Name: quantitative analysis of viscoelastic properties of red blood cells using optical tweezers and defocusing microscopy
Uploaded: 2022-03-25T14:30:00
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著者らは、CENABIOの高度な顕微鏡施設のすべてのメンバーに、すべての重要な支援に感謝したいと思います。この作業は、ブラジルの機関であるコンセリョ・ナシオナル・デ・デセンボルビメント・シエンティフィコ・エ・テクノロジコ(CNPq)、COORDENAÇÃO de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Financial Code 001、Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ)、Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluidos Complexos(INCT-FCx)とFundação de Amparo de Pesquisa do Estado de São Paulo(FAPESP)の支援を受けました。B.P.はFAPERJからのJCNE助成金によって支援されました。

ヒトの血液サンプルは、リオデジャネイロ連邦大学の研究倫理委員会によって承認されたプロトコル(プロトコル2.889.952)に従って成人男性と女性のボランティアによって提供され、CAAE番号88140418.5.0000.5699でブラジルプラットフォームに登録されました。書面による同意書がすべてのボランティアに発行され、収集されました。ヘモグロビン症および/または管理薬を服用している人は除外され?...

<ol>
	<li>Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+erythrocyte+plasma+membrane:+a+Rosetta+Stone+for+decoding+membrane-cytoskeleton+structure.">The human erythrocyte plasma membrane: a Rosetta Stone for decoding membrane-cytoskeleton structure.</a> Current Topics in Membranes. 72, 39-88 (2013).</li><li>Tomaiuolo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+properties+of+red+blood+cells+in+health+and+disease+towards+microfluidics.">Biomechanical properties of red blood cells in health and disease towards microfluidics.</a> Biomicrofluidics. 8 (5), 051501 (2014).</li><li>Depond, M., Henry, B., Buffet, P., Ndour, P. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+three-dimensional+imaging+of+phase+objects+using+defocusing+microscopy:+Application+to+red+blood+cells.">Total three-dimensional imaging of phase objects using defocusing microscopy: Application to red blood cells.</a> Applied Physics Letters. 104 (25), 251107 (2014).</li><li>K&#246;hler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+of+illumination+for+photomicrographical+purposes.">New method of illumination for photomicrographical purposes.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 (1894).</li><li>Nans, A., Mohandas, N., Stokes, D. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cytoskeletal+drugs+on+actin+cortex+elasticity.">Effects of cytoskeletal drugs on actin cortex elasticity.</a> Experimental Cell Research. 351 (2), 173-181 (2017).</li></ol>

このプロトコルでは、赤血球の粘弾性特性を定量的にマッピングするために、光ピンセットとデフォーカス顕微鏡に基づく統合方法が提示されます。 貯蔵および損失せん断弾性率の結果は、RBCの柔らかいガラス状レオロジーを特徴付けるスケーリング指数とともに決定される。生理学的状況8 または 熱帯熱マラリア原虫 赤血球内サイクル9 の各段階...

赤血球としても知られる成熟赤血球(RBC)は、人体の最も狭い毛細血管を通過するときに、そのサイズが2倍以上伸びることができます1。そのような能力は、外部負荷を受けたときに変形するそれらの独特の能力に起因する。
近年、さまざまな研究がRBC表面2,3でこの特徴を特徴付けています。外部荷重による材料の弾性応答と粘性応答を記述する物理学の分野は、レオロジーと呼ばれます。一般に、外力が加えられると、結果として生じる変形は材料の特性に依存し、エネルギーを蓄える弾性変形とエネルギーを放散する粘性変形に分けることができます4。赤血球を含むすべての細胞は粘弾性挙動を示します。言い換えれば、エネルギーは蓄えられ、散逸されます。したがって、セルの粘弾性応答は、その複素せん断弾性率G*(ω)= G'(ω)+ iG"(ω)によって特徴付けることができ、ここでG'(ω)は弾性挙動に関連する貯蔵弾性率であり、G"(ω)はその粘度4に関連する損失弾性率である。さらに、現象論的モデルは細胞応答を記述するために使用されており、最も使用されているものの1つは、負荷周波数に対する複素せん断弾性率のべき乗則依存性を特徴とする軟質ガラス状レオロジーモデル5と呼ばれる。
単細胞ベースの方法は、力を加え、課せられた荷重の関数として変位を測定することにより、RBCの粘弾性特性を特徴付けるために採用されています2,3。しかし、複素せん断弾性率については、文献にはほとんど結果がありません。動的光散乱を用いて、RBC貯蔵および損失弾性率の値は、1〜100Hzの周波数範囲で0.01〜1Paの範囲で変化して報告された6。光磁気ツイストサイトメトリーを用いることにより、見かけの複素弾性率が得られ7、比較のために、おそらく不一致を明らかにするために乗法係数が主張されました。
最近では、時間依存的な負荷に対するヒト赤血球のせん断弾性率の貯蔵と損失を定量的にマッピングするための統合ツールとして、光ピンセット(OT)とデフォーカス顕微鏡(DM)に基づく新しい方法論が確立されました8,9。さらに、柔らかいガラス状のレオロジーモデルを使用して結果を適合し、赤血球8,9を特徴付けるべき乗則係数を取得しました。
全体として、以下に詳細に説明するプロトコルである開発された方法論8,9は、力と変形をRBC表面の応力とひずみに関連付けるフォームファクターFfの測定値を使用して以前の不一致を明らかにし、異なる血液を持つ個人から得られたRBCの粘弾性パラメータと柔らかいガラスの特徴を定量的に決定できる新しい診断方法として利用できます病理。以下に説明するプロトコルを用いたこのような特性評価は、メカノバイオロジーの観点から赤血球の挙動を理解するための新しい可能性を開く可能性があります。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom dishes</td>
			<td>MatTek Life Sciences</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MXA22165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KaleidaGraph</td>
			<td>Synergy Software</td>
			<td>https://www.synergy.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR717805-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T1020CK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT laser</td>
			<td>IPG Photonics</td>
			<td>YLR-5-1064-LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17134-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber ring</td>
			<td>Forever Seals</td>
			<td>NBR O-Ring</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Z273554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage positioning</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-545.3R8S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>P1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of viscoelastic properties of red blood cells using optical tweezers and defocusing microscopy

赤血球の粘弾性特性は、さまざまな技術によって研究されています。ただし、報告されている実験データはさまざまです。これは、細胞の正常な変動性だけでなく、細胞応答の方法とモデルの違いにも起因します。ここでは、光ピンセットとデフォーカス顕微鏡を使用した統合プロトコルを使用して、1Hz〜35Hzの周波数範囲で赤血球のレオロジー的特徴を取得します。光ピンセットは赤血球複合体弾性定数の測定に使用されますが、デフォーカス顕微鏡は、複雑な弾性定数を複雑なせん断弾性率に変換できるパラメータである細胞の高さプロファイル、体積、およびそのフォームファクターを取得できます。さらに、軟質ガラス状レオロジーモデルを適用すると、両方の弾性率に対するスケーリング指数が得られる。開発された方法論は、いくつかの生理学的および病理学的条件について、明確に定義された実験条件下で得られたそれらの粘弾性パラメータを特徴付ける、赤血球の機械的挙動を探索することを可能にする。

図1は、レオロジー測定に使用されるOTシステムの概略図を表しています。図2は、両方の球を用いたマイクロレオロジー実験の概略図を示しており、代表的なRBCも示されています。図3は、圧電ステージによって正弦波運動が発生する時間の関数として、両方の球の振幅の典型的な曲線を示しています。基準球(図3-赤い曲線)は?...

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Quantitative Analysis of Viscoelastic Properties of Red Blood Cells Using Optical Tweezers and Defocusing Microscopy

ここでは、細胞のレオロジー特性を測定するための光ピンセットとデフォーカス顕微鏡に基づく統合プロトコルについて説明します。このプロトコルは、さまざまな生理病理学的条件下での赤血球の粘弾性特性の研究に広く適用できます。

光ピンセットとデフォーカス顕微鏡を用いた赤血球の粘弾性特性の定量的解析

The viscoelastic properties of erythrocytes have been investigated by a range of techniques. However, the reported experimental data vary. This is not ...

この方法論は、赤血球の機械的挙動を探索することを可能にし、それらの粘弾性パラメータおよびいくつかの生理学的および病理学的状態に対する柔らかいガラス状の特徴を特徴付ける。当社のシングルセルベースの方法は、赤血球表面の力と変位、応力と擦り傷を関連付けるフォームファクターの金属値を使用して、ビデオ参照を検証します。まず、ゴムリングの表面にシリコングリースをかけて、周囲全体を覆うようにします。次に、グリース側をカバーガラスに向けて、カバーガラスにゴムリングを置きます。正しく取り付けられるまで5分間待つと、サンプルホルダーは細胞培養を受け入れる準備が整います。次に、書面によるプロトコールに従って予め調製した細胞の溶液を用いて、細胞をサンプルホルダーに播種する。0.2マイクロリットルの10体積%体積ポリスチレン球溶液をサンプルに加えます。2番目のカバーガラスをゴムリングの上に置きます。セットアップを閉じ、サンプル調製を終了します。最後に、サンプル全体を顕微鏡に移します。実験を開始するには、OTシステムを使用し、OTレーザーで球をトラップしてから、セルの近くのカバーガラスに取り付けます。次に、別の球をトラップし、球を細胞表面、上面近く、細胞端近くに押し付けて、同じ付着手順を繰り返します。振幅と変化する周波数の正弦波関数を追加します。次に、圧電ステージを使用して圧電変位を可能にするスタート"ボタンを押します。RBC球をトラップに保持し、以前に設定した正弦波関数を使用してサンプルを動きのサイクルに提出します。分析のために、ImageJソフトウェアを開き、正弦波運動中に得られたムービー全体をインポートします。調整をクリックし、オプションのしきい値を選択します。両方のスクロールバーでしきい値を調整し、ファイルをクリックしてから長方形をクリックして参照球を選択します。次に、[分析]タブで、[測定値の設定]をクリックします「重心を選択します」オプション。[解析]タブをもう一度クリックし、[パーティクルの解析]を選択します。質量の中心のxy座標を含むテーブルを含む新しいウィンドウが表示されます。RBC サーフェスにアタッチされている他の球に対してこの手順を繰り返します。解析ソフトウェアを開き、以前に取得したtxtファイルをインポートします。重心をy軸、時間をx軸とするプロットを生成します。K倍素数で示される損失定数のx軸と、K素数で示される貯蔵定数のy軸を使用して、結果をグラフにプロットします。まず、ビデオ取得のために、ソフトウェアを使用してカバーガラスに取り付けられた単離されたセルを検索し、圧電ステージをxy方向に動かします。既知の直径のポリスチレン球をトラップしてRBC表面に取り付けます。次に、圧電ステージを使用して、RBC表面に付着したトラップビーズを移動させてセルを変形させた後、ビーズをカバーリップに取り付けます。次に、z軸の位置を変更して、焦点が合った画像を見つけます。位置を固定したら、カメラソフトウェアを使用してセル全体の動画を作成します。次に、z 軸の位置を 2 マイクロメートル下または上に移動して、選択したセルの焦点が合っていない画像を取得します。最後に、z軸の位置を変えずに、同じ手順を繰り返して細胞のない領域を探し、画像の背景の動画を作成します。コントラスト画像を取得するには、最初にNゼロの値を見つけ、ポリゴン選択アイコンをクリックしてから、[分析]タブをクリックして[測定]を選択します。次に、コントラスト方程式を使用してN個の画像からN個のゼロを引いたものを決定し、これを「処理中の数学」を選択してから減算して実行します。後で、結果をNゼロからBを引いたもので割ります.最後に、焦点が合った画像と焦点が合っていない画像のコントラストを見つけます。次に、ハートレー変換を使用して RBC の厚さを取得します。ImageJで、プロセスをクリックし、次にFFT"およびFFTオプションをクリックしてから、FHTを選択します。次に、プロセスを選択して逆変換FHTを実行し、続いてFFT"とFFTを実行します。結果の画像を使用して、高さプロファイルを取得します。RBC 高さプロファイルを含む画像を見つけたら、2 マイクロメートルの焦点の合ったコントラストを使用して、ImageJ で 2 つの画像のセットを作成します。フォーム ファクターを見つけるには、ImageJ でカスタマイズされたマクロを使用してスタックを分析します。マクロは、エッジの位置、周長、周長の逆数、および分析されたセルの画像を含むテーブルを提供します。この画像のエッジが参照図のエッジと似ているかどうかを確認してください。それ以外の場合は、手順を繰り返し、周囲の逆数の合計を使用してフォーム ファクターを見つけます。まず、実験データを表に整理します。ファイルタブをクリックして、分析ソフトウェアで新しいテーブルを作成します。パラメータの 10 個の異なる列を決定します。解析ソフトウェアで曲線G素数とG二重素数をプロットするには、前の表のデータを使用して、プロットボタンをクリックします。パラメータガンマとGMを取得するには、カーブフィットタブをクリックし、fit1"を選択して新しいウィンドウを開きます。正方形を選択し、定義ボタンをクリックして、方程式を入力します。クリックしてください 大丈夫"両方のウィンドウのボタンをクリックすると、フィッティングが表示されます。次に、オメガの関数としてG素数とGダブル素数の2つのプロットを作成します。前に示したように、エラーバーはy軸にのみ配置します。カーブフィット手順を繰り返し、G"オプションを選択します。一般適合の下の「曲線定義」をクリックし、関連する方程式を記述します。最後に、[OK]をクリックすると、アルファとGゼロの値とともにカーブフィッティングが表示されます。ここでも、別のカーブフィット手順を実行します。G"オプションを選択し、一般的なフィットの下の曲線定義をクリックして、関連する方程式を記述します。最後に、[OK]をクリックすると、カーブフィッティングが表示されます。この図は、損失弾性定数の関数としての貯蔵弾性定数を示しています。観察された線形依存性は、RBC表面が柔らかいガラス状材料と見なすことができることを示しています。セル全体のフォーム ファクターと RBC 表面の厚さの値を適用することで、指数 Alpha の値を決定できます。この技術は、赤血球の粘弾性特性の変化と異なる病状を持つ個人の血流の変化を相関させる新しい診断方法の基礎を提供する可能性があります。

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