Name: pattern generation for micropattern traction microscopy
Uploaded: 2022-02-17T14:00:00
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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Paul Barbone du Département de génie mécanique de l’Université de Boston pour ses discussions utiles et son aide à l’analyse des données. Cette étude a été soutenue par la subvention CMMI-1910401 de la NSF.

1. Création de masters en silicone
REMARQUE: La majeure partie du processus de conception, de création et de dépannage des maîtres de silicium pour le moulage répété des tampons PDMS a été couverte précédemment21, de sorte que seules les principales différences de cette nouvelle approche seront décrites ici.
<ol><li>Créez la conception du photomasque à l’aide d’AutoCAD ou d’un logiciel de conception similaire. Enduisez un côté d...

Une méthode améliorée de modelage indirect des hydrogels PAA est décrite dans cet article. Cette approche s’appuie sur des méthodes qui ont été utilisées précédemment 20,35,36,37,38,39,40,41,42. Le principal ch...

La plupart des phénotypes cellulaires exercent des forces de traction sur leur environnement. Ces forces de traction sont générées par le cytosquelette contractile d’une cellule, qui est un réseau d’actine et de myosine, et d’autres biopolymères filamenteux et protéines de réticulation 1,2,3,4. Les forces générées à l’intérieur de la cellule peuvent être transmises à l’environnement extracellulaire ou aux cellules adjacentes, principalement via des protéines transmembranaires telles que les intégrines et les cadhérines, respectivement 5,6. La façon dont une cellule se propage ou se contracte - et l’ampleur des forces de traction associées à ces mouvements - est le résultat d’une conversation intime avec son environnement, qui dépend en grande partie du type et de la quantité de protéines présentes dans la matrice extracellulaire (ECM)7,8 et de la rigidité de l’ECM. En effet, la microscopie à force de traction est devenue un outil inestimable pour comprendre la réactivité cellulaire aux stimuli locaux tels que la rigidité du substrat, les contraintes et déformations mécaniques imposées, ou le contact avec d’autres cellules. Cette information est directement pertinente pour la compréhension de maladies telles que le cancer et l’asthme 9,10,11,12.
Un système pouvant être utilisé pour mesurer la déformation induite par la force d’un substrat aux propriétés connues d’un matériau est nécessaire pour calculer les forces de traction. Ces changements doivent être suivis au fil du temps, ce qui nécessite à la fois des techniques d’imagerie et de traitement d’image. L’une des premières méthodes utilisées pour déterminer les forces de traction cellulaire a été l’observation et l’analyse de la contraction des hydrogels de collagène ensemencés avec des cellules, bien que cette méthode n’ait été que semi-quantitative13. Une autre méthode, plus raffinée, consistait à mesurer les forces de traction exercées par des cellules individuelles en déterminant les forces résultant de la déformation d’une fine feuille de silicone14. Plus tard, des techniques de mesure plus quantitatives ont été développées, et ces méthodes ont également permis l’utilisation d’hydrogels mous tels que le polyacrylamide (PAA)12,15,16. Lors de l’utilisation de ces matériaux mous, les forces de traction ont pu être déterminées à partir du déplacement induit par la force des billes déplacées aléatoirement incorporées dans l’hydrogel et des propriétés mécaniques du gel16,17. Une autre avancée est venue avec le développement de réseaux de micropostes en polydiméthylsiloxane mou (PDMS) afin que leur déviation puisse être mesurée et convertie en force en utilisant la théorie du faisceau18.
Enfin, des méthodes de micromotifs d’hydrogels mous ont été développées car ces approches permettent de contrôler les zones de contact pour l’adhésion cellulaire. En mesurant la déformation du micromotif dans la zone de contact d’une cellule, les forces de traction pourraient facilement être calculées car une image de référence sans force n’est pas nécessaire19. Cette méthode a été largement adoptée car elle permet la modélisation indirecte d’un réseau régulier de points d’adhésion de protéines fluorescentes discrètes de la taille d’un micron sur des gels PAA pour la mesure des forces de traction cellulaire20. Pour calculer ces forces, un algorithme de traitement d’image, qui permet de suivre les mouvements de chaque point micromotif sans nécessiter l’intervention de l’utilisateur, a été développé21.
Bien que cette méthode soit simple pour créer des grilles entières de motifs de points, elle est plus compliquée lorsque des motifs de taches isolées (ou d’îlots) de points sont souhaités. Les îlots à micromotifs sont utiles lorsque le contrôle de la forme et, dans une certaine mesure, de la taille des amas de cellules est nécessaire. Pour créer ces îlots, la méthode d’impression par microcontact susmentionnée nécessite deux étapes distinctes : i) l’utilisation d’un tampon PDMS pour créer un motif haute fidélité de points sur un couvercle, puis ii) l’utilisation d’un deuxième tampon PDMS différent pour enlever la plupart de ces points, laissant derrière eux des îlots isolés de points21. La difficulté de créer des îlots avec cette méthode originale est aggravée par le fait que la création de modèles de grille cohérents dans la première étape du processus est difficile en soi. Les timbres de micro-impression sont composés d’un ensemble de micro-poteaux circulaires, dont le diamètre correspond à la taille de point souhaitée. Ces tampons sont ensuite recouverts d’une couche uniforme de protéines, puis estampés avec une pression précise sur les couvercles traités pour créer le motif souhaité. D’une part, l’application d’une pression excessive sur le tampon peut entraîner un transfert de protéines inégal et une mauvaise fidélité du motif en raison du flambement des piliers ou de l’affaissement entre les piliers, entraînant un contact avec le verre. D’autre part, l’application de trop peu de pression entraîne peu ou pas de transfert de protéines et une mauvaise fidélité du modèle. Pour ces raisons, un processus de transfert pouvant être utilisé pour créer de manière cohérente des micromotifs de haute qualité d’îlots de points isolés en une seule étape est souhaité.
Ici, une méthode est décrite pour le micromotif indirect d’îlots de points d’adhésion de protéines fluorescentes de taille micronique sur un gel PAA qui est plus cohérent et polyvalent que les méthodes précédemment développées. Alors que les anciennes méthodes de micromodélisme indirect reposent sur le transfert de motifs protéiques d’un tampon PDMS à un substrat intermédiaire, la méthode présentée ici utilise plutôt des tampons PDMS comme récipient pour l’élimination des protéines, et non pour l’addition. Cela se fait d’abord en changeant fondamentalement la structure des timbres PDMS utilisés. Plutôt que de fabriquer des timbres composés d’un motif de piliers circulaires uniformément espacés, les timbres sont constitués d’un motif de trous circulaires uniformément espacés dans cette méthode.
Avec cette nouvelle structure, la surface de ces tampons PDMS peut ensuite être traitée avec du glutaraldéhyde comme décrit précédemment 20,29,30, ce qui rend le tampon capable de se lier de manière covalente avec la protéine. Lorsqu’ils sont utilisés sur un couvercle en verre recouvert uniformément de protéines fluorescentes, ces tampons PDMS traités au glutaraldéhyde sont utilisés pour éliminer la majeure partie de la protéine à la surface du couvercle, ne laissant derrière eux que le motif souhaité de points prédéterminé par l’emplacement des trous de la taille d’un micron sur le tampon. Ce changement augmente le taux de réussite pour générer des modèles constitués d’une grille de points presque continue et pour créer des îlots isolés de points en une seule étape.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-aminopropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#281778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask</td>
			<td>Advance Reproductions Corporation</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-designed mask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#A18P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide Solution, 40%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#A4058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#A20000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminonium Persulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#BP179-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#PR-V3141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Greenfield Global</td>
			<td>#111000200C1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslips, 25 mm round</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>#12-545-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslips, 30 mm round</td>
			<td>Warner</td>
			<td>#64-1499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu ORCA-R2 Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>#C10600-10B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>#HP1051P</td>
			<td>Used to isolate fibronectin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid, 1.0 N</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>#1.09057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Wayne Rasband</td>
			<td>#1.53n</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interchangeable Coverslip Dish Set</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>#190310-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim Wipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#06-666-11C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask Alinger</td>
			<td>Karl Suss</td>
			<td>#MA6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab 2021</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>#R2021a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph Basic</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>#v7.7.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide ester</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#130672-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live Cell Stain</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#52-1308-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist Spinner Hood</td>
			<td>Headway Research</td>
			<td>#PWM32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick</td>
			<td>#PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Etcher</td>
			<td>TePla</td>
			<td>#M4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior Lumen 200Pro Light Source</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>#L200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafers, 100 mm</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>#809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2005</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials Inc.</td>
			<td>#NC9463827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials Inc.</td>
			<td>#NC9901158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer</td>
			<td>Essex Brownell</td>
			<td>#DC-184-1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#BP150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#448931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAPON-40XW340 Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#N2709300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Flood Exposure</td>
			<td>Newport</td>
			<td>#69910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>#19395-40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pattern generation for micropattern traction microscopy

La microscopie de traction à micromotifs permet de contrôler la forme des cellules individuelles et des amas de cellules. En outre, la capacité de modeler à l’échelle de longueur micrométrique permet l’utilisation de ces zones de contact à motifs pour la mesure des forces de traction, car chaque point micromotif permet la formation d’une seule adhérence focale qui déforme ensuite l’hydrogel sous-jacent mou. Cette approche a été utilisée pour un large éventail de types de cellules, y compris les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses, les fibroblastes, les plaquettes et les cellules épithéliales. 
Cette revue décrit l’évolution des techniques qui permettent l’impression de protéines de matrice extracellulaire sur des hydrogels de polyacrylamide dans un tableau régulier de points de taille et d’espacement prédéfinis. Comme les motifs à l’échelle micrométrique sont difficiles à imprimer directement sur des substrats souples, les motifs sont d’abord générés sur des couvercles en verre rigide qui sont ensuite utilisés pour transférer le motif à l’hydrogel pendant la gélification. Tout d’abord, l’approche originale d’impression par microcontact pour générer des tableaux de petits points sur le couvercle est décrite. Une deuxième étape qui supprime la majeure partie du motif pour laisser des îlots de petits points est nécessaire pour contrôler les formes des cellules et des amas de cellules sur de tels tableaux de points à motifs. 
Ensuite, une évolution de cette approche qui permet la génération d’îlots de points à l’aide d’une seule étape de motif soustractif est décrite. Cette approche est grandement simplifiée pour l’utilisateur mais présente l’inconvénient d’une durée de vie réduite pour le moule maître nécessaire à la fabrication des motifs. Enfin, les approches informatiques qui ont été développées pour l’analyse des images de points déplacés et des champs de traction générés par des cellules ultérieures sont décrites, et des versions mises à jour de ces packages d’analyse sont fournies.

Des hydrogels PAA avec le module de Young de E = 3,6 kPa et le rapport de Poisson de ν = 0,445 ont été fabriqués pour être utilisés par cette méthode de micromotif soustractif. Les hydrogels ont été conçus pour avoir une épaisseur d’environ 100 μm, ce qui leur permet d’être imagés avec la configuration d’imagerie utilisée ici tout en empêchant les cellules de détecter le couvercle rigide sous le gel, ce qui poserait des problèmes dans les études axées sur la détection de rigid...

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Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

Nous décrivons les améliorations apportées à une méthode standard de mesure des forces de traction cellulaire, basée sur l’impression par microcontact avec une seule étape de motif soustractif de réseaux de points de protéines de matrice extracellulaire sur des hydrogels mous. Cette méthode permet une fabrication plus simple et plus cohérente de motifs d’îlots, essentiels pour contrôler la forme des amas de cellules.

Génération de motifs pour la microscopie de traction à micromotifs

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer ...

Ce protocole permet la création cohérente de micro-modèles protéiques haute fidélité de la forme souhaitée, notamment des îlots de motif isolés pour l’étude des amas cellulaires. Cette technique peut être utilisée pour créer des micro-motifs insulaires isolés de toute forme et taille en une seule étape, alors qu’auparavant, la fabrication de tels modèles nécessitait deux étapes distinctes. Commencez par mélanger le PDMS dans le bon rapport agent de durcissement /base, comme décrit dans les instructions du fabricant.Incuber à température et pression ambiantes pendant 15 minutes, puis dégazer le mélange sous vide pendant 15 minutes. Versez le PDMS dans le moule maître et transférez-le dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius pour durcir pendant la nuit. Retirez le moule maître de l’incubateur et laissez-le refroidir à la température ambiante.Pendant que le moule maître refroidit, sonicez des couvercles de 25 millimètres dans de l’éthanol pendant 10 minutes. Utilisez autant de couvertures que le nombre de timbres en cours de préparation. Rincez soigneusement les couvercles avec de l’eau DI et séchez-les à l’aide d’un pistolet à air filtré.Traitez les couvercles avec du plasma pendant une minute à l’aide du nettoyeur plasma sous vide poussé. Relâchez lentement le vide après le traitement pour empêcher les couvercles de se déplacer à l’intérieur de la chambre. Enduisez chaque couvercle de 100 microlitres de la solution protéique marquée fluorescente dans une pièce dépourvue de lumière directe du soleil ou d’éclairage aérien.Couvrez les échantillons pour une protection supplémentaire contre la lumière et incubez-les pendant 20 minutes à température ambiante. Rincez soigneusement chaque couvercle avec de l’eau DI. Éliminez l’excès d’eau de la surface en tapotant doucement les côtés de chaque couvercle sur une serviette en papier ou un matériau absorbant similaire.Laissez les couvercles sécher complètement en les laissant à découvert dans l’obscurité pendant au moins 30 minutes. Pendant que les couvercles recouverts de protéines sèchent, retirez le tampon PDMS du moule principal en le coupant avec un scalpel ou une lame tranchante. Traitez les tampons PDMS avec du plasma pendant deux minutes sous vide poussé.Placez les tampons dans un récipient avec un couvercle sous la hotte, puis enduisez chaque tampon d’une fine couche de 10% 3-APTMS diluée dans de l’éthanol à 100%. Couvrir le récipient avec les tampons et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Rincez soigneusement chaque tampon des deux côtés avec de l’eau DI.Placez les timbres dans un récipient propre et enduisez-les de 2,5% de glutaraldéhyde préparé dans de l’eau DI. Couvrez les timbres et incubez-les à température ambiante pendant 30 minutes. Rincez soigneusement les tampons à l’eau DI.Retirez l’excès d’eau de la surface comme décrit précédemment et laissez les timbres sécher à découvert pendant 30 minutes. Si, après 30 minutes, les couvercles ou les tampons recouverts de protéines ne sont pas complètement secs, utilisez un pistolet à air filtré pour les sécher complètement. Poussez le côté motif des tampons sur les couvercles avec suffisamment de pression pour qu’ils puissent entrer en contact complet.Laissez-le tranquille pendant 15 minutes. Ensuite, décollez soigneusement les tampons PDMS des couvercles. À l’aide d’un microscope fluorescent avec le filtre approprié, vérifiez la fidélité des couvercles à motifs.Utilisez immédiatement les couvercles à motifs ou rangez-les à l’abri de la lumière directe jusqu’à une utilisation ultérieure. Avant de préparer le précurseur d’hydrogel PAA, retirez l’ester d’acide acrylique NHS du réfrigérateur pour atteindre la température ambiante avant d’être ouvert. Préparez un plat à couvercle interchangeable en le stérilisant avec de l’éthanol à 70%, puis incuvrez-le sous la lumière UV dans une armoire de biosécurité pendant au moins 30 minutes avant utilisation.Sous la hotte, ajouter 1,25 millilitre d’acrylamide à 40 % préparé dans de l’eau DI à un tube conique de 15 millilitres. Dans le même tube, ajouter 175 microlitres de solution de bis-acrylamide préparée dans de l’eau DI. Ajoutez ensuite 500 microlitres de 10X PBS, suivis de 2,915 millilitres d’eau DI.Pipette 969 microlitres de ce précurseur dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et stocker le reste à quatre degrés Celsius pendant deux semaines. Mesurez 50 à 100 milligrammes d’APS dans un tube de microcentrifugation frais et diluez-le à 100 milligrammes par millilitre dans de l’eau DI. Ouvrez l’ester NHS dans la hotte et mesurez soigneusement jusqu’à trois milligrammes de NHS dans un tube de microcentrifugation.Diluer l’ester NHS à un milligramme par millilitre dans 1X PBS. Sous la hotte, ajouter deux microlitres de TEMED au tube de microcentrifugation contenant l’aliquote de 969 microlitres de précurseur PAA. Ajouter 15 microlitres d’un HCL molaire pour diminuer le pH de la solution d’hydrogel et éviter l’hydrolyse de l’ester NHS.Ajouter 10 microlitres de la solution d’ester NHS au tube. Effectuez les étapes suivantes dans une armoire de biosécurité. Placez soigneusement le couvercle de 30 millimètres dans la partie centrale de l’ensemble de couvercles avec le 3-APTMS et le glutaraldéhyde traité côté vers le haut et vissez l’anneau en plastique sur le dessus.Configurez le couvercle à motifs avec une exposition minimale à la lumière pour vous préparer à l’étape suivante. Pipette cinq microlitres de solution APS dans le tube aliquote précurseur PAA, puis inverser et mélanger. Pipettez immédiatement 35 microlitres de cette solution sur le couvercle de 30 millimètres.Placez le couvercle à motifs sur la solution avec le côté protéine vers le bas. Attention à ne pas créer de bulles d’air dans l’hydrogel. Protégez l’hydrogel de la lumière et laissez-le polymériser pendant 90 minutes.Une fois l’hydrogel polymérisé, utilisez une lame de rasoir ou un scalpel pour enlever le couvercle supérieur, assurez-vous que le couvercle ne retombe pas ou ne glisse pas du gel une fois retiré pour éviter de ruiner le motif à la surface du gel. Pour passiver tout ester NHS restant dans l’hydrogel, ajoutez deux millilitres de PBS stérile au gel et incubez à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes. Préparez immédiatement les gels pour des expériences ou conservez-les pendant la nuit dans du PBS stérile à quatre degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure.Les hydrogels ont été indirectement modelés avec de la fibronectine fluorescente pour visualiser et mesurer les forces de traction cellulaire au sein des grappes et créer des motifs d’îlots de taille et de forme prédéterminées. La qualité du motif était directement liée à la fidélité du moule maître à partir duquel le tampon PDMS a été coulé. Cette méthode pourrait fabriquer des motifs d’îlots isolés, bien définis, de forme prédéterminée.Les points d’adhésion à la fibronectine n’étaient présents que dans la zone souhaitée de l’île. Ces îlots isolés de points d’adhésion ont en outre permis un meilleur contrôle de la forme de l’amas. Le revêtement des tampons PDMS avec deux petits 3-APTMS est essentiel car il limitera l’efficacité de la méthode d’élimination, tandis qu’un trop grand nombre créera un résidu orange sur la surface du timbre.Les modèles créés ici peuvent être utilisés pour déterminer les forces de traction cellulaire dans les cellules individuelles et les amas, ce qui donne un aperçu de leur capacité à maintenir l’homéostasie mécanique.

Research

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Low-Cost Cryo-Lumière de fabrication étape par microscopie lumineuse corrélées / Electron Microscopy

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dynamics ...

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