Name: pattern generation for micropattern traction microscopy
Uploaded: 2022-02-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy at JoVE.com

De auteurs willen Dr. Paul Barbone van het Boston University Department of Mechanical Engineering bedanken voor nuttige discussies en hulp bij data-analyse. Deze studie werd ondersteund door NSF-subsidie CMMI-1910401.

1. Creatie van siliconen masters
OPMERKING: Het grootste deel van het proces van het ontwerp, de creatie en het oplossen van problemen met siliciummasters voor het herhaaldelijk vormen van PDMS-stempels is eerder behandeld21, dus alleen belangrijke verschillen in deze nieuwe aanpak zullen hier worden beschreven.
<ol><li>Maak het ontwerp voor het fotomasker met Behulp van AutoCAD of soortgelijke ontwerpsoftware. Bedek één kant van het fotomasker, een...

Een verbeterde methode voor het indirect patroon van PAA-hydrogels wordt in dit artikel beschreven. Deze aanpak bouwt voort op methoden die eerder zijn gebruikt 20,35,36,37,38,39,40,41,42. De belangrijkste verandering is d...

De meeste celfenotypen oefenen tractiekrachten uit op hun omgeving. Deze trekkrachten worden gegenereerd door het contractiele cytoskelet van een cel, een netwerk van actine en myosine, en andere filamenteuze biopolymeren en crosslinking eiwitten 1,2,3,4. Krachten die in de cel worden gegenereerd, kunnen worden overgedragen op de extracellulaire omgeving of aangrenzende cellen, voornamelijk via transmembraaneiwitten zoals respectievelijk integrinen en cadherinen 5,6. Hoe een cel zich verspreidt of samentrekt - en de grootte van de tractiekrachten die met die bewegingen gepaard gaan - is het resultaat van een intiem gesprek met zijn omgeving, dat grotendeels afhangt van het type en de hoeveelheid eiwit dat aanwezig is in de extracellulaire matrix (ECM)7,8 en de stijfheid van de ECM. Tractiekrachtmicroscopie is inderdaad een waardevol hulpmiddel geworden voor het begrijpen van de reactiesnelheid van cellen op lokale stimuli zoals substraatstijfheid, opgelegde mechanische spanningen en spanningen, of contact met andere cellen. Deze informatie is direct relevant voor het begrip van ziekten zoals kanker en astma 9,10,11,12.
Een systeem dat kan worden gebruikt om door kracht geïnduceerde vervorming van een substraat met bekende materiaaleigenschappen te meten, is vereist om tractiekrachten te berekenen. Deze veranderingen moeten in de loop van de tijd worden gevolgd, waarvoor zowel beeldvormings- als beeldverwerkingstechnieken nodig zijn. Een van de eerste methoden die werd gebruikt om cellulaire tractiekrachten te bepalen, was de observatie en analyse van de contractie van collageenhydrogels bezaaid met cellen, hoewel deze methode slechts semikwantitatief was13. Een andere, meer verfijnde methode was het meten van de trekkrachten die door afzonderlijke cellen werden uitgeoefend door de krachten te bepalen die het gevolg waren van de vervorming van een dun vel siliconen14. Later werden meer kwantitatieve meettechnieken ontwikkeld en deze methoden maakten ook het gebruik van zachte hydrogels zoals polyacrylamide (PAA)12,15,16 mogelijk. Bij gebruik van deze zachte materialen konden tractiekrachten worden bepaald uit de door kracht geïnduceerde verplaatsing van willekeurig verplaatste kralen ingebed in de hydrogel en de mechanische eigenschappen van de gel 16,17. Een andere vooruitgang kwam met de ontwikkeling van micropostarrays gemaakt van zacht polydimethylsiloxaan (PDMS), zodat hun afbuiging kon worden gemeten en omgezet in kracht met behulp van de bundeltheorie18.
Ten slotte werden methoden voor micropatterning van zachte hydrogels ontwikkeld, omdat deze benaderingen controle van de contactgebieden voor celadhesie mogelijk maken. Door de vervorming van het micropatroon binnen het contactgebied van een cel te meten, konden tractiekrachten eenvoudig worden berekend omdat een krachtvrij referentiebeeld niet nodig is19. Deze methode is op grote schaal toegepast omdat het de indirecte patroonvorming van een regelmatige reeks micron-sized, discrete fluorescerende eiwitadhesiepunten op PAA-gels mogelijk maakt voor het meten van cellulaire tractiekrachten20. Om deze krachten te berekenen, is een beeldverwerkingsalgoritme ontwikkeld, dat de bewegingen van elke microgepatterde stip kan volgen zonder gebruikersinvoer te vereisen21.
Hoewel deze methode eenvoudig is voor het maken van hele rasters van puntpatronen, is het ingewikkelder wanneer patronen van geïsoleerde patches (of eilanden) van stippen gewenst zijn. Microgepatterde eilanden zijn nuttig wanneer controle van de vorm en tot op zekere hoogte van de grootte van clusters van cellen nodig is. Om deze eilanden te maken, vereist de bovengenoemde methode van microcontactafdrukken twee verschillende stappen: i) het gebruik van één PDMS-stempel om een high-fidelity patroon van stippen op een coverslip te maken, en vervolgens ii) het gebruik van een tweede verschillende PDMS-stempel om de meeste van die stippen te verwijderen, waardoor geïsoleerde eilanden van stippen21 achterblijven. De moeilijkheid om eilanden te creëren met deze originele methode wordt nog verergerd door het feit dat het maken van consistente rasterpatronen in de eerste stap van het proces op zichzelf een uitdaging is. Microprinting stempels zijn samengesteld uit een reeks cirkelvormige microposten, waarvan de diameter overeenkomt met de gewenste puntgrootte. Deze stempels worden vervolgens gecoat met een gelijkmatige laag eiwit en vervolgens met een precieze hoeveelheid druk op behandelde coverslips gestempeld om het gewenste patroon te creëren. Aan de ene kant kan het uitoefenen van te veel druk op de stempel resulteren in ongelijke eiwitoverdracht en slechte patroongetrouwheid als gevolg van knikken of verzakkingen tussen pilaren, wat leidt tot contact met het glas. Aan de andere kant resulteert het uitoefenen van te weinig druk in weinig tot geen eiwitoverdracht en slechte patroongetrouwheid. Om deze redenen is een overdrachtsproces gewenst dat kan worden gebruikt om consequent hoogwaardige micropatronen van geïsoleerde eilanden van stippen in slechts één stap te maken.
Hierin wordt een methode beschreven voor het indirect micropatteren van eilanden van micron-formaat fluorescerende eiwitadhesiepunten op een PAA-gel die consistenter en veelzijdiger is dan eerder ontwikkelde methoden. Terwijl oudere indirecte micropatterningmethoden afhankelijk zijn van de overdracht van eiwitpatronen van een PDMS-stempel naar een tussensubstraat, gebruikt de hier geïntroduceerde methode PDMS-stempels in plaats daarvan als een vat voor eiwitverwijdering, niet voor toevoeging. Dit wordt gedaan door eerst de structuur van de gebruikte PDMS-stempels fundamenteel te veranderen. In plaats van stempels te maken die zijn samengesteld uit een patroon van gelijkmatig verdeelde cirkelvormige pilaren, zijn stempels opgebouwd uit een patroon van gelijkmatig verdeelde cirkelvormige gaten in deze methode.
Met deze nieuwe structuur kan het oppervlak van deze PDMS-stempels vervolgens worden behandeld met glutaaraldehyde zoals eerder beschreven 20,29,30, waardoor de stempel covalent kan binden met eiwit. Bij gebruik op een glazen afdekplaat gelijkmatig gecoat met fluorescerend eiwit, worden deze met glutaaraldehyde behandelde PDMS-stempels gebruikt om het grootste deel van het eiwit op het oppervlak van de coverslip te verwijderen, waardoor alleen het gewenste patroon van stippen achterblijft dat vooraf wordt bepaald door de locatie van gaten ter grootte van micron op de stempel. Deze verandering verhoogt het slagingspercentage voor het genereren van patronen die bestaan uit een bijna continu raster van stippen en voor het creëren van geïsoleerde eilanden van stippen door slechts één stap.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-aminopropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#281778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask</td>
			<td>Advance Reproductions Corporation</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-designed mask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#A18P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide Solution, 40%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#A4058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#A20000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminonium Persulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#BP179-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#PR-V3141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Greenfield Global</td>
			<td>#111000200C1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslips, 25 mm round</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>#12-545-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslips, 30 mm round</td>
			<td>Warner</td>
			<td>#64-1499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu ORCA-R2 Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>#C10600-10B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>#HP1051P</td>
			<td>Used to isolate fibronectin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid, 1.0 N</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>#1.09057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Wayne Rasband</td>
			<td>#1.53n</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interchangeable Coverslip Dish Set</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>#190310-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim Wipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#06-666-11C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask Alinger</td>
			<td>Karl Suss</td>
			<td>#MA6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab 2021</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>#R2021a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph Basic</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>#v7.7.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide ester</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#130672-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live Cell Stain</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#52-1308-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist Spinner Hood</td>
			<td>Headway Research</td>
			<td>#PWM32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick</td>
			<td>#PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Etcher</td>
			<td>TePla</td>
			<td>#M4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior Lumen 200Pro Light Source</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>#L200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafers, 100 mm</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>#809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2005</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials Inc.</td>
			<td>#NC9463827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials Inc.</td>
			<td>#NC9901158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer</td>
			<td>Essex Brownell</td>
			<td>#DC-184-1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#BP150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#448931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAPON-40XW340 Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#N2709300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Flood Exposure</td>
			<td>Newport</td>
			<td>#69910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>#19395-40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pattern generation for micropattern traction microscopy

Micropattern tractiemicroscopie maakt controle van de vorm van enkele cellen en celclusters mogelijk. Bovendien maakt de mogelijkheid om op de micrometerlengteschaal te patroon het gebruik van deze patrooncontactzones mogelijk voor het meten van tractiekrachten, omdat elke microgepatterde stip de vorming van een enkele focale adhesie mogelijk maakt die vervolgens de zachte, onderliggende hydrogel vervormt. Deze aanpak is gebruikt voor een breed scala aan celtypen, waaronder endotheelcellen, gladde spiercellen, fibroblasten, bloedplaatjes en epitheelcellen. 
Deze review beschrijft de evolutie van technieken die het mogelijk maken om extracellulaire matrixeiwitten op polyacrylamidehydrogels te printen in een regelmatige reeks stippen van vooraf gespecificeerde grootte en afstand. Omdat patronen op micrometerschaal moeilijk direct op zachte substraten kunnen worden afgedrukt, worden patronen eerst gegenereerd op stijve glazen afdekkingsplaten die vervolgens worden gebruikt om het patroon tijdens de gelation naar de hydrogel over te brengen. Eerst wordt de oorspronkelijke microcontactprintbenadering beschreven om arrays van kleine stippen op de coverslip te genereren. Een tweede stap die het grootste deel van het patroon verwijdert om eilanden van kleine stippen te verlaten, is nodig om de vormen van cellen en celclusters op dergelijke arrays van patroonstippen te regelen. 
Vervolgens wordt een evolutie van deze benadering beschreven die het mogelijk maakt om eilanden van stippen te genereren met behulp van een enkele subtractieve patroonstap. Deze aanpak is sterk vereenvoudigd voor de gebruiker, maar heeft het nadeel van een kortere levensduur voor de hoofdmal die nodig is om de patronen te maken. Ten slotte worden de computationele benaderingen beschreven die zijn ontwikkeld voor de analyse van afbeeldingen van verplaatste stippen en daaropvolgende door cellen gegenereerde tractievelden en worden bijgewerkte versies van deze analysepakketten verstrekt.

PAA-hydrogels met de Young's modulus van E = 3,6 kPa en de Poisson's ratio van ν = 0,445 werden gemaakt voor gebruik door deze subtractieve micropatterning methode. De hydrogels zijn gemaakt om ~ 100 μm dik te zijn, waardoor ze kunnen worden afgebeeld met de beeldvormingsopstelling die hier wordt gebruikt, terwijl ook wordt voorkomen dat de cellen de stijve coverslip onder de gel detecteren, wat problemen zou veroorzaken in studies gericht op cellulaire stijfheidsdetectie23,33<...

Watch this Scientific Journal Video about Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy at JoVE.com

Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

We beschrijven verbeteringen aan een standaardmethode voor het meten van cellulaire tractiekrachten, gebaseerd op microcontactprinten met een enkele subtractieve patroonstap van puntarrays van extracellulaire matrixeiwitten op zachte hydrogels. Deze methode zorgt voor een eenvoudigere en consistentere fabricage van eilandpatronen, essentieel voor het regelen van de vorm van de celcluster.

Patroongeneratie voor micropatterntractiemicroscopie

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer ...

Dit protocol zorgt voor de consistente creatie van high-fidelity eiwit micropatronen van elke gewenste vorm, met name geïsoleerde eilanden van patroon voor de studie van celclusters. Deze techniek kan worden gebruikt om geïsoleerde eilandmicropatronen van elke vorm en grootte in slechts één stap te maken, terwijl voorheen het maken van dergelijke patronen twee afzonderlijke stappen vereiste. Begin met het mengen van PDMS in de juiste uithardingsmiddel-basisverhouding zoals beschreven in de instructies van de fabrikant.Incubeer bij kamertemperatuur en druk gedurende 15 minuten en ontgaad het mengsel vervolgens gedurende 15 minuten onder vacuüm. Giet de PDMS in de hoofdvorm en breng het over naar een incubator die is ingesteld op 37 graden Celsius om 's nachts uit te harden. Verwijder de hoofdvorm uit de incubator en laat deze afkoelen tot kamertemperatuur.Terwijl de hoofdmal afkoelt, soniceer je 25 millimeter coverslips in ethanol gedurende 10 minuten. Gebruik evenveel coverslips als het aantal postzegels dat wordt voorbereid. Spoel de coverslips grondig af met DI-water en droog ze met een gefilterd luchtpistool.Behandel de coverslips gedurende één minuut met plasma met behulp van de plasmareiniger onder een hoog vacuüm. Laat het vacuüm na de behandeling langzaam los om te voorkomen dat de dekzeilen in de kamer bewegen. Bestrijk elke coverslip met 100 microliter van de fluorescerende gelabelde eiwitoplossing in een ruimte zonder direct zonlicht of bovenlicht.Dek de monsters af voor extra bescherming tegen licht en incubeer ze gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Spoel elke afdekplaat grondig af met DI-water. Verwijder overtollig water van het oppervlak door voorzichtig op de zijkanten van elke dekplaat op een papieren handdoek of een vergelijkbaar absorberend materiaal te tikken.Laat de dekens volledig drogen door ze minstens 30 minuten onbedekt in het donker te laten. Terwijl de met eiwitten gecoate coverslips drogen, verwijdert u de PDMS-stempel uit de hoofdvorm door deze te snijden met een scalpel of een scherp mes. Behandel de PDMS-stempels met plasma gedurende twee minuten onder een hoog vacuüm.Plaats de stempels in een container met een deksel onder de zuurkast en bedek vervolgens elke stempel met een dunne laag van 10% 3-APTMS verdund in 100% ethanol. Bedek de container met de stempels en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Spoel elke stempel aan beide zijden grondig af met DI-water.Plaats de stempels in een schone container en bekleed ze met 2,5% glutaaraldehyde bereid in DI-water. Bedek de stempels en incubeer ze op kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Spoel de stempels grondig af met DI-water.Verwijder overtollig water van het oppervlak zoals eerder beschreven en laat de stempels 30 minuten onbedekt drogen. Als na 30 minuten de met eiwitten bedekte coverslips of de stempels niet volledig droog zijn, gebruik dan een gefilterd luchtpistool om ze volledig te drogen. Duw de patroonzijde van de stempels op de dekplaten met voldoende druk om ze volledig contact te laten maken.Laat het 15 minuten ongestoord. Pel vervolgens voorzichtig de PDMS-stempels van de coverslips. Controleer met behulp van een fluorescerende microscoop met het juiste filter de getrouwheid van de patroondeksels.Gebruik de patroondeksels onmiddellijk of bewaar ze uit de buurt van direct licht tot verder gebruik. Voordat u de PAA hydrogel-precursor bereidt, verwijdert u de acrylzuur NHS-ester uit de koelkast om op kamertemperatuur te komen voordat u deze opent. Bereid een verwisselbare coverslip schotelset door deze te steriliseren met 70% ethanol en incubaleer deze vervolgens onder UV-licht in een bioveiligheidskast gedurende ten minste 30 minuten voor gebruik.Voeg onder de zuurkast 1,25 milliliter 40% acrylamide bereid in DI-water toe aan een conische buis van 15 milliliter. Voeg aan dezelfde buis 175 microliter bis-acrylamideoplossing toe, bereid in DI-water. Voeg vervolgens 500 microliter 10X PBS toe, gevolgd door 2.915 milliliter DI-water.Pipetteer 969 microliter van deze precursor in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en bewaar de rest bij vier graden Celsius gedurende maximaal twee weken. Meet 50 tot 100 milligram APS in een verse microcentrifugebuis en verdun deze tot 100 milligram per milliliter in DI-water. Open de NHS-ester in de kap en meet zorgvuldig tot drie milligram NHS in een microcentrifugebuis.Verdun de NHS-ester tot één milligram per milliliter in 1X PBS. Voeg onder de zuurkast twee microliter TEMED toe aan de microcentrifugebuis die het aliquot van 969 microliter PAA-precursor bevat. Voeg 15 microliter van één molaire HCL toe om de pH van de hydrogeloplossing te verlagen en hydrolyse van de NHS-ester te voorkomen.Voeg 10 microliter van de NHS-esteroplossing toe aan de buis. Voer de volgende stappen uit in een bioveiligheidskast. Plaats de 30 millimeter coverslip voorzichtig in het middelste deel van de coverslip schotelset met de 3-APTMS en glutaraldehyde behandelde kant naar boven en schroef de plastic ring erop.Stel de patroondeksellip in met minimale blootstelling aan licht om u voor te bereiden op de volgende stap. Pipetteer vijf microliter APS-oplossing in de PAA-voorloper aliquotbuis, keer vervolgens om en meng. Pipetteer onmiddellijk 35 microliter van deze oplossing op de afdekplaat van 30 millimeter.Plaats de patroondeksel op de oplossing met de eiwitzijde naar beneden. Pas op dat u geen luchtbellen in de hydrogel creëert. Bescherm de hydrogel tegen licht en laat hem 90 minuten polymeriseren.Zodra de hydrogel is gepolymeriseerd, gebruik je een scheermesje of scalpel om de bovenste coverslip te verwijderen, zorg je ervoor dat de coverslip niet terugvalt of van de gel glijdt zodra deze is verwijderd om te voorkomen dat het patroon op het oppervlak van de gel wordt verpest. Om de resterende NHS-ester in de hydrogel te passiveren, voegt u twee milliliter steriel PBS toe aan de gel en incubeert u gedurende 45 minuten bij 37 graden Celsius. Bereid de gels onmiddellijk voor op experimenten of bewaar ze een nacht in steriel PBS bij vier graden Celsius tot verder gebruik.De hydrogels werden indirect gemodelleerd met fluorescerend fibronectine om cellulaire tractiekrachten binnen clusters te visualiseren en te meten en eilandpatronen van vooraf bepaalde grootte en vorm te creëren. De patroonkwaliteit was direct gerelateerd aan de getrouwheid van de meestermal waaruit de PDMS-stempel was gegoten. Deze methode zou geïsoleerde, goed gedefinieerde eilandpatronen van vooraf bepaalde vorm kunnen fabriceren.De fibronectine adhesie stippen waren alleen aanwezig binnen het gewenste gebied van het eiland. Deze geïsoleerde eilanden van adhesiepunten maakten het verder mogelijk om de clustervorm beter te beheersen. Het coaten van PDMS-stempels met twee kleine 3-APTMS is van cruciaal belang omdat het de effectiviteit van de verwijderingsmethode zal beperken, terwijl te veel een oranje residu op het stempeloppervlak zal creëren.De patronen die hier worden gecreëerd, kunnen worden gebruikt om cellulaire tractiekrachten in zowel individuele cellen als clusters te bepalen, wat inzicht geeft in hun vermogen om mechanische homeostase te behouden.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Low-Cost Cryo-Light Microscopie Stage Fabrication voor Gecorreleerde Light / Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Een nieuwe methode voor het lokaliseren van Reporter Fluorescent Beads Dichtbij de celkweek Surface voor Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van Quantum Dot Nanodeeltjes

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Een High-throughput Cell Microarray Platform voor Correlatieve Analyse van de Cel Differentiatie en trekkrachten

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Pattern-based Search of Epigenomic Data Using GeNemo

Patroon-based Search van Epigenomic gegevens met behulp van GeNemo

Compared with the robust text-based search tools for genomic or RNA sequencing data, current methodologies for pattern-based searches of epigenomic and ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Oereenstemming lichte elektronenmicroscopie (CLEM) voor het bijhouden en Imaging virale eiwitten verbonden structuren in Cryo-geïmmobiliseerd cellen

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualiseren van hechting vorming in cellen door middel van geavanceerde draaiende schijf-totale interne reflectie fluorescentie microscopie

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

Beheer van de clusters van de eerste 3D-cel in een hybride Gel kubus apparaat voor herhaalbare patroon formaties

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Hoge doorvoer Tractiekracht microscopie met behulp van PDM'S onthult dosisafhankelijke effecten van het transformeren van groei factor-β op de epitheliale-naar-mesenchymale overgang

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualisatie van Germinosomes en het binnenste membraan in sporen van Bacillus subtilis

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...