Name: quantitative analysis of viscoelastic properties of red blood cells using optical tweezers and defocusing microscopy
Uploaded: 2022-03-25T14:30:00
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저자는 가장 중요한 도움을 주신 CENABIO 고급 현미경 시설의 모든 구성원에게 감사를 표합니다. 이 작업은 브라질 기관인 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Financial Code 001, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) 및 Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluidos Complexos (INCT-FCx)와 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)의 지원을 받았습니다. BP는 FAPERJ의 JCNE 보조금으로 지원되었습니다.

인간 혈액 샘플은 리우데자네이루 연방 대학교 연구 윤리 위원회(프로토콜 2.889.952)에서 승인한 프로토콜에 따라 성인 남녀 지원자가 제공했으며 CAAE 번호 88140418.5.0000.5699로 브라질 플랫폼에 등록되었습니다. 서면 동의서가 모든 자원 봉사자에게 발행되고 수집되었습니다. 혈색소병증이 있거나 통제된 약물을 복용하는 사람은 제외되었습니다. 전체 과정은 연구소의 윤리위원회가 승인 한 지침을 ...

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cytoskeletal+drugs+on+actin+cortex+elasticity.">Effects of cytoskeletal drugs on actin cortex elasticity.</a> Experimental Cell Research. 351 (2), 173-181 (2017).</li></ol>

이 프로토콜에서는 광학 핀셋과 디포커싱 현미경을 기반으로 하는 통합 방법을 제시하여 RBC의 점탄성 특성을 정량적으로 매핑합니다. 저장 및 손실 전단 계수에 대한 결과와 RBC의 연질 유리 유변학을 특징짓는 스케일링 지수가 결정됩니다. 생리학적 상황8 또는 P. falciparum intra-erythrocyticcycle9 의 각 단계와 같은 다양한 실험 조건에 대한 이 프로토콜의 적?...

적혈구라고도 알려진 성숙한 적혈구(RBC)는 인체의 가장 좁은 모세혈관을 통과할 때 크기가 두 배 이상 확장될 수 있습니다1. 이러한 용량은 외부 하중을 받을 때 변형되는 고유한 능력에 기인합니다.
최근 몇 년 동안, 다른 연구들은 적혈구 표면 2,3에서 이 특징을 특징지었다. 외부 하중으로 인한 재료의 탄성 및 점성 반응을 설명하는 물리학 영역을 유변학이라고합니다. 일반적으로 외력이 가해지면 재료의 특성에 따라 변형이 발생하며, 에너지를 저장하는 탄성 변형 또는 에너지를 소산하는 점성 변형으로 나눌 수 있다4. 적혈구를 포함한 모든 세포는 점탄성 거동을 나타냅니다. 즉, 에너지는 저장되고 소산됩니다. 따라서 전지의 점탄성 반응은 복소 전단 계수 G*(ω) = G'(ω) + iG"(ω)로 특성화될 수 있으며, 여기서 G'(ω)는 탄성 거동과 관련된 저장 탄성률이고, G"(ω)는 점도와 관련된 손실 계수이다4. 더욱이, 현상학적 모델은 세포 반응을 기술하기 위해 사용되어 왔으며, 가장 많이 사용되는 것 중 하나는 하중 주파수에 따른 복잡한 전단 계수의 멱법칙 의존성을 특징으로 하는 연질 유리질 유변학 모델5라고 합니다.
단일 셀 기반 방법은 힘을 가하고 부과 된 하중 2,3의 함수로 변위를 측정함으로써 적혈구의 점탄성 특성을 특성화하는 데 사용되었습니다. 그러나, 복잡한 전단 계수의 경우, 문헌에서 거의 결과를 찾을 수 없다. 동적 광 산란을 사용하여 RBC 저장 및 손실 계수 값은 1-100Hz6의 주파수 범위에서 0.01-1Pa로 변하는 것으로 보고되었습니다. 광학 자기 비틀림 세포분석법을 사용하여 겉보기 복합 탄성률(complex elastic modulus)을 얻었으며7, 비교 목적으로, 불일치를 명확히 하기 위해 곱셈 계수(multiplicative factor)를 주장했다.
보다 최근에, 시간 의존적 하중에 대한 인간 적혈구의 전단 계수의 저장 및 손실을 정량적으로 매핑하는 통합 도구로서 광학 핀셋(OT)과 디포커싱 현미경(DM)을 기반으로 하는 새로운 방법론이 확립되었습니다 8,9. 또한, 부드러운 유리질 유변학 모델을 사용하여 결과를 피팅하고 RBC 8,9를 특징짓는 멱법칙 계수를 얻었습니다.
전반적으로, 개발된 방법론(8,9)에 대한 프로토콜은 아래에 상세히 기술되어 있으며, RBC 표면의 응력 및 변형에 대한 힘 및 변형을 관련시키는 폼 팩터 Ff에 대한 측정값을 사용하여 이전의 불일치를 명확히 하고, 상이한 혈액을 가진 개인으로부터 얻어진 적혈구의 점탄성 파라미터 및 연질 유리질 특징을 정량적으로 결정할 수 있는 새로운 진단 방법으로서 활용될 수 있다 병리학. 아래에 설명된 프로토콜을 사용하는 이러한 특성화는 기계생물학적 관점에서 적혈구의 거동을 이해할 수 있는 새로운 가능성을 열 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom dishes</td>
			<td>MatTek Life Sciences</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MXA22165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KaleidaGraph</td>
			<td>Synergy Software</td>
			<td>https://www.synergy.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR717805-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T1020CK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT laser</td>
			<td>IPG Photonics</td>
			<td>YLR-5-1064-LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17134-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber ring</td>
			<td>Forever Seals</td>
			<td>NBR O-Ring</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Z273554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage positioning</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-545.3R8S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>P1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of viscoelastic properties of red blood cells using optical tweezers and defocusing microscopy

적혈구의 점탄성 특성은 다양한 기술에 의해 조사되었습니다. 그러나 보고된 실험 데이터는 다양합니다. 이것은 세포의 정상적인 가변성뿐만 아니라 세포 반응의 방법과 모델의 차이에 기인합니다. 여기서, 광학 핀셋 및 디포커싱 현미경을 사용하는 통합 프로토콜은 1 Hz 내지 35 Hz의 주파수 범위에서 적혈구의 유변학적 특징을 얻기 위해 사용된다. 광학 핀셋은 적혈구 복합 탄성 상수를 측정하는 데 사용되지만, 디포커싱 현미경은 복잡한 탄성 상수를 복잡한 전단 계수로 변환할 수 있는 매개변수인 세포 높이 프로파일, 부피 및 폼 팩터를 얻을 수 있습니다. 또한, 부드러운 유리질 유변학 모델을 적용하면 두 모듈리에 대한 스케일링 지수를 얻을 수 있습니다. 개발 된 방법론은 적혈구의 기계적 거동을 탐구하여 여러 생리 학적 및 병리학 적 조건에 대해 잘 정의 된 실험 조건에서 얻은 점탄성 매개 변수를 특성화 할 수 있습니다.

그림 1은 유변학 측정에 사용되는 OT 시스템의 개략도를 나타냅니다. 도 2에는 두 구체 및 대표적인 RBC를 이용한 미세유변학 실험의 개략도가 도시되어 있다. 그림 3은 정현파 운동이 압전 스테이지에 의해 생성될 때의 시간 함수로서 두 구체의 진폭에 대한 일반적인 곡선을 보여줍니다. 기준 구(그림 3 - 빨간색 곡선)는 스테이지 ?...

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Quantitative Analysis of Viscoelastic Properties of Red Blood Cells Using Optical Tweezers and Defocusing Microscopy

여기에서는 세포의 유변학적 특성을 측정하기 위해 광학 핀셋과 디포커싱 현미경을 기반으로 하는 통합 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 다양한 생리병리학적 조건에서 적혈구의 점탄성 특성을 연구하는 데 광범위하게 적용할 수 있습니다.

광학 핀셋과 디포커싱 현미경을 사용한 적혈구의 점탄성 특성에 대한 정량적 분석

The viscoelastic properties of erythrocytes have been investigated by a range of techniques. However, the reported experimental data vary. This is not ...

이 방법론은 적혈구의 기계적 거동을 탐구하여 여러 생리적 및 병리학 적 조건에 대한 점탄성 매개 변수와 부드러운 유리 기능을 특성화합니다. 당사의 단일 셀 기반 방법은 적혈구 표면의 힘과 변위, 응력 및 긁힘과 관련된 폼 팩터에 대한 금속 값을 사용하여 비디오 참조를 확인합니다. 전체 둘레를 덮는 방식으로 고무 링 표면에 실리콘 그리스를 붓는 것으로 시작합니다.그런 다음 그리스 면이 커버슬립을 향하도록 고무 링을 커버슬립에 놓습니다. 적절한 부착을 위해 5분 동안 기다리면 샘플 홀더가 세포 배양을 받을 준비가 됩니다. 다음으로, 작성된 프로토콜에 따라 미리 준비된 세포 용액을 사용하여 샘플 홀더에 세포를 시드합니다.0.2 마이크로리터의 10 부피% 폴리스티렌 구 용액을 샘플에 첨가한다. 두 번째 커버슬립을 고무 링 위에 놓습니다. 설정을 닫고 샘플 준비를 마칩니다.마지막으로 전체 샘플을 현미경으로 옮깁니다. 실험을 시작하려면 OT 시스템을 사용하고 OT 레이저로 구체를 가둔 다음 셀에 가까운 커버 슬립에 부착합니다. 그런 다음 다른 구를 트랩하고 구를 셀 표면, 상단 표면 근처 및 셀 가장자리 가까이로 눌러 동일한 부착 절차를 반복합니다.진폭과 다양한 주파수의 정현파 함수를 추가합니다. 그런 다음 압전 스테이지를 사용하여 시작 버튼을 눌러 압전 변위를 허용합니다. RBC 구를 트랩에 보관하고 이전에 설정된 정현파 함수를 사용하여 샘플을 이동 주기에 제출합니다.분석을 위해 ImageJ 소프트웨어를 열고 정현파 이동 중에 얻은 전체 동영상을 가져옵니다. adjust(조정)를 클릭한 다음 옵션 임계값(option threshold)을 선택합니다. 두 스크롤 막대로 임계값을 조정하고 파일을 클릭한 다음 사각형을 클릭하여 참조 구를 선택합니다.그런 다음 분석 탭에서 측정 설정"을 클릭하고 질량 중심을 선택합니다." 옵션을 선택합니다. 분석(analyze) 탭을 다시 클릭하고 파티클 분석(analyze particles)을 선택합니다. 질량 중심에 대한 xy 좌표가 있는 테이블이 포함된 새 창이 나타납니다.RBC 표면에 부착된 다른 구에 대해 이 절차를 반복합니다. 분석 소프트웨어를 열고 이전에 얻은 txt 파일을 가져옵니다. 질량 중심이 y축에 있고 시간이 x축에 있는 플롯을 생성합니다.손실 상수에 대한 x축(K 이중 소수로 표시됨)과 저장 상수에 대한 y축(K 소수로 표시됨)을 사용하여 그래프에 결과를 플로팅합니다. 먼저, 비디오 획득을 위해 압전 스테이지를 xy 방향으로 이동하고 소프트웨어를 사용하여 커버슬립에 부착된 절연 셀을 검색합니다. 알려진 직경의 폴리스티렌 구체를 RBC 표면에 걸러서 부착합니다.다음으로, 압전 스테이지를 이용하여 RBC 표면에 부착된 포획된 비드를 이동하여 셀을 변형시킨 다음 비드를 커버립에 부착합니다. 이제 z축 위치를 변경하여 초점이 맞춰진 이미지를 찾습니다. 위치를 고정한 후 카메라 소프트웨어를 사용하여 전체 셀의 동영상을 만듭니다.그런 다음 z축 위치를 2마이크로미터 아래 또는 위로 이동하여 선택한 셀에 대한 초점이 흐려진 이미지를 얻습니다. 마지막으로 z축 위치를 변경하지 않고 셀이 없는 영역을 검색하여 동일한 절차를 반복하고 이미지 배경의 동영상을 만듭니다. 대비 이미지 획득의 경우 먼저 N 0의 값을 찾고 다각형 선택 아이콘을 클릭한 다음 분석 탭을 클릭하고 측정을 선택합니다.다음으로, 대비 방정식을 사용하여 N 이미지에서 N 0을 뺀 값을 결정하고, 프로세스에서 수학을 선택한 다음 빼기를 선택하여 이를 실행합니다. 나중에 결과를 N 0에서 B를 뺀 값으로 나눕니다. 마지막으로 초점이 맞춰진 이미지와 초점이 맞지 않는 이미지의 대비를 찾습니다. 이제 Hartley 변환을 사용하여 RBC 두께를 구합니다.ImageJ에서 프로세스를 클릭 한 다음 FFT "및 FFT 옵션을 클릭 한 다음 FHT를 선택합니다. 그런 다음 프로세스를 선택한 다음 FFT"및 FFT를 선택하여 역 변환 FHT를 수행합니다. 결과 이미지를 사용하여 높이 프로파일을 얻습니다.RBC 높이 프로필이 포함된 이미지를 찾은 후 2마이크로미터의 초점이 흐려진 대비를 사용하여 ImageJ에 두 개의 이미지 집합을 만듭니다. 폼 팩터를 찾으려면 ImageJ 사용자 지정 매크로를 사용하여 스택을 분석합니다. 매크로는 가장자리의 위치, 둘레, 둘레의 역 및 분석된 셀의 이미지가 포함된 테이블을 제공합니다.이 이미지의 가장자리가 참조 그림의 가장자리와 유사한지 확인하십시오. 그렇지 않으면 절차를 반복하고 둘레의 역수의 합을 사용하여 폼 팩터를 찾습니다. 먼저 실험 데이터를 표로 구성합니다.파일 탭을 클릭하여 분석 소프트웨어에서 새 테이블을 만듭니다. 매개변수에 대해 10개의 서로 다른 열을 결정합니다. 분석 소프트웨어에서 곡선 G 프라임 및 G 이중 프라임을 플로팅하려면 이전 테이블의 데이터를 사용하고 플롯 버튼을 클릭하십시오.매개변수 감마(Gamma) 및 GM(GM)을 얻으려면 곡선 맞춤(curve fit) 탭을 클릭하고 fit1"을 선택하여 새 창을 엽니다. 사각형을 선택하고 정의 버튼을 클릭한 다음 방정식을 입력합니다. 두 창에서 확인" 버튼을 클릭하면 피팅이 나타납니다.다음으로, 두 개의 다른 플롯, 즉 오메가의 함수로 G 프라임과 G 이중 프라임을 만듭니다. 앞에서 설명한 대로 오차 막대를 y축에만 배치합니다. 커브 피팅 절차를 반복하고 G" 옵션을 선택합니다.일반 맞춤에서 곡선 정의"를 클릭한 다음 해당 방정식을 작성합니다. 마지막으로 확인을 클릭하면 알파 및 G 0 값과 함께 곡선 피팅이 나타납니다. 다시 다른 커브 피팅 절차를 수행합니다.G"옵션을 선택하고 일반 맞춤에서 곡선 정의"를 클릭한 다음 해당 방정식을 작성합니다. 마지막으로 확인을 클릭하면 곡선 피팅이 나타납니다. 그림은 손실 탄성 상수의 함수로서 저장 탄성 상수를 보여줍니다.관찰된 선형 의존성은 RBC 표면이 부드러운 유리 물질로 간주될 수 있음을 보여줍니다. 전체 셀 폼 팩터 및 RBC 표면 두께에 대한 값을 적용하여, 지수 알파에 대한 값이 결정될 수 있다. 이 기술은 적혈구의 점탄성 특성의 변화와 다른 병리를 가진 개인의 혈류 변형을 연관시키는 새로운 진단 방법의 기초를 제공할 수 있습니다.

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