Name: pattern generation for micropattern traction microscopy
Uploaded: 2022-02-17T14:00:00
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Los autores desean agradecer al Dr. Paul Barbone del Departamento de Ingeniería Mecánica de la Universidad de Boston por las útiles discusiones y la asistencia con el análisis de datos. Este estudio fue apoyado por la subvención CMMI-1910401 de la NSF.

1. Creación de maestros de silicona
NOTA: La mayor parte del proceso de diseño, creación y solución de problemas de maestros de silicio para el moldeo repetido de sellos PDMS se ha cubierto anteriormente21, por lo que solo se describirán aquí las diferencias clave en este nuevo enfoque.
<ol><li>Cree el diseño de la fotomáscara utilizando AutoCAD o un software de diseño similar. Cubra un lado de la fotomáscara, una pieza delgada de vidrio, co...

En este documento se describe un método mejorado de modelado indirecto de hidrogeles PAA. Este enfoque se basa en métodos que se han utilizado anteriormente 20,35,36,37,38,39,40,41,42. El cambio principal es que los sell...

La mayoría de los fenotipos celulares ejercen fuerzas de tracción sobre su entorno. Estas fuerzas de tracción son generadas por el citoesqueleto contráctil de una célula, que es una red de actina y miosina, y otros biopolímeros filamentosos y proteínasde reticulación 1,2,3,4. Las fuerzas generadas dentro de la célula pueden transmitirse al entorno extracelular o a las células adyacentes, principalmente a través de proteínas transmembrana como las integrinas y las cadherinas, respectivamente 5,6. La forma en que una célula se propaga o contrae,y las magnitudes de las fuerzas de tracción asociadas a esos movimientos-- es el resultado de una conversación íntima con su entorno, que depende en gran medida del tipo y cantidad de proteína presente en la matriz extracelular (ECM)7,8 y de la rigidez de la ECM. De hecho, la microscopía de fuerza de tracción se ha convertido en una herramienta invaluable para comprender la capacidad de respuesta de las células a estímulos locales como la rigidez del sustrato, las tensiones y tensiones mecánicas impuestas o el contacto con otras células. Esta información es directamente relevante para la comprensión de enfermedades como el cáncer yel asma 9,10,11,12.
Se requiere un sistema que se pueda utilizar para medir la deformación inducida por la fuerza de un sustrato de propiedades de material conocidas para calcular las fuerzas de tracción. Estos cambios deben rastrearse a lo largo del tiempo, lo que requiere técnicas de procesamiento de imágenes e imágenes. Uno de los primeros métodos utilizados para determinar las fuerzas de tracción celular fue la observación y análisis de la contracción de hidrogeles de colágeno sembrados con células, aunque este método fue solo semicuantitativo13. Otro método más refinado fue medir las fuerzas de tracción ejercidas por células individuales determinando las fuerzas resultantes de la deformación de una lámina delgada de silicona14. Posteriormente, se desarrollaron técnicas de medición más cuantitativas, y estos métodos también permitieron el uso de hidrogeles blandos como la poliacrilamida (PAA)12,15,16. Cuando se utilizan estos materiales blandos, las fuerzas de tracción podrían determinarse a partir del desplazamiento inducido por la fuerza de perlas desplazadas aleatoriamente incrustadas en el hidrogel y las propiedades mecánicas del gel16,17. Otro avance vino con el desarrollo de matrices de micropostes hechas de polidimetilsiloxano blando (PDMS) para que su deflexión pudiera medirse y convertirse en fuerza utilizando la teoría del haz18.
Finalmente, se desarrollaron métodos para micromodelar hidrogeles blandos, ya que estos enfoques permiten el control de las áreas de contacto para la adhesión celular. Al medir la deformación del micromodelo dentro del área de contacto de una célula, las fuerzas de tracción podrían calcularse fácilmente porque no se requiere una imagen de referencia libre de fuerza19. Este método ha sido ampliamente adoptado, ya que permite el modelado indirecto de una matriz regular de puntos de adhesión de proteínas fluorescentes discretas del tamaño de micras en geles PAA para la medición de fuerzas de tracción celular20. Para calcular estas fuerzas, se ha desarrollado un algoritmo de procesamiento de imágenes, que puede rastrear los movimientos de cada punto micropatronado sin requerir la entrada del usuario21.
Si bien este método es simple para crear cuadrículas completas de patrones de puntos, es más complicado cuando se desean patrones de parches aislados (o islas) de puntos. Las islas micropatronadas son útiles cuando se necesita el control de la forma, y en cierta medida del tamaño, de los grupos de células. Para crear estas islas, el método mencionado de impresión de microcontactos requiere dos pasos distintos: i) usar un sello PDMS para crear un patrón de puntos de alta fidelidad en un coverslip, y luego ii) usar un segundo sello PDMS diferente para eliminar la mayoría de esos puntos, dejando atrás islas aisladas de puntos21. La dificultad de crear islas con este método original se ve agravada por el hecho de que hacer patrones de cuadrícula consistentes en el primer paso del proceso es un desafío por sí solo. Los sellos de microimpresión se componen de una matriz de micropostos circulares, cuyo diámetro corresponde al tamaño de punto deseado. Estos sellos se recubren con una capa uniforme de proteína y luego se estampan con una cantidad precisa de presión sobre las cubiertas tratadas para crear el patrón deseado. Por un lado, aplicar demasiada presión al sello puede resultar en una transferencia desigual de proteínas y una fidelidad de patrón deficiente debido al pandeo o flacidez del pilar entre los pilares, lo que lleva al contacto con el vidrio. Por otro lado, aplicar muy poca presión resulta en poca o ninguna transferencia de proteínas y una fidelidad de patrón deficiente. Por estas razones, se desea un proceso de transferencia que se pueda utilizar para crear constantemente micropatrones de alta calidad de islas aisladas de puntos en un solo paso.
Aquí, se describe un método para el micropatronaje indirecto de islas de puntos de adhesión de proteínas fluorescentes del tamaño de micras en un gel PAA que es más consistente y versátil que los métodos desarrollados anteriormente. Mientras que los métodos de micropatronaje indirecto más antiguos se basan en la transferencia de patrones de proteínas de un sello PDMS a un sustrato intermedio, el método introducido aquí utiliza sellos PDMS en su lugar como un recipiente para la eliminación de proteínas, no para la adición. Esto se hace cambiando primero fundamentalmente la estructura de los sellos PDMS utilizados. En lugar de hacer sellos que se componen de un patrón de pilares circulares espaciados uniformemente, los sellos se componen de un patrón de agujeros circulares espaciados uniformemente en este método.
Con esta nueva estructura, la superficie de estos sellos PDMS se puede tratar con glutaraldehído como se describió anteriormente20,29,30, haciendo que el sello pueda unirse covalentemente con la proteína. Cuando se usan en una funda de vidrio recubierta uniformemente con proteína fluorescente, estos sellos PDMS tratados con glutaraldehído se utilizan para eliminar la mayor parte de la proteína en la superficie de la hoja de cubierta, dejando atrás solo el patrón deseado de puntos predeterminado por la ubicación de agujeros del tamaño de micras en el sello. Este cambio aumenta la tasa de éxito para generar patrones formados por una cuadrícula casi continua de puntos y para crear islas aisladas de puntos a través de un solo paso.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-aminopropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#281778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask</td>
			<td>Advance Reproductions Corporation</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-designed mask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#A18P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide Solution, 40%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#A4058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#A20000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminonium Persulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#BP179-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#PR-V3141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Greenfield Global</td>
			<td>#111000200C1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslips, 25 mm round</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>#12-545-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslips, 30 mm round</td>
			<td>Warner</td>
			<td>#64-1499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu ORCA-R2 Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>#C10600-10B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>#HP1051P</td>
			<td>Used to isolate fibronectin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid, 1.0 N</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>#1.09057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Wayne Rasband</td>
			<td>#1.53n</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interchangeable Coverslip Dish Set</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>#190310-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim Wipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#06-666-11C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask Alinger</td>
			<td>Karl Suss</td>
			<td>#MA6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab 2021</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>#R2021a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph Basic</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>#v7.7.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide ester</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#130672-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live Cell Stain</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#52-1308-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist Spinner Hood</td>
			<td>Headway Research</td>
			<td>#PWM32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick</td>
			<td>#PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Etcher</td>
			<td>TePla</td>
			<td>#M4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior Lumen 200Pro Light Source</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>#L200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafers, 100 mm</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>#809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2005</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials Inc.</td>
			<td>#NC9463827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials Inc.</td>
			<td>#NC9901158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer</td>
			<td>Essex Brownell</td>
			<td>#DC-184-1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#BP150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#448931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAPON-40XW340 Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#N2709300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Flood Exposure</td>
			<td>Newport</td>
			<td>#69910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>#19395-40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pattern generation for micropattern traction microscopy

La microscopía de tracción por micropatrones permite controlar la forma de células individuales y grupos celulares. Además, la capacidad de modelar a escala de longitud micrométrica permite el uso de estas zonas de contacto modeladas para la medición de las fuerzas de tracción, ya que cada punto micromodelado permite la formación de una sola adhesión focal que luego deforma el hidrogel blando subyacente. Este enfoque se ha utilizado para una amplia gama de tipos de células, incluidas las células endoteliales, las células del músculo liso, los fibroblastos, las plaquetas y las células epiteliales. 
Esta revisión describe la evolución de las técnicas que permiten la impresión de proteínas de la matriz extracelular en hidrogeles de poliacrilamida en una matriz regular de puntos de tamaño y espaciado preespecificados. Como los patrones de escala micrométrica son difíciles de imprimir directamente sobre sustratos blandos, los patrones se generan primero en cubiertas de vidrio rígido que luego se utilizan para transferir el patrón al hidrogel durante la gelificación. En primer lugar, se describe el enfoque original de impresión de microcontactos para generar matrices de pequeños puntos en el claváculo. Se requiere un segundo paso que elimina la mayor parte del patrón para dejar islas de puntos pequeños para controlar las formas de las células y los grupos de células en tales matrices de puntos modelados. 
A continuación, se describe una evolución de este enfoque que permite la generación de islas de puntos utilizando un solo paso de patrón sustractivo. Este enfoque se simplifica en gran medida para el usuario, pero tiene la desventaja de una vida útil disminuida para el molde maestro necesario para hacer los patrones. Finalmente, se describen los enfoques computacionales que se han desarrollado para el análisis de imágenes de puntos desplazados y campos de tracción generados por células posteriores, y se proporcionan versiones actualizadas de estos paquetes de análisis.

Los hidrogeles PAA con el módulo de Young de E = 3,6 kPa y la relación de Poisson de ν = 0,445 se hicieron para su uso mediante este método de micropatronaje sustractivo. Los hidrogeles se hicieron para tener ~ 100 μm de espesor, lo que les permite ser fotografiados con la configuración de imágenes utilizada aquí, al tiempo que evita que las células detecten el capa rígida debajo del gel, lo que causaría problemas en los estudios centrados en la detección de rigidez celular...

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Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

Describimos mejoras en un método estándar para medir las fuerzas de tracción celular, basado en la impresión de microcontacto con un solo paso de patrón sustractivo de matrices de puntos de proteínas de matriz extracelular en hidrogeles blandos. Este método permite una fabricación más simple y consistente de patrones de islas, esencial para controlar la forma del grupo celular.

Generación de patrones para microscopía de tracción de micropatrones

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer ...

Este protocolo permite la creación consistente de micro patrones de proteínas de alta fidelidad de cualquier forma que se desee, especialmente islas aisladas de patrones para el estudio de grupos celulares. Esta técnica se puede utilizar para hacer micro patrones aislados de islas de cualquier forma y tamaño en un solo paso, mientras que anteriormente hacer tales patrones requería dos pasos separados. Comience mezclando PDMS en la relación correcta de agente de curado a base como se describe en las instrucciones del fabricante.Incubar a temperatura ambiente y presión durante 15 minutos, luego desgasificar la mezcla al vacío durante 15 minutos. Vierta el PDMS en el molde maestro y transfiéralo a una incubadora a 37 grados Centígrados para curar durante la noche. Retire el molde maestro de la incubadora y deje que se enfríe a temperatura ambiente.Mientras el molde maestro se está enfriando, sonice las cubiertas de 25 milímetros en etanol durante 10 minutos. Utilice tantas fundas como el número de sellos que se estén preparando. Enjuague bien las fundas con agua DI y séquelas con una pistola de aire filtrado.Trate las fundas con plasma durante un minuto utilizando el limpiador de plasma bajo un alto vacío. Suelte lentamente el vacío después del tratamiento para evitar que las cubiertas se muevan dentro de la cámara. Cubra cada funda con 100 microlitros de la solución de proteína marcada con fluorescentes en una habitación desprovista de luz solar directa o iluminación cenital.Cubra las muestras para una protección adicional contra la luz e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente. Enjuague bien cada funda con agua DI. Elimine el exceso de agua de la superficie golpeando suavemente los lados de cada funda sobre una toalla de papel o un material absorbente similar.Deje que las fundas se sequen completamente dejándolas descubiertas en la oscuridad durante al menos 30 minutos. Mientras las fundas recubiertas de proteína se secan, retire el sello PDMS del molde maestro cortándolo con un bisturí o cualquier cuchilla afilada. Trate los sellos PDMS con plasma durante dos minutos bajo un alto vacío.Coloque los sellos en un recipiente con una tapa debajo de la campana de humos, luego cubra cada sello con una capa delgada de 10% 3-APTMS diluido en 100% etanol. Cubra el recipiente con los sellos e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. Enjuague bien cada sello en ambos lados con agua DI.Coloque los sellos en un recipiente limpio y cúbralos con glutaraldehído al 2,5% preparado en agua DI. Cubra los sellos e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Enjuague bien los sellos con agua DI.Retire el exceso de agua de la superficie como se describió anteriormente y deje que los sellos se sequen sin tapa durante 30 minutos. Si después de 30 minutos las fundas recubiertas de proteínas o los sellos no están completamente secos, use una pistola de aire filtrado para secarlos por completo. Empuje el lado del patrón de los sellos sobre las cubiertas con suficiente presión para que hagan contacto completo.Déjelo sin molestar durante 15 minutos. A continuación, despegue cuidadosamente los sellos PDMS de las fundas. Usando un microscopio fluorescente con el filtro apropiado, verifique la fidelidad de las cubiertas estampadas.Use los cubrehojas estampados inmediatamente o guárdelos lejos de la luz directa hasta su uso posterior. Antes de preparar el precursor de hidrogel PAA, retire el éster de ácido acrílico NHS del refrigerador para alcanzar la temperatura ambiente antes de abrirlo. Prepare un juego de placas intercambiables esterilizando con etanol al 70%, luego incube bajo luz UV en un gabinete de bioseguridad durante al menos 30 minutos antes de su uso.Debajo de la campana de humos, agregue 1.25 mililitros de acrilamida al 40% preparada en agua DI a un tubo cónico de 15 mililitros. Al mismo tubo, agregue 175 microlitros de solución de bis-acrilamida preparada en agua DI. Luego agregue 500 microlitros de 10X PBS, seguido de 2.915 mililitros de agua DI.Pipetee 969 microlitros de este precursor en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y almacene el resto a cuatro grados centígrados durante un máximo de dos semanas. Mida de 50 a 100 miligramos de APS en un tubo de microcentrífuga fresco y diluya a 100 miligramos por mililitro en agua DI. Abra el éster NHS en la campana y mida cuidadosamente hasta tres miligramos de NHS en un tubo de microcentrífuga.Diluya el éster NHS a un miligramo por mililitro en 1X PBS. Debajo de la campana de humos, agregue dos microlitros de TEMED al tubo de la microcentrífuga que contiene la alícuota de 969 microlitros del precursor de PAA. Agregue 15 microlitros de un HCL molar para disminuir el pH de la solución de hidrogel y evitar la hidrólisis del éster NHS.Agregue 10 microlitros de la solución de éster NHS al tubo. Realice los siguientes pasos en un gabinete de bioseguridad. Coloque cuidadosamente la cubierta de 30 milímetros dentro de la parte media del juego de platos de cubierta con el lado 3-APTMS y glutaraldehído tratado hacia arriba y atornille el anillo de plástico en la parte superior.Configure el cubrebocas estampado con una exposición mínima a la luz para prepararse para el siguiente paso. Pipetear cinco microlitros de solución APS en el tubo alícuota precursor de PAA, luego invertir y mezclar. Pipetee inmediatamente 35 microlitros de esta solución en la cubierta de 30 milímetros.Coloque el cubrehojas estampadas en la solución con el lado de la proteína hacia abajo. Tenga cuidado de no crear burbujas de aire en el hidrogel. Proteja el hidrogel de la luz y deje que polimerice durante 90 minutos.Una vez que el hidrogel se haya polimerizado, use una cuchilla de afeitar o un bisturí para quitar la funda superior, asegúrese de que la funda no se caiga hacia atrás o se deslice del gel una vez retirado para evitar arruinar el patrón en la superficie del gel. Para pasivar cualquier éster NHS restante en el hidrogel, agregue dos mililitros de PBS estéril al gel e incube a 37 grados Celsius durante 45 minutos. Prepare inmediatamente los geles para experimentos o guárdelos durante la noche en PBS estéril a cuatro grados centígrados hasta su uso posterior.Los hidrogeles fueron modelados indirectamente con fibronectina fluorescente para visualizar y medir las fuerzas de tracción celular dentro de los grupos y crear patrones de isla de tamaño y forma predeterminados. La calidad del patrón estaba directamente relacionada con la fidelidad del molde maestro a partir del cual se fundió el sello PDMS. Este método podría fabricar patrones de isla aislados y bien definidos de forma predeterminada.Los puntos de adhesión de fibronectina estaban presentes solo dentro del área deseada de la isla. Estas islas aisladas de puntos de adhesión permitieron además un mejor control de la forma del racimo. El recubrimiento de sellos PDMS con dos pequeños 3-APTMS es crítico porque limitará la efectividad del método de eliminación, mientras que demasiado creará un residuo naranja en la superficie del sello.Los patrones creados aquí se pueden usar para determinar las fuerzas de tracción celular tanto en células individuales como en grupos, lo que da una idea de su capacidad para mantener la homeostasis mecánica.

Research

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