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KaleidaGraph</td>
			<td>Synergy Software</td>
			<td>https://www.synergy.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR717805-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T1020CK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT laser</td>
			<td>IPG Photonics</td>
			<td>YLR-5-1064-LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17134-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber ring</td>
			<td>Forever Seals</td>
			<td>NBR O-Ring</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Z273554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage positioning</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-545.3R8S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>P1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of viscoelastic properties of red blood cells using optical tweezers and defocusing microscopy

Le proprietà viscoelastiche degli eritrociti sono state studiate con una serie di tecniche. Tuttavia, i dati sperimentali riportati variano. Ciò non è solo attribuito alla normale variabilità delle cellule, ma anche alle differenze nei metodi e nei modelli di risposta cellulare. Qui, un protocollo integrato che utilizza pinzette ottiche e microscopia di defocalizzazione viene impiegato per ottenere le caratteristiche reologiche dei globuli rossi nella gamma di frequenza da 1 Hz a 35 Hz. Mentre le pinzette ottiche sono utilizzate per misurare la costante elastica del complesso eritrocitario, la microscopia di defocalizzazione è in grado di ottenere il profilo di altezza della cella, il volume e il suo fattore di forma un parametro che consente la conversione della costante elastica complessa in modulo di taglio complesso. Inoltre, applicando un modello di reologia vetrosa morbida, è possibile ottenere l'esponente di scala per entrambi i moduli. La metodologia sviluppata permette di esplorare il comportamento meccanico dei globuli rossi, caratterizzandone i parametri viscoelastici, ottenuti in condizioni sperimentali ben definite, per diverse condizioni fisiologiche e patologiche.

La figura 1 rappresenta gli schemi del sistema OT utilizzato per le misure reologiche. La Figura 2 mostra gli schemi dell'esperimento di microreologia con entrambe le sfere e viene mostrato anche un RBC rappresentativo. La figura 3 mostra una curva tipica per le ampiezze di entrambe le sfere in funzione del tempo quando i movimenti sinusoidali sono prodotti dallo stadio piezoelettrico. Mentre la sfera di riferimento (Figura 3 - curv...

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Quantitative Analysis of Viscoelastic Properties of Red Blood Cells Using Optical Tweezers and Defocusing Microscopy

Qui viene descritto un protocollo integrato basato su pinzette ottiche e microscopia di defocalizzazione per misurare le proprietà reologiche delle cellule. Questo protocollo ha ampia applicabilità nello studio delle proprietà viscoelastiche degli eritrociti in condizioni fisio-patologiche variabili.

Analisi quantitativa delle proprietà viscoelastiche dei globuli rossi mediante pinzetta ottica e microscopia di defocalizzazione

The viscoelastic properties of erythrocytes have been investigated by a range of techniques. However, the reported experimental data vary. This is not ...

Questa metodologia consente di esplorare il comportamento meccanico degli eritrociti, caratterizzando i loro parametri viscoelastici e le caratteristiche vetrose morbide per diverse condizioni fisiologiche e patologiche. Il nostro metodo basato su singola cella verifica i riferimenti video utilizzando i valori dei metalli per il fattore di forma che mette in relazione forze e spostamenti, sollecitazioni e graffi nella superficie degli eritrociti. Inizia versando grasso siliconico sulla superficie dell'anello di gomma in modo da coprire l'intero perimetro.Quindi, posizionare l'anello di gomma sul coperchio con il lato grasso rivolto verso il coperchio. Attendere cinque minuti per il corretto fissaggio e i supporti del campione sono pronti per ricevere la coltura cellulare. Successivamente, con la soluzione di cellule precedentemente preparate seguendo il protocollo scritto, seminare le cellule nel supporto del campione.Aggiungere 0,2 microlitri di una soluzione di sfere di polistirene al 10%volume per volume al campione. Posizionare il secondo coprislip sopra l'anello di gomma. Chiudere l'installazione e completare la preparazione del campione.Infine, spostare l'intero campione al microscopio. Per iniziare con la sperimentazione, utilizzare il sistema OT, intrappolare la sfera con il laser OT e quindi attaccarla al coprifoglio, vicino alla cella. Quindi, intrappolare un'altra sfera e ripetere la stessa procedura di attacco premendo la sfera contro la superficie della cella, vicino alla superficie superiore e vicino al bordo della cella.Aggiungere una funzione sinusoidale di ampiezza e frequenze variabili. Quindi, premere il pulsante di avvio, utilizzando lo stadio piezoelettrico per consentire lo spostamento piezoelettrico. Mantenere la sfera RBC nella trappola e sottoporre il campione a un ciclo di movimenti utilizzando la funzione sinusoidale precedentemente impostata.Per l'analisi, aprire il software ImageJ e importare l'intero filmato ottenuto durante i movimenti sinusoidali. Fare clic su Regola, quindi selezionare la soglia dell'opzione. Regolare la soglia con entrambe le barre di scorrimento e selezionare la sfera di riferimento facendo clic su file, seguita da rettangolo.Quindi nella scheda Analizza, fai clic su imposta misure"e seleziona il centro di massa"opzione. Fare nuovamente clic sulla scheda Analizza e selezionare Analizza particelle. Apparirà una nuova finestra contenente una tabella con le coordinate xy per il centro della massa.Ripetete la procedura per l'altra sfera attaccata alla superficie RBC. Aprire il software di analisi e importare i file txt precedentemente ottenuti. Generate un plottaggio con i centri di massa sull'asse y e il tempo sull'asse x.Tracciare i risultati su un grafico utilizzando l'asse x per la costante di perdita, indicato da K doppio primo, e l'asse y per la costante di memorizzazione, indicato con K primo. Innanzitutto, per l'acquisizione video, spostare lo stadio piezoelettrico nella direzione xy, utilizzando il software per cercare una cella isolata attaccata al coprivetrino. Intrappolare e attaccare una sfera di polistirene di diametro noto alla superficie dei globuli rossi.Quindi, utilizzando lo stadio piezoelettrico, spostare la perlina intrappolata attaccata alla superficie RBC per deformare la cellula, quindi attaccare la perlina al labbro di copertura. Ora, cambia la posizione dell'asse z per trovare l'immagine messa a fuoco. Dopo aver fissato la posizione, utilizzare il software della fotocamera per creare un filmato dell'intera cella.Quindi, spostare la posizione dell'asse z di due micrometri verso il basso o verso l'alto per ottenere un'immagine sfocata per la cella scelta. Infine, senza modificare la posizione dell'asse z, cercate una regione senza celle per ripetere la stessa procedura e create un filmato dello sfondo dell'immagine. Per l'acquisizione di immagini di contrasto, trova prima il valore di N zero, fai clic sull'icona di selezione del poligono, quindi fai clic sulla scheda Analizza e seleziona misura.Quindi, usa l'equazione di contrasto per determinare N immagine meno N zero ed esegui questo selezionando math "sotto processo", seguito da sottrai. Successivamente, dividi il risultato per N zero meno B.Infine, trova il contrasto per le immagini focalizzate e sfocate. Ora utilizzate la trasformata di Hartley per ottenere lo spessore RBC.In ImageJ, fare clic su processo, seguito da FFT" e opzioni FFT, quindi scegliere FHT. Quindi eseguire la trasformazione inversa FHT selezionando il processo, seguito da FFT"e FFT. Utilizzare l'immagine risultante per ottenere il profilo dell'altezza.Dopo aver trovato l'immagine che contiene il profilo di altezza RBC, utilizzare il contrasto sfocato di due micrometri per creare un set di due immagini in ImageJ. Per trovare il fattore di forma, utilizzare una macro personalizzata ImageJ per analizzare lo stack. La macro fornirà una tabella con la posizione del bordo, il perimetro, l'inverso del perimetro e un'immagine della cella analizzata.Verificate se i bordi di questa immagine sono simili ai bordi della figura di riferimento. In caso contrario, ripetere la procedura e utilizzare la somma dell'inversa del perimetro per trovare il fattore di forma. Iniziare organizzando i dati sperimentali in una tabella.Creare una nuova tabella nel software di analisi facendo clic sulla scheda file. Determinare 10 colonne diverse per i parametri. Per tracciare la curva G primo e G doppio primo nel software di analisi, utilizzare i dati della tabella precedente e fare clic sul pulsante "plot".Per ottenere i parametri Gamma e GM, fare clic sulla scheda curve fit e selezionare fit1" per aprire una nuova finestra. Selezionare il quadrato, fare clic sul pulsante Definisci e digitare l'equazione. Fare clic sul pulsante "ok" in entrambe le finestre e verrà visualizzato il raccordo.Quindi, create altri due grafici, vale a dire G primo e G doppio primo in funzione di omega. Posizionare le barre di errore solo sull'asse y, come illustrato in precedenza. Ripetete la procedura di adattamento della curva, selezionate l'opzione G".Fare clic su definizione curva" in adattamento generale, quindi scrivere l'equazione interessata. Infine, fai clic su OK e apparirà un adattamento della curva insieme ai valori per Alfa e G zero. Anche in questo caso, eseguire un'altra procedura di adattamento della curva.Selezionare l'opzione G", fare clic su definizione curva "in adattamento generale, quindi scrivere l'equazione interessata. Infine, fai clic su OK e apparirà un adattamento della curva. La figura mostra la costante elastica di stoccaggio in funzione della costante elastica di perdita.La dipendenza lineare osservata dimostra che la superficie dei globuli rossi può essere considerata un materiale vetroso morbido. Applicando i valori per il fattore di forma complessivo della cella e lo spessore superficiale dei globuli rossi, è possibile determinare i valori per l'esponente alfa. Questa tecnica può fornire la base per nuovi metodi diagnostici che correlano i cambiamenti nelle proprietà viscoelastiche degli eritrociti con le modifiche nel flusso sanguigno di individui con diverse patologie.

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