Name: pattern generation for micropattern traction microscopy
Uploaded: 2022-02-17T14:00:00
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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Paul Barbone del Dipartimento di Ingegneria Meccanica dell'Università di Boston per le discussioni utili e l'assistenza con l'analisi dei dati. Questo studio è stato supportato dalla sovvenzione NSF CMMI-1910401.

1. Creazione di master in silicone
NOTA: la maggior parte del processo di progettazione, creazione e risoluzione dei problemi dei master in silicio per lo stampaggio ripetuto di timbri PDMS è stato trattato in precedenza21, quindi qui verranno descritte solo le differenze chiave in questo nuovo approccio.
<ol><li>Creare il design per la maschera fotografica utilizzando AutoCAD o software di progettazione simile. Rivestire un lato della fotomaschera, ...

Un metodo migliorato per modellare indirettamente gli idrogel PAA è descritto in questo articolo. Questo approccio si basa su metodi che sono stati utilizzati in precedenza 20,35,36,37,38,39,40,41,42. Il cambiamento princ...

La maggior parte dei fenotipi cellulari esercita forze di trazione sul loro ambiente. Queste forze di trazione sono generate dal citoscheletro contrattile di una cellula, che è una rete di actina e miosina, e altri biopolimeri filamentosi e proteine reticolanti 1,2,3,4. Le forze generate all'interno della cellula possono essere trasmesse all'ambiente extracellulare o alle cellule adiacenti, principalmente attraverso proteine transmembrana come integrine e caderine, rispettivamente 5,6. Il modo in cui una cellula si diffonde o si contrae - e le grandezze delle forze di trazione associate a quei movimenti - è il risultato di una conversazione intima con il suo ambiente, che dipende in gran parte dal tipo e dalla quantità di proteina presente nella matrice extracellulare (ECM)7,8 e dalla rigidità dell'ECM. In effetti, la microscopia con forza di trazione è diventata uno strumento inestimabile per comprendere la reattività cellulare a stimoli locali come la rigidità del substrato, le sollecitazioni e le tensioni meccaniche imposte o il contatto con altre cellule. Queste informazioni sono direttamente rilevanti per la comprensione di malattie come il cancro e l'asma 9,10,11,12.
Per calcolare le forze di trazione è necessario un sistema che può essere utilizzato per misurare la deformazione indotta dalla forza di un substrato con proprietà note del materiale. Questi cambiamenti devono essere monitorati nel tempo, richiedendo tecniche di imaging e di elaborazione delle immagini. Uno dei primi metodi utilizzati per determinare le forze di trazione cellulare è stata l'osservazione e l'analisi della contrazione di idrogel di collagene seminati con cellule, sebbene questo metodo fosse solo semiquantitativo13. Un altro metodo più raffinato è stato quello di misurare le forze di trazione esercitate dalle singole celle determinando le forze risultanti dalla deformazione di un sottile foglio di silicone14. Successivamente, sono state sviluppate tecniche di misurazione più quantitative e questi metodi hanno anche permesso l'uso di idrogel morbidi come la poliacrilammide (PAA)12,15,16. Quando si utilizzano questi materiali morbidi, le forze di trazione potrebbero essere determinate dallo spostamento indotto dalla forza di perline spostate casualmente incorporate nell'idrogel e dalle proprietà meccaniche del gel16,17. Un altro progresso è arrivato con lo sviluppo di array di micropost fatti di polidimetilsilossano morbido (PDMS) in modo che la loro deflessione potesse essere misurata e convertita in forza usando la teoria del fascio18.
Infine, sono stati sviluppati metodi per la micropatterazione di idrogel morbidi in quanto questi approcci consentono il controllo delle aree di contatto per l'adesione cellulare. Misurando la deformazione del micropattern all'interno dell'area di contatto di una cella, le forze di trazione potrebbero essere facilmente calcolate perché non è richiesta un'immagine di riferimento priva di forza19. Questo metodo è stato ampiamente adottato in quanto consente il pattern indiretto di una serie regolare di punti di adesione di proteine fluorescenti discrete di dimensioni micron su gel PAA per la misurazione delle forze di trazione cellulare20. Per calcolare queste forze, è stato sviluppato un algoritmo di elaborazione delle immagini, in grado di tracciare i movimenti di ciascun punto micropatterato senza richiedere l'input dell'utente21.
Mentre questo metodo è semplice per creare intere griglie di modelli di punti, è più complicato quando si desiderano modelli di patch isolate (o isole) di punti. Le isole micropatternate sono utili quando è necessario il controllo della forma, e in una certa misura delle dimensioni, dei gruppi di cellule. Per creare queste isole, il suddetto metodo di stampa a microcontatto richiede due passaggi distinti: i) utilizzando un timbro PDMS per creare un modello ad alta fedeltà di punti su una copertina, e quindi ii) utilizzando un secondo timbro PDMS diverso per rimuovere la maggior parte di quei punti, lasciando dietro di sé isole isolate di punti21. La difficoltà nel creare isole con questo metodo originale è aggravata dal fatto che creare modelli di griglia coerenti nella prima fase del processo è impegnativo da solo. I timbri di microstampa sono composti da una serie di micropost circolari, il cui diametro corrisponde alla dimensione del punto desiderata. Questi timbri vengono quindi rivestiti con uno strato uniforme di proteine e quindi stampati con una precisa quantità di pressione sulle coperture trattate per creare il modello desiderato. Da un lato, l'applicazione di troppa pressione sul timbro può comportare un trasferimento irregolare delle proteine e una scarsa fedeltà del modello a causa della deformazione del pilastro o del cedimento tra i pilastri, che porta al contatto con il vetro. D'altra parte, l'applicazione di una pressione troppo bassa si traduce in un trasferimento di proteine scarso o nullo e in una scarsa fedeltà del modello. Per questi motivi, è necessario un processo di trasferimento che possa essere utilizzato per creare costantemente micropattern di alta qualità di isole isolate di punti in un solo passaggio.
Qui, viene descritto un metodo per la micropatterning indiretta di isole di punti di adesione di proteine fluorescenti di dimensioni micron su un gel PAA che è più coerente e versatile rispetto ai metodi precedentemente sviluppati. Mentre i vecchi metodi di micropatterning indiretto si basano sul trasferimento di modelli proteici da un timbro PDMS a un substrato intermedio, il metodo introdotto qui utilizza i timbri PDMS invece come un vaso per la rimozione delle proteine, non l'aggiunta. Questo viene fatto cambiando prima radicalmente la struttura dei timbri PDMS utilizzati. Piuttosto che creare francobolli composti da un modello di pilastri circolari uniformemente distanziati, i francobolli sono costituiti da un modello di fori circolari uniformemente distanziati in questo metodo.
Con questa nuova struttura, la superficie di questi timbri PDMS può quindi essere trattata con glutaraldeide come descritto in precedenza20,29,30, rendendo il timbro in grado di legarsi covalentemente con le proteine. Se utilizzati su un coperchio di vetro uniformemente rivestito con proteine fluorescenti, questi timbri PDMS trattati con glutaraldeide vengono utilizzati per rimuovere la maggior parte delle proteine sulla superficie del coperchio, lasciando dietro di sé solo il modello desiderato di punti predeterminati dalla posizione di fori di dimensioni micron sul timbro. Questo cambiamento aumenta il tasso di successo per la generazione di modelli costituiti da una griglia quasi continua di punti e per la creazione di isole isolate di punti attraverso un solo passaggio.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-aminopropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#281778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask</td>
			<td>Advance Reproductions Corporation</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-designed mask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#A18P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide Solution, 40%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#A4058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#A20000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminonium Persulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#BP179-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#PR-V3141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Greenfield Global</td>
			<td>#111000200C1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslips, 25 mm round</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>#12-545-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslips, 30 mm round</td>
			<td>Warner</td>
			<td>#64-1499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu ORCA-R2 Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>#C10600-10B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>#HP1051P</td>
			<td>Used to isolate fibronectin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid, 1.0 N</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>#1.09057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Wayne Rasband</td>
			<td>#1.53n</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interchangeable Coverslip Dish Set</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>#190310-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim Wipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#06-666-11C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask Alinger</td>
			<td>Karl Suss</td>
			<td>#MA6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab 2021</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>#R2021a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph Basic</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>#v7.7.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide ester</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#130672-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live Cell Stain</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#52-1308-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist Spinner Hood</td>
			<td>Headway Research</td>
			<td>#PWM32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick</td>
			<td>#PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Etcher</td>
			<td>TePla</td>
			<td>#M4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior Lumen 200Pro Light Source</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>#L200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafers, 100 mm</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>#809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2005</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials Inc.</td>
			<td>#NC9463827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials Inc.</td>
			<td>#NC9901158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer</td>
			<td>Essex Brownell</td>
			<td>#DC-184-1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#BP150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#448931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAPON-40XW340 Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#N2709300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Flood Exposure</td>
			<td>Newport</td>
			<td>#69910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>#19395-40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pattern generation for micropattern traction microscopy

La microscopia a trazione micropattern consente il controllo della forma di singole cellule e cluster cellulari. Inoltre, la capacità di modellare la scala di lunghezza micrometrica consente l'uso di queste zone di contatto modellate per la misurazione delle forze di trazione, poiché ogni punto micropatternato consente la formazione di una singola adesione focale che quindi deforma l'idrogel morbido sottostante. Questo approccio è stato utilizzato per una vasta gamma di tipi di cellule, tra cui cellule endoteliali, cellule muscolari lisce, fibroblasti, piastrine e cellule epiteliali. 
Questa recensione descrive l'evoluzione delle tecniche che consentono la stampa di proteine della matrice extracellulare su idrogel di poliacrilammide in una serie regolare di punti di dimensioni e spaziatura prespecificate. Poiché i modelli su scala micrometrica sono difficili da stampare direttamente su substrati morbidi, i modelli vengono prima generati su coperture di vetro rigido che vengono quindi utilizzate per trasferire il modello all'idrogel durante la gelificazione. Innanzitutto, viene descritto l'approccio originale di stampa a microcontatto per generare matrici di piccoli punti sul coperchio. Un secondo passaggio che rimuove la maggior parte del modello per lasciare isole di piccoli punti è necessario per controllare le forme di celle e cluster di celle su tali matrici di punti modellati. 
Successivamente, viene descritta un'evoluzione di questo approccio che consente la generazione di isole di punti utilizzando un singolo passaggio di pattern sottrattivo. Questo approccio è notevolmente semplificato per l'utente, ma ha lo svantaggio di una durata ridotta per lo stampo principale necessario per realizzare i modelli. Infine, vengono descritti gli approcci computazionali che sono stati sviluppati per l'analisi delle immagini dei punti spostati e dei successivi campi di trazione generati dalle cellule e vengono fornite versioni aggiornate di questi pacchetti di analisi.

Gli idrogel PAA con il modulo di Young di E = 3,6 kPa e il rapporto di Poisson di ν = 0,445 sono stati fatti per l'uso con questo metodo di micropatterning sottrattivo. Gli idrogel sono stati realizzati per avere uno spessore di ~ 100 μm, il che consente loro di essere ripresi con la configurazione di imaging utilizzata qui, impedendo allo stesso tempo alle cellule di rilevare il coverslip rigido sotto il gel, il che causerebbe problemi negli studi incentrati sul rilevamento della rigidità cellulare<...

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Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

Descriviamo i miglioramenti a un metodo standard per misurare le forze di trazione cellulare, basato sulla stampa di microcontatti con una singola fase di pattern sottrattiva di array di punti di proteine della matrice extracellulare su idrogel morbidi. Questo metodo consente una fabbricazione più semplice e coerente dei modelli a isola, essenziale per controllare la forma del cluster cellulare.

Generazione di modelli per microscopia a trazione micropattern

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer ...

Questo protocollo consente la creazione coerente di micro modelli proteici ad alta fedeltà di qualsiasi forma si desideri, in particolare isole isolate di pattern per lo studio dei cluster cellulari. Questa tecnica può essere utilizzata per creare micro modelli di isole isolate di qualsiasi forma e dimensione in un solo passaggio, mentre in precedenza la realizzazione di tali modelli richiedeva due passaggi separati. Iniziare mescolando PDMS nel corretto rapporto agente polimerizzante/base come descritto nelle istruzioni del produttore.Incubare a temperatura ambiente e pressione per 15 minuti, quindi degasare la miscela sotto vuoto per 15 minuti. Versare il PDMS nello stampo principale e trasferirlo in un'incubatrice impostata a 37 gradi Celsius per polimerizzare durante la notte. Rimuovere lo stampo master dall'incubatore e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente.Mentre lo stampo master si sta raffreddando, sonicare 25 millimetri coverslips in etanolo per 10 minuti. Usa tante copertine quante sono le etichette che vengono preparate. Risciacquare accuratamente i coverslips con acqua DI e asciugarli utilizzando una pistola ad aria compressa filtrata.Trattare i coverslip con plasma per un minuto usando il detergente al plasma sotto un alto vuoto. Rilasciare lentamente il vuoto dopo il trattamento per evitare che i coverslip si muovano all'interno della camera. Rivestire ogni coverslip con 100 microlitri della soluzione proteica marcata fluorescente in una stanza priva di luce solare diretta o illuminazione dall'alto.Coprire i campioni per una maggiore protezione dalla luce e incubarli per 20 minuti a temperatura ambiente. Risciacquare accuratamente ogni coverslip con acqua DI. Rimuovere l'acqua in eccesso dalla superficie picchiettando delicatamente i lati di ciascun coperchio su un tovagliolo di carta o un materiale assorbente simile.Lasciare asciugare completamente le coperture lasciandole scoperte al buio per almeno 30 minuti. Mentre le coperture rivestite di proteine si asciugano, rimuovere il timbro PDMS dallo stampo principale tagliandolo con un bisturi o una lama affilata. Trattare i timbri PDMS con plasma per due minuti sotto un alto vuoto.Posizionare i timbri in un contenitore con un coperchio sotto la cappa aspirante, quindi rivestire ogni timbro con uno strato sottile di 10%3-APTMS diluito in etanolo al 100%. Coprire il contenitore con i timbri e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Risciacquare accuratamente ogni timbro su entrambi i lati con acqua DI.Mettere i timbri in un contenitore pulito e rivestirli con glutaraldeide al 2,5% preparata in acqua DI. Coprire i francobolli e incubarli a temperatura ambiente per 30 minuti. Risciacquare accuratamente i timbri con acqua DI.Rimuovere l'acqua in eccesso dalla superficie come descritto in precedenza e lasciare asciugare i timbri scoperti per 30 minuti. Se dopo 30 minuti le coperture rivestite di proteine o i timbri non sono completamente asciutti, utilizzare una pistola ad aria compressa filtrata per asciugarli completamente. Spingere il lato del modello dei timbri sui coperchi con una pressione sufficiente per consentire loro di entrare in contatto completo.Lasciare indisturbato per 15 minuti. Quindi staccare con cura i timbri PDMS dalle copertine. Utilizzando un microscopio fluorescente con l'apposito filtro, verificare la fedeltà delle coverslip modellate.Utilizzare immediatamente le coperture modellate o conservarle al riparo dalla luce diretta fino a un ulteriore utilizzo. Prima di preparare il precursore dell'idrogel PAA, rimuovere l'estere di acido acrilico NHS dal frigorifero per raggiungere la temperatura ambiente prima di essere aperto. Preparare un set di piatti intercambiabili sterilizzandolo con etanolo al 70%, quindi incubarlo sotto luce UV in un armadio di biosicurezza per almeno 30 minuti prima dell'uso.Sotto la cappa aspirante, aggiungere 1,25 millilitri di acrilammide al 40% preparato in acqua DI a un tubo conico da 15 millilitri. Allo stesso tubo, aggiungere 175 microlitri di soluzione di bis-acrilammide preparata in acqua DI. Quindi aggiungere 500 microlitri di 10X PBS, seguiti da 2.915 millilitri di acqua DI.Pipettare 969 microlitri di questo precursore in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri e conservare il resto a quattro gradi Celsius per un massimo di due settimane. Misurare da 50 a 100 milligrammi di APS in un tubo di microcentrifuga fresca e diluirlo a 100 milligrammi per millilitro in acqua DI. Aprire l'estere NHS nel cofano e misurare attentamente fino a tre milligrammi di NHS in un tubo di microcentrifuga.Diluire l'estere NHS a un milligrammo per millilitro in 1X PBS. Sotto la cappa aspirante, aggiungere due microlitri di TEMED al tubo microcentrifuga contenente l'aliquota di microlitri 969 del precursore PAA. Aggiungere 15 microlitri di un HCL molare per ridurre il pH della soluzione di idrogel ed evitare l'idrolisi dell'estere NHS.Aggiungere 10 microlitri della soluzione estere NHS al tubo. Eseguire i seguenti passaggi in un armadio di biosicurezza. Posizionare con attenzione il coverslip da 30 millimetri all'interno della parte centrale del set di piatti coverslip con il lato trattato con 3-APTMS e glutaraldeide e avvitare l'anello di plastica sulla parte superiore.Imposta il coverslip modellato con un'esposizione minima alla luce per prepararti al passaggio successivo. Pipettare cinque microlitri della soluzione di APS nel tubo aliquota precursore PAA, quindi invertire e miscelare. Pipettare immediatamente 35 microlitri di questa soluzione sul coperchio da 30 millimetri.Posizionare il coverslip modellato sulla soluzione con il lato proteico verso il basso. Fare attenzione a non creare bolle d'aria nell'idrogel. Proteggere l'idrogel dalla luce e lasciarlo polimerizzare per 90 minuti.Una volta che l'idrogel si è polimerizzato, utilizzare una lama di rasoio o un bisturi per rimuovere il coverslip superiore, assicurarsi che il coverslip non ricada o scivoli via dal gel una volta rimosso per evitare di rovinare il modello sulla superficie del gel. Per passivare qualsiasi estere NHS rimanente nell'idrogel, aggiungere due millilitri di PBS sterile al gel e incubare a 37 gradi Celsius per 45 minuti. Preparare immediatamente i gel per gli esperimenti o conservarli durante la notte in PBS sterile a quattro gradi Celsius fino a nuovo utilizzo.Gli idrogel sono stati indirettamente modellati con fibronectina fluorescente per visualizzare e misurare le forze di trazione cellulare all'interno di cluster e creare modelli di isole di dimensioni e forma predeterminate. La qualità del modello era direttamente correlata alla fedeltà dello stampo master da cui è stato fuso il timbro PDMS. Questo metodo potrebbe fabbricare modelli di isole isolate e ben definite di forma predeterminata.I punti di adesione della fibronectina erano presenti solo all'interno dell'area desiderata dell'isola. Queste isole isolate di punti di adesione hanno ulteriormente permesso un migliore controllo della forma del cluster. Rivestire i timbri PDMS con due piccoli 3-APTMS è fondamentale perché limiterà l'efficacia del metodo di rimozione, mentre troppo creerà un residuo arancione sulla superficie del timbro.I modelli creati qui possono essere utilizzati per determinare le forze di trazione cellulare sia nelle singole cellule che nei cluster, il che fornisce informazioni sulla loro capacità di mantenere l'omeostasi meccanica.

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