Name: quantitative analysis of viscoelastic properties of red blood cells using optical tweezers and defocusing microscopy
Uploaded: 2022-03-25T14:30:00
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Os autores gostariam de agradecer a todos os membros da instalação de microscopia avançada do CENABIO pela ajuda importante. Este trabalho contou com o apoio das agências brasileiras Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Código Financeiro 001, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluidos Complexos (INCT-FCx) em conjunto com a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). B.P. foi apoiado por uma bolsa JCNE da FAPERJ.

Amostras de sangue humano foram fornecidas por voluntários adultos, de ambos os sexos, de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio de Janeiro (Protocolo 2.889.952) e registrados na Plataforma Brasil sob o número CAAE 88140418.5.0000.5699. Um termo de consentimento por escrito foi emitido e coletado de todos os voluntários. Foram excluídos aqueles com qualquer hemoglobinopatia e/ou em uso de medicação controlada. Todo o processo seguiu as diretrizes aprovadas ...

<ol>
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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cytoskeletal+drugs+on+actin+cortex+elasticity.">Effects of cytoskeletal drugs on actin cortex elasticity.</a> Experimental Cell Research. 351 (2), 173-181 (2017).</li></ol>

Neste protocolo, um método integrado baseado em pinças ópticas e microscopia de desfocagem é apresentado para mapear quantitativamente as propriedades viscoelásticas das hemácias. Os resultados para os módulos de cisalhamento de armazenamento e perda, juntamente com o expoente de escala que caracteriza a reologia vítrea mole das hemácias são determinados. A aplicação deste protocolo para diferentes condições experimentais, como na situação fisiológica8 ou ao longo de cada estágio...

As hemácias maduras, também conhecidas como eritrócitos, são capazes de se estender por mais que o dobro de seu tamanho ao passar pelos capilares mais estreitos do corpo humano1. Tal capacidade é atribuída à sua capacidade única de deformar quando submetidos a cargas externas.
Nos últimos anos, diferentes estudos têm caracterizado essa característica na superfície das hemácias2,3. A área da física que descreve as respostas elásticas e viscosas dos materiais devido a cargas externas é chamada de reologia. Em geral, quando uma força externa é aplicada, a deformação resultante depende das propriedades do material e pode ser dividida em deformações elásticas, que armazenam energia, ou deformações viscosas, que dissipam energia4. Todas as células, incluindo as hemácias, exibem um comportamento viscoelástico; Em outras palavras, a energia é armazenada e dissipada. A resposta viscoelástica de uma célula pode, assim, ser caracterizada pelo seu módulo de cisalhamento complexo G*(ω) = G'(ω) + iG"(ω), onde G' (ω) é o módulo de armazenamento, relacionado ao comportamento elástico, e G" (ω) é o módulo de perda, relacionado à sua viscosidade4. Além disso, modelos fenomenológicos têm sido utilizados para descrever as respostas celulares, um dos mais utilizados é o chamado modelo de reologia vítreamole5, caracterizado por uma dependência da lei de potência do módulo de cisalhamento complexo com a frequência de carga.
Métodos unicelulares têm sido empregados para caracterizar as propriedades viscoelásticas das hemácias, aplicando força e medindo o deslocamento em função da carga imposta 2,3. Entretanto, para o módulo de cisalhamento complexo, poucos resultados podem ser encontrados na literatura. Usando espalhamento dinâmico de luz, foram relatados valores de armazenamento e perda de hemácias variando de 0,01-1 Pa, na faixa de frequência de 1-100 Hz6. Utilizando-se a citometria de torção magnética óptica, obteve-se módulo elástico complexo aparente7 e, para fins de comparação, um fator multiplicativo foi reivindicado para possivelmente esclarecer as discrepâncias.
Mais recentemente, uma nova metodologia baseada em pinças ópticas (OT) em conjunto com a microscopia de desfocalização (DM), como uma ferramenta integrada para mapear quantitativamente o armazenamento e a perda de módulos de cisalhamento de eritrócitos humanos ao longo de cargas tempo-dependentes, foi estabelecida 8,9. Além disso, um modelo de reologia vítrea mole foi utilizado para ajustar os resultados e obter um coeficiente de lei de potência que caracteriza as hemácias 8,9.
De modo geral, a metodologia desenvolvida8,9, cujo protocolo é descrito em detalhes a seguir, esclarece discrepâncias prévias ao utilizar os valores medidos para o fator de forma, Ff, que relaciona forças e deformações a tensões e deformações na superfície das hemácias e pode ser utilizado como um novo método diagnóstico capaz de determinar quantitativamente os parâmetros viscoelásticos e as características vítreas moles de hemácias obtidas de indivíduos com sangue diferente Patologias. Tal caracterização, utilizando o protocolo descrito a seguir, pode abrir novas possibilidades para a compreensão do comportamento das hemácias do ponto de vista mecanobiológico.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom dishes</td>
			<td>MatTek Life Sciences</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MXA22165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KaleidaGraph</td>
			<td>Synergy Software</td>
			<td>https://www.synergy.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR717805-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T1020CK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT laser</td>
			<td>IPG Photonics</td>
			<td>YLR-5-1064-LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17134-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber ring</td>
			<td>Forever Seals</td>
			<td>NBR O-Ring</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Z273554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage positioning</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-545.3R8S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>P1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of viscoelastic properties of red blood cells using optical tweezers and defocusing microscopy

As propriedades viscoelásticas dos eritrócitos têm sido investigadas por uma variedade de técnicas. No entanto, os dados experimentais relatados variam. Isso não é atribuído apenas à variabilidade normal das células, mas também às diferenças nos métodos e modelos de resposta celular. Aqui, um protocolo integrado utilizando pinças ópticas e microscopia desfocagem é empregado para obter as características reológicas das hemácias na faixa de frequência de 1 Hz a 35 Hz. Enquanto pinças ópticas são utilizadas para medir a constante elástica complexo eritrocito, a microscopia de desfocalização é capaz de obter o perfil de altura celular, volume e seu fator de forma um parâmetro que permite a conversão de constante elástica complexa em módulo de cisalhamento complexo. Além disso, aplicando um modelo de reologia vítrea macia, o expoente de escala para ambos os módulos pode ser obtido. A metodologia desenvolvida permite explorar o comportamento mecânico das hemácias, caracterizando seus parâmetros viscoelásticos, obtidos em condições experimentais bem definidas, para diversas condições fisiológicas e patológicas.

A Figura 1 representa os esquemas do sistema OT utilizado para as medidas reológicas. A Figura 2 mostra os esquemas do experimento de microrreologia com ambas as esferas e uma hemácia representativa também é mostrada. A Figura 3 mostra uma curva típica para as amplitudes de ambas as esferas em função do tempo em que os movimentos senoidais são produzidos pelo estágio piezelétrico. Enquanto a esfera de referência (Figura 3...

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Quantitative Analysis of Viscoelastic Properties of Red Blood Cells Using Optical Tweezers and Defocusing Microscopy

Aqui, um protocolo integrado baseado em pinças ópticas e microscopia de desfocagem é descrito para medir as propriedades reológicas das células. Este protocolo tem ampla aplicabilidade no estudo das propriedades viscoelásticas de eritrócitos sob condições fisiopatológicas variáveis.

Análise quantitativa das propriedades viscoelásticas das hemácias utilizando pinças ópticas e microscopia desfocagem

The viscoelastic properties of erythrocytes have been investigated by a range of techniques. However, the reported experimental data vary. This is not ...

Esta metodologia permite explorar o comportamento mecânico dos eritrócitos, caracterizando seus parâmetros viscoelásticos e características vítreas moles para diversas condições fisiológicas e patológicas. Nosso método baseado em célula única verifica referências de vídeo usando os valores de metal para o fator de forma que relaciona forças e deslocamentos, as tensões e raspagens na superfície do eritrócito. Comece despejando graxa de silicone sobre a superfície do anel de borracha de uma forma que cubra todo o perímetro.Em seguida, coloque o anel de borracha na lamínula com o lado da graxa voltado para a lamínula. Aguarde cinco minutos para a fixação adequada e os suportes de amostra estarão prontos para receber a cultura celular. Em seguida, com a solução de células previamente preparada seguindo o protocolo escrito, semeie as células no porta-amostras.Adicionar 0,2 microlitros de uma solução de esfera de poliestireno a 10% volume por volume à amostra. Coloque a segunda tampa acima do anel de borracha. Feche a configuração e conclua a preparação da amostra.Finalmente, mova toda a amostra para o microscópio. Para começar com a experimentação, use o sistema OT, prenda a esfera com o laser OT e, em seguida, fixe-a à lamínula, perto da célula. Em seguida, prenda outra esfera e repita o mesmo procedimento de fixação pressionando a esfera contra a superfície celular, perto da superfície superior e perto da borda da célula.Adicione uma função senoidal de amplitude e frequências variáveis. Em seguida, pressione o botão start, usando o estágio piezoelétrico para permitir o deslocamento piezoelétrico. Manter a esfera de hemácias na armadilha e submeter a amostra a um ciclo de movimentos utilizando a função senoidal previamente definida.Para análise, abra o software ImageJ e importe todo o filme obtido durante os movimentos senoidais. Clique em ajustar e, em seguida, selecione o limite da opção. Ajuste o limite com as duas barras de rolagem e selecione a esfera de referência clicando no arquivo, seguido de retângulo.Em seguida, na aba analisar, clique em definir medidas" e selecione a opção "centro de massa". Clique novamente na guia analisar e selecione analisar partículas. Uma nova janela contendo uma tabela com coordenadas xy para o centro da massa aparecerá.Repita o procedimento para a outra esfera fixada à superfície do eritrócito. Abra o software de análise e importe os arquivos txt obtidos anteriormente. Gere um gráfico com os centros de massa no eixo y e o tempo no eixo x.Plote os resultados em um gráfico usando o eixo x para constante de perda, denotado por K prime duplo, e o eixo y para constante de armazenamento, denotado por K prime. Primeiro, para aquisição de vídeo, mova o estágio piezoelétrico na direção xy, usando o software para procurar uma célula isolada presa à lamínula. Aprisionar e fixar uma esfera de poliestireno de diâmetro conhecido à superfície do eritrócito.Em seguida, usando o estágio piezoelétrico, mova o talão preso à superfície do eritrócito para deformar a célula e, em seguida, prenda o talão ao lábio de cobertura. Agora, altere a posição do eixo z para localizar a imagem focada. Depois de corrigir a posição, use o software da câmera para criar um filme de toda a célula.Em seguida, mova a posição do eixo z dois micrômetros para baixo ou para cima para obter uma imagem desfocada para a célula escolhida. Finalmente, sem alterar a posição do eixo z, procure uma região sem células para repetir o mesmo procedimento e crie um filme do plano de fundo da imagem. Para aquisição de imagens de contraste, primeiro encontre o valor de N zero, clique no ícone de seleção de polígono, depois clique na guia analisar e selecione a medida.Em seguida, use a equação de contraste para determinar N imagem menos N zero, e execute isso selecionando matemática "sob processo, seguido de subtrair. Posteriormente, divida o resultado por N zero menos B. Por fim, encontre o contraste para as imagens focadas e desfocadas. Agora, use a transformada de Hartley para obter a espessura da hemácia.No ImageJ, clique em processo, seguido pelas opções FFT e FFT e, em seguida, escolha FHT. Em seguida, realize a transformação inversa FHT selecionando o processo, seguido de FFT e FFT. Use a imagem resultante para obter o perfil de altura.Depois de encontrar a imagem que contém o perfil de altura RBC, use o contraste desfocado de dois micrômetros para criar um conjunto de duas imagens no ImageJ. Para localizar o fator forma, use uma macro personalizada do ImageJ para analisar a pilha. A macro fornecerá uma tabela com a posição da borda, o perímetro, o inverso do perímetro e uma imagem da célula analisada.Verifique se as bordas desta imagem são semelhantes às bordas da figura de referência. Caso contrário, repita o procedimento e use a soma do inverso do perímetro para localizar o fator de forma. Comece organizando os dados experimentais em uma tabela.Crie uma nova tabela no software de análise clicando na guia arquivo. Determine 10 colunas diferentes para os parâmetros. Para traçar a curva G prime e G double prime no software de análise, utilize os dados da tabela anterior e clique no botão "plot".Para obter os parâmetros Gamma e GM, clique na guia de ajuste de curva e selecione fit1" para abrir uma nova janela. Selecione o quadrado, clique no botão definir e digite a equação. Clique no botão "ok" em ambas as janelas, e o encaixe aparecerá.Em seguida, crie duas outras parcelas, ou seja, G prime e G double prime em função do ômega. Coloque as barras de erro somente no eixo y, conforme demonstrado anteriormente. Repita o procedimento de ajuste da curva, selecione a opção G".Clique em definição de curva" em ajuste geral e, em seguida, escreva a equação em questão. Finalmente, clique em ok, e um ajuste de curva aparecerá junto com os valores para Alpha e G zero. Novamente, execute outro procedimento de ajuste de curva.Selecione a opção G, clique em definição de curva" em ajuste geral e escreva a equação em questão. Por fim, clique em ok, e um ajuste de curva aparecerá. A figura mostra a constante elástica de armazenamento em função da constante elástica de perda.A dependência linear observada demonstra que a superfície das hemácias pode ser considerada um material vítreo macio. Aplicando os valores para o fator de forma celular geral e espessura da superfície do eritrócito, os valores para o expoente Alpha podem ser determinados. Esta técnica pode fornecer a base para novos métodos diagnósticos que correlacionam alterações nas propriedades viscoelásticas dos eritrócitos com modificações no fluxo sanguíneo de indivíduos com diferentes patologias.

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