Name: quantitative analysis of viscoelastic properties of red blood cells using optical tweezers and defocusing microscopy
Uploaded: 2022-03-25T14:30:00
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Los autores desean agradecer a todos los miembros de la instalación de microscopía avanzada CENABIO por su importante ayuda. Este trabajo fue apoyado por las agencias brasileñas Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Código Financiero 001, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluidos Complexos (INCT-FCx) junto con Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). B.P. fue apoyado por una subvención JCNE de FAPERJ.

Las muestras de sangre humana fueron proporcionadas por hombres y mujeres adultos voluntarios de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Ética en Investigación de la Universidad Federal de Río de Janeiro (Protocolo 2.889.952) y registrados en la Plataforma Brasil con el número CAAE 88140418.5.0000.5699. Se emitió una forma escrita de consentimiento y se recogió de todos los voluntarios. Se excluyeron aquellos con hemoglobinopatía y/o que tomaban medicación controlada. Todo el proceso siguió las di...

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	<li>Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+erythrocyte+plasma+membrane:+a+Rosetta+Stone+for+decoding+membrane-cytoskeleton+structure.">The human erythrocyte plasma membrane: a Rosetta Stone for decoding membrane-cytoskeleton structure.</a> Current Topics in Membranes. 72, 39-88 (2013).</li><li>Tomaiuolo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+properties+of+red+blood+cells+in+health+and+disease+towards+microfluidics.">Biomechanical properties of red blood cells in health and disease towards microfluidics.</a> Biomicrofluidics. 8 (5), 051501 (2014).</li><li>Depond, M., Henry, B., Buffet, P., Ndour, P. 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G., Neves, B. R., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defocusing+microscopy.">Defocusing microscopy.</a> Microscopy Research and Technique. 65 (3), 159-165 (2004).</li><li>Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+fluctuations+studied+with+defocusing+microscopy.">Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy.</a> Physical Review E. 67 (5), 051904 (2003).</li><li>Roma, P. M. S., Siman, L., Amaral, F. T., Agero, U., Mesquita, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+three-dimensional+imaging+of+phase+objects+using+defocusing+microscopy:+Application+to+red+blood+cells.">Total three-dimensional imaging of phase objects using defocusing microscopy: Application to red blood cells.</a> Applied Physics Letters. 104 (25), 251107 (2014).</li><li>K&#246;hler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+of+illumination+for+photomicrographical+purposes.">New method of illumination for photomicrographical purposes.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 (1894).</li><li>Nans, A., Mohandas, N., Stokes, D. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cytoskeletal+drugs+on+actin+cortex+elasticity.">Effects of cytoskeletal drugs on actin cortex elasticity.</a> Experimental Cell Research. 351 (2), 173-181 (2017).</li></ol>

En este protocolo, se presenta un método integrado basado en pinzas ópticas y microscopía de desenfoque para mapear cuantitativamente las propiedades viscoelásticas de los glóbulos rojos. Se determinan los resultados para los módulos de almacenamiento y pérdida de cizallamiento, junto con el exponente de escala que caracteriza la reología vítrea suave de los glóbulos rojos. Ya se ha llevado a cabo la aplicación de este protocolo para diferentes condiciones experimentales, como en la situación fisiológica<sup...

Los glóbulos rojos maduros (RBC), también conocidos como eritrocitos, pueden extenderse más del doble de su tamaño cuando pasan a través de los capilares más estrechos del cuerpo humano1. Tal capacidad se atribuye a su capacidad única de deformarse cuando se somete a cargas externas.
En los últimos años, diferentes estudios han caracterizado esta característica en superficies de glóbulos rojos 2,3. El área de la física que describe las respuestas elásticas y viscosas de los materiales debido a las cargas externas se llama reología. En general, cuando se aplica una fuerza externa, la deformación resultante depende de las propiedades del material y se puede dividir en deformaciones elásticas, que almacenan energía, o deformaciones viscosas, que disipan la energía4. Todas las células, incluidos los glóbulos rojos, exhiben un comportamiento viscoelástico; En otras palabras, la energía se almacena y se disipa. La respuesta viscoelástica de una célula puede caracterizarse por su módulo de cizallamiento complejo G*(ω) = G'(ω) + iG"(ω), donde G' (ω) es el módulo de almacenamiento, relacionado con el comportamiento elástico, y G" (ω) es el módulo de pérdida, relacionado con su viscosidad4. Además, se han utilizado modelos fenomenológicos para describir las respuestas celulares, uno de los más utilizados se denomina modelo5 de reología vítrea blanda, caracterizado por una dependencia de la ley de potencia del módulo de cizallamiento complejo con la frecuencia de carga.
Se han empleado métodos basados en una sola célula para caracterizar las propiedades viscoelásticas de los glóbulos rojos, aplicando fuerza y midiendo el desplazamiento en función de la carga impuesta 2,3. Sin embargo, para el módulo de cizallamiento complejo, se pueden encontrar pocos resultados en la literatura. Utilizando la dispersión dinámica de la luz, se informaron valores para el almacenamiento de RBC y los módulos de pérdida que variaron de 0.01-1 Pa, en el rango de frecuencia de 1-100 Hz6. Mediante el uso de citometría óptica de torsión magnética, se obtuvo un módulo elástico complejo aparente7, y para fines de comparación, se afirmó un factor multiplicativo para posiblemente aclarar las discrepancias.
Más recientemente, se estableció una nueva metodología basada en pinzas ópticas (OT) junto con microscopía desenfocada (DM), como herramienta integrada para mapear cuantitativamente el almacenamiento y la pérdida de módulos de cizallamiento de eritrocitos humanos sobre cargas dependientes del tiempo 8,9. Además, se utilizó un modelo de reología vítrea suave para ajustar los resultados y obtener un coeficiente de ley de potencia que caracteriza a los glóbulos rojos 8,9.
En general, la metodología desarrollada8,9, cuyo protocolo se describe en detalle a continuación, aclara las discrepancias anteriores utilizando los valores medidos para el factor de forma, Ff, que relaciona las fuerzas y deformaciones con tensiones y deformaciones en la superficie de los glóbulos rojos y puede utilizarse como un nuevo método de diagnóstico capaz de determinar cuantitativamente los parámetros viscoelásticos y las características vítreas blandas de los glóbulos rojos obtenidos de individuos con sangre diferente. Patologías. Dicha caracterización, utilizando el protocolo que se describe a continuación, puede abrir nuevas posibilidades para comprender el comportamiento de los glóbulos rojos desde una perspectiva mecanobiológica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom dishes</td>
			<td>MatTek Life Sciences</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MXA22165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KaleidaGraph</td>
			<td>Synergy Software</td>
			<td>https://www.synergy.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR717805-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T1020CK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT laser</td>
			<td>IPG Photonics</td>
			<td>YLR-5-1064-LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17134-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber ring</td>
			<td>Forever Seals</td>
			<td>NBR O-Ring</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Z273554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage positioning</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-545.3R8S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>P1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of viscoelastic properties of red blood cells using optical tweezers and defocusing microscopy

Las propiedades viscoelásticas de los eritrocitos han sido investigadas por una variedad de técnicas. Sin embargo, los datos experimentales reportados varían. Esto no solo se atribuye a la variabilidad normal de las células, sino también a las diferencias en los métodos y modelos de respuesta celular. Aquí, se emplea un protocolo integrado que utiliza pinzas ópticas y microscopía de desenfoque para obtener las características reológicas de los glóbulos rojos en el rango de frecuencia de 1 Hz a 35 Hz. Mientras que las pinzas ópticas se utilizan para medir la constante elástica del complejo eritrocitario, la microscopía de desenfoque es capaz de obtener el perfil de altura de la célula, el volumen y su factor de forma, un parámetro que permite la conversión de la constante elástica compleja en módulo de corte complejo. Además, aplicando un modelo de reología vítrea suave, se puede obtener el exponente de escala para ambos módulos. La metodología desarrollada permite explorar el comportamiento mecánico de los glóbulos rojos, caracterizando sus parámetros viscoelásticos, obtenidos bajo condiciones experimentales bien definidas, para varias condiciones fisiológicas y patológicas.

La Figura 1 representa los esquemas del sistema OT utilizado para las mediciones reológicas. La figura 2 muestra los esquemas del experimento de microrreología con ambas esferas y también se muestra un RBC representativo. La Figura 3 muestra una curva típica para las amplitudes de ambas esferas en función del tiempo cuando los movimientos sinusoidales son producidos por la etapa piezoeléctrica. Mientras que la esfera de refere...

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Quantitative Analysis of Viscoelastic Properties of Red Blood Cells Using Optical Tweezers and Defocusing Microscopy

Aquí, se describe un protocolo integrado basado en pinzas ópticas y microscopía desenfocada para medir las propiedades reológicas de las células. Este protocolo tiene una amplia aplicabilidad en el estudio de las propiedades viscoelásticas de los eritrocitos en condiciones fisiopatológicas variables.

Análisis cuantitativo de las propiedades viscoelásticas de los glóbulos rojos mediante pinzas ópticas y microscopía desenfocada

The viscoelastic properties of erythrocytes have been investigated by a range of techniques. However, the reported experimental data vary. This is not ...

Esta metodología permite explorar el comportamiento mecánico de los eritrocitos, caracterizando sus parámetros viscoelásticos y características vítreas suaves para diversas condiciones fisiológicas y patológicas. Nuestro método basado en una sola célula verifica las referencias de video utilizando los valores de metal para el factor de forma que relaciona las fuerzas y los desplazamientos, las tensiones y los rasguños en la superficie de los eritrocitos. Comience vertiendo grasa de silicona sobre la superficie del anillo de goma de una manera que cubra todo el perímetro.A continuación, coloque el anillo de goma en el cubreobjetos con el lado de la grasa orientado hacia el cubreobjetos. Espere cinco minutos para la fijación adecuada, y los portamuestras estarán listos para recibir el cultivo celular. A continuación, con la solución de células previamente preparada siguiendo el protocolo escrito, sembrar las células en el portamuestras.Agregue 0.2 microlitros de una solución de esfera de poliestireno al 10% volumen por volumen a la muestra. Coloque el segundo cubreobjetos sobre el anillo de goma. Cierre la configuración y finalice la preparación de la muestra.Finalmente, mueva toda la muestra al microscopio. Para comenzar con la experimentación, use el sistema OT, atrape la esfera con el láser OT y luego conéctela al cubreobjetos, cerca de la célula. Luego, atrape otra esfera y repita el mismo procedimiento de fijación presionando la esfera contra la superficie de la celda, cerca de la superficie superior y cerca del borde de la celda.Añadir una función sinusoidal de amplitud y frecuencias variables. A continuación, presione el botón "start", usando la etapa piezoeléctrica para permitir el desplazamiento piezoeléctrico. Mantenga la esfera RBC en la trampa y envíe la muestra a un ciclo de movimientos utilizando la función sinusoidal previamente establecida.Para el análisis, abra el software ImageJ e importe toda la película obtenida durante los movimientos sinusoidales. Haga clic en ajustar y luego seleccione el umbral de opción. Ajuste el umbral con ambas barras de desplazamiento y seleccione la esfera de referencia haciendo clic en archivo, seguido de rectángulo.Luego, en la pestaña analizar, haga clic en la opción "establecer medidas" y seleccione el centro de masa". Haga clic de nuevo en la pestaña analizar y seleccione analizar partículas. Aparecerá una nueva ventana que contiene una tabla con coordenadas xy para el centro de la masa.Repita el procedimiento para la otra esfera unida a la superficie RBC. Abra el software de análisis e importe los archivos txt obtenidos anteriormente. Genere una gráfica con los centros de masa en el eje y y el tiempo en el eje x.Trazar los resultados en un gráfico usando el eje x para la constante de pérdida, denotado por K primo doble, y el eje y para la constante de almacenamiento, denotado por K primo. Primero, para la adquisición de video, mueva la etapa piezoeléctrica en la dirección xy, utilizando el software para buscar una celda aislada unida al cubreobjetos. Atrape y fije una esfera de poliestireno de diámetro conocido a la superficie RBC.A continuación, usando la etapa piezoeléctrica, mueva la cuenta atrapada unida a la superficie RBC para deformar la celda y luego conecte la cuenta al labio de la cubierta. Ahora, cambie la posición del eje z para encontrar la imagen enfocada. Después de fijar la posición, use el software de la cámara para crear una película de toda la celda.Luego, mueva la posición del eje z dos micrómetros hacia abajo o hacia arriba para obtener una imagen desenfocada para la celda elegida. Finalmente, sin cambiar la posición del eje z, busque una región sin celdas para repetir el mismo procedimiento y cree una película del fondo de la imagen. Para la adquisición de imágenes de contraste, primero busque el valor de N cero, haga clic en el icono de selección de polígono, luego haga clic en la pestaña analizar y seleccione la medida.A continuación, use la ecuación de contraste para determinar N imagen menos N cero, y ejecute esto seleccionando matemáticas"en proceso, seguido de restar. Más tarde, divida el resultado por N cero menos B.Finalmente, encuentre el contraste para las imágenes enfocadas y desenfocadas. Ahora, use la transformada de Hartley para obtener el grosor RBC.En ImageJ, haga clic en proceso, seguido de las opciones FFT" y FFT, y luego elija FHT. Luego realice la transformación inversa FHT seleccionando el proceso, seguido de FFT" y FFT. Utilice la imagen resultante para obtener el perfil de altura.Después de encontrar la imagen que contiene el perfil de altura RBC, use el contraste desenfocado de dos micrómetros para crear un conjunto de dos imágenes en ImageJ. Para encontrar el factor de forma, utilice una macro personalizada de ImageJ para analizar la pila. La macro entregará una tabla con la posición del borde, el perímetro, el inverso del perímetro y una imagen de la celda analizada.Compruebe si los bordes de esta imagen son similares a los bordes de la figura de referencia. De lo contrario, repita el procedimiento y use la suma del inverso del perímetro para encontrar el factor de forma. Comience organizando los datos experimentales en una tabla.Cree una nueva tabla en el software de análisis haciendo clic en la pestaña de archivo. Determine 10 columnas diferentes para los parámetros. Para trazar la curva G primo y G doble primo en el software de análisis, utilice los datos de la tabla anterior y haga clic en el botón "gráfico".Para obtener los parámetros Gamma y GM, haga clic en la pestaña de ajuste de curva y seleccione fit1" para abrir una nueva ventana. Seleccione el cuadrado, haga clic en el botón definir y escriba la ecuación. Haga clic en el botón "Aceptar" en ambas ventanas, y aparecerá el accesorio.A continuación, cree otras dos gráficas, a saber, G primo y G doble primo en función de omega. Coloque las barras de error solo en el eje y, como se demostró anteriormente. Repita el procedimiento de ajuste de curva, seleccione la opción G".Haga clic en definición de curva" en ajuste general y, a continuación, escriba la ecuación correspondiente. Finalmente, haga clic en aceptar y aparecerá un ajuste de curva junto con los valores de Alfa y G cero. Nuevamente, realice otro procedimiento de ajuste de curva.Seleccione G"opción, haga clic en definición de curva" en ajuste general y, a continuación, escriba la ecuación correspondiente. Finalmente, haga clic en aceptar y aparecerá un ajuste de curva. La figura muestra la constante elástica de almacenamiento en función de la constante elástica de pérdida.La dependencia lineal observada demuestra que la superficie RBC puede considerarse un material vítreo blando. Al aplicar los valores para el factor de forma celular general y el grosor de la superficie de RBC, se pueden determinar los valores para el exponente Alfa. Esta técnica puede proporcionar la base para nuevos métodos de diagnóstico que correlacionan los cambios en las propiedades viscoelásticas de los eritrocitos con modificaciones en el flujo sanguíneo de individuos con diferentes patologías.

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