Name: pattern generation for micropattern traction microscopy
Uploaded: 2022-02-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy at JoVE.com

Yazarlar, Boston Üniversitesi Makine Mühendisliği Bölümü'nden Dr. Paul Barbone'a yararlı tartışmalar ve veri analizi konusundaki yardımları için teşekkür eder. Bu çalışma NSF hibesi CMMI-1910401 ile desteklenmiştir.

1. Silikon ustalarının oluşturulması
NOT: PDMS pullarının tekrar tekrar kalıplanması için silikon kalıpların tasarımı, oluşturulması ve sorun giderme sürecinin çoğu daha önce21 kez ele alınmıştır, bu nedenle bu yeni yaklaşımdaki yalnızca önemli farklılıklar burada açıklanacaktır.
<ol><li>AutoCAD veya benzeri bir tasarım yazılımı kullanarak fotoğraf maskesi tasarımını oluşturun. UV ışık saçılımını kontro...

Bu yazıda PAA hidrojellerinin dolaylı olarak modellenmesi için geliştirilmiş bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, daha önce 20,35,36,37,38,39,40,41,42 numaralı yönteme dayanmaktadır. Birincil değişikli...

Çoğu hücre fenotipi, çevrelerine çekiş kuvvetleri uygular. Bu çekiş kuvvetleri, bir aktin ve miyozin ağı olan bir hücrenin kontraktil sitoiskeleti ve diğer filamentli biyopolimerler ve çapraz bağlanan proteinler 1,2,3,4 tarafından üretilir. Hücre içinde üretilen kuvvetler, hücre dışı ortama veya bitişik hücrelere, öncelikle integrinler ve kadherinler gibi transmembran proteinleri aracılığıyla, sırasıyla 5,6 yoluyla iletilebilir. Bir hücrenin nasıl yayıldığı veya büzüldüğü - ve bu hareketlerle ilişkili çekiş kuvvetlerinin büyüklükleri - büyük ölçüde hücre dışı matriste (ECM) 7,8 bulunan proteinin türüne ve miktarına ve ECM'nin sertliğine bağlı olan çevresi ile samimi bir konuşmanın sonucudur. Gerçekten de, çekiş kuvveti mikroskobu, substrat sertliği, uygulanan mekanik gerilmeler ve suşlar veya diğer hücrelerle temas gibi yerel uyaranlara hücre tepkisini anlamak için paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Bu bilgiler kanser ve astım gibi hastalıkların anlaşılması ile doğrudan ilgilidir 9,10,11,12.
Çekiş kuvvetlerini hesaplamak için bilinen malzeme özelliklerine sahip bir substratın kuvvet kaynaklı deformasyonunu ölçmek için kullanılabilecek bir sistem gereklidir. Bu değişiklikler zaman içinde izlenmeli ve hem görüntüleme hem de görüntü işleme teknikleri gerektirmelidir. Hücresel çekiş kuvvetlerini belirlemek için kullanılan ilk yöntemlerden biri, hücrelerle tohumlanan kollajen hidrojellerinin kasılmasının gözlemlenmesi ve analiziydi, ancak bu yöntem sadece yarı kantitatif13 idi. Bir başka, daha rafine yöntem, ince bir silikon levha14'ün deformasyonundan kaynaklanan kuvvetleri belirleyerek tek hücreler tarafından uygulanan çekiş kuvvetlerini ölçmekti. Daha sonra, daha nicel ölçüm teknikleri geliştirildi ve bu yöntemler poliakrilamid (PAA) 12,15,16 gibi yumuşak hidrojellerin kullanılmasına da izin verdi. Bu yumuşak malzemeler kullanılırken, çekiş kuvvetleri, hidrojele gömülü rastgele yer değiştirmiş boncukların kuvvet kaynaklı yer değiştirmesinden ve jel16,17'nin mekanik özelliklerinden belirlenebilir. Başka bir gelişme, yumuşak polidimetilsiloksandan (PDMS) yapılmış mikropost dizilerinin geliştirilmesiyle geldi, böylece sapmaları ışın teorisi18 kullanılarak ölçülebilir ve kuvvete dönüştürülebilirdi.
Son olarak, yumuşak hidrojellerin mikrodesenlenmesi için yöntemler geliştirilmiştir, çünkü bu yaklaşımlar hücre yapışması için temas alanlarının kontrolüne izin verir. Bir hücrenin temas alanındaki mikro modelin deformasyonunu ölçerek, çekiş kuvvetleri kolayca hesaplanabilir, çünkü kuvvetsiz bir referans görüntüsü gerekli değildir19. Bu yöntem, hücresel çekiş kuvvetlerinin ölçümü için PAA jelleri üzerine düzenli bir mikron boyutunda, ayrık floresan protein yapışma noktaları dizisinin dolaylı olarak modellenmesine izin verdiği için yaygın olarak benimsenmiştir20. Bu kuvvetleri hesaplamak için, kullanıcı girdisi gerektirmeden her bir mikro desenli noktanın hareketlerini izleyebilen bir görüntü işleme algoritması geliştirilmiştir21.
Bu yöntem, nokta desenlerinin tüm ızgaralarını oluşturmak için basit olsa da, izole edilmiş nokta yamalarının (veya adalarının) desenleri istendiğinde daha karmaşıktır. Mikro desenli adalar, hücre kümelerinin şeklinin ve bir dereceye kadar boyutunun kontrolüne ihtiyaç duyulduğunda kullanışlıdır. Bu adaları oluşturmak için, yukarıda bahsedilen mikrotemaslı baskı yöntemi iki ayrı adım gerektirir: i) bir kapak kapağı üzerinde yüksek doğrulukta bir nokta deseni oluşturmak için bir PDMS damgası kullanmak ve daha sonra ii) bu noktaların çoğunu kaldırmak için ikinci bir farklı PDMS damgası kullanmak, geride izole edilmiş noktaadaları 21. Bu orijinal yöntemle adalar yaratmanın zorluğu, sürecin ilk adımında tutarlı ızgara desenleri yapmanın kendi başına zor olduğu gerçeğiyle birleşmektedir. Mikro baskı pulları, çapı istenen nokta boyutuna karşılık gelen bir dizi dairesel mikro direkten oluşur. Bu pullar daha sonra eşit bir protein tabakası ile kaplanır ve daha sonra istenen deseni oluşturmak için işlenmiş kapak fişleri üzerine kesin bir basınç miktarıyla damgalanır. Bir yandan, damgaya çok fazla baskı uygulamak, sütunlar arasında sütun burkulması veya sarkması nedeniyle düzensiz protein transferine ve zayıf desen doğruluğuna neden olabilir ve bu da camla temasa neden olabilir. Öte yandan, çok az basınç uygulamak, çok az protein transferine veya hiç protein transferine ve zayıf desen doğruluğuna neden olur. Bu nedenlerden dolayı, sadece bir adımda izole edilmiş nokta adalarının yüksek kaliteli mikro desenlerini tutarlı bir şekilde oluşturmak için kullanılabilecek bir transfer işlemi istenmektedir.
Burada, mikron büyüklüğündeki floresan protein yapışma noktalarının adalarının, daha önce geliştirilen yöntemlerden daha tutarlı ve çok yönlü olan bir PAA jeli üzerine dolaylı olarak mikrodesenlenmesi için bir yöntem tanımlanmıştır. Eski dolaylı mikrodesenleme yöntemleri, protein kalıplarının bir PDMS damgasından bir ara substrata aktarılmasına dayanırken, burada tanıtılan yöntem, PDMS damgalarını protein giderimi için bir kap olarak kullanır, toplama değil. Bu, önce kullanılan PDMS damgalarının yapısını temelden değiştirerek yapılır. Eşit aralıklı dairesel sütunlardan oluşan bir desenden oluşan pullar yapmak yerine, pullar bu yöntemde eşit aralıklı dairesel deliklerden oluşan bir desenden oluşur.
Bu yeni yapı ile, bu PDMS damgalarının yüzeyi daha sonra daha önce tarif edildiği gibi glutaraldehit ile muamele edilebilir 20,29,30, böylece damga protein ile kovalent olarak bağlanabilir. Floresan proteini ile eşit şekilde kaplanmış bir cam kapak kapağında kullanıldığında, bu glutaraldehit ile muamele edilmiş PDMS damgaları, kapak kaymasının yüzeyindeki proteinin çoğunu çıkarmak için kullanılır ve geride sadece damga üzerindeki mikron büyüklüğündeki deliklerin yeri tarafından önceden belirlenmiş istenen nokta desenini bırakır. Bu değişiklik, neredeyse sürekli bir nokta ızgarasından oluşan desenler oluşturmak ve yalnızca bir adımla izole edilmiş nokta adaları oluşturmak için başarı oranını artırır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-aminopropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#281778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask</td>
			<td>Advance Reproductions Corporation</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-designed mask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#A18P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide Solution, 40%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#A4058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#A20000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminonium Persulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#BP179-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#PR-V3141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Greenfield Global</td>
			<td>#111000200C1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslips, 25 mm round</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>#12-545-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslips, 30 mm round</td>
			<td>Warner</td>
			<td>#64-1499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu ORCA-R2 Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>#C10600-10B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>#HP1051P</td>
			<td>Used to isolate fibronectin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid, 1.0 N</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>#1.09057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Wayne Rasband</td>
			<td>#1.53n</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interchangeable Coverslip Dish Set</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>#190310-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim Wipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#06-666-11C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask Alinger</td>
			<td>Karl Suss</td>
			<td>#MA6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab 2021</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>#R2021a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph Basic</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>#v7.7.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide ester</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#130672-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live Cell Stain</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#52-1308-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist Spinner Hood</td>
			<td>Headway Research</td>
			<td>#PWM32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick</td>
			<td>#PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Etcher</td>
			<td>TePla</td>
			<td>#M4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior Lumen 200Pro Light Source</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>#L200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafers, 100 mm</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>#809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2005</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials Inc.</td>
			<td>#NC9463827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials Inc.</td>
			<td>#NC9901158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer</td>
			<td>Essex Brownell</td>
			<td>#DC-184-1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#BP150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#448931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAPON-40XW340 Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#N2709300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Flood Exposure</td>
			<td>Newport</td>
			<td>#69910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>#19395-40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pattern generation for micropattern traction microscopy

Mikrodesen traksiyon mikroskobu, tek hücrelerin ve hücre kümelerinin şeklinin kontrol edilmesini sağlar. Ayrıca, mikrometre uzunluk ölçeğinde modelleme yeteneği, çekiş kuvvetlerinin ölçümü için bu desenli temas bölgelerinin kullanılmasına izin verir, çünkü her mikro desenli nokta, daha sonra yumuşak, altta yatan hidrojeli deforme eden tek bir odak yapışmasının oluşumuna izin verir. Bu yaklaşım, endotel hücreleri, düz kas hücreleri, fibroblastlar, trombositler ve epitel hücreleri dahil olmak üzere çok çeşitli hücre tipleri için kullanılmıştır. 
Bu derlemede, hücre dışı matriks proteinlerinin poliakrilamid hidrojeller üzerine önceden belirlenmiş büyüklük ve aralıktaki düzenli bir dizi nokta dizisinde basılmasına izin veren tekniklerin evrimi açıklanmaktadır. Mikrometre ölçekli desenlerin yumuşak yüzeylere doğrudan basılması zor olduğundan, desenler önce sert cam kapaklarda üretilir ve daha sonra jelasyon sırasında deseni hidrojele aktarmak için kullanılır. İlk olarak, kapak kapağı üzerinde küçük noktalardan oluşan diziler oluşturmak için orijinal mikrotemaslı baskı yaklaşımı açıklanmaktadır. Küçük noktalardan oluşan adalar bırakmak için desenin çoğunu kaldıran ikinci bir adım, bu tür desenli nokta dizileri üzerindeki hücrelerin ve hücre kümelerinin şekillerini denetlemek için gereklidir. 
Daha sonra, tek bir çıkarma modelleme adımı kullanarak nokta adalarının oluşturulmasına izin veren bu yaklaşımın bir evrimi açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, kullanıcı için büyük ölçüde basitleştirilmiştir, ancak desenleri yapmak için gereken ana kalıp için azalan bir kullanım ömrünün dezavantajına sahiptir. Son olarak, yer değiştirmiş noktaların ve ardından hücre tarafından oluşturulan çekiş alanlarının görüntülerinin analizi için geliştirilen hesaplama yaklaşımları açıklanmış ve bu analiz paketlerinin güncellenmiş versiyonları sunulmuştur.

Young modülü E = 3.6 kPa ve Poisson oranı ν = 0.445 olan PAA hidrojelleri bu çıkarma mikrodesenleme yöntemiyle kullanılmak üzere yapılmıştır. Hidrojeller ~ 100 μm kalınlığında yapıldı, bu da burada kullanılan görüntüleme kurulumuyla görüntülenmelerini sağlarken, hücrelerin jelin altındaki sert örtü kaymasını algılamasını önledi, bu da hücresel sertliği23,33 algılamaya odaklanan çalışmalarda sorunlara n...

Watch this Scientific Journal Video about Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy at JoVE.com

Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

Yumuşak hidrojeller üzerindeki hücre dışı matris proteinlerinin nokta dizilerinin tek bir çıkarma modelleme adımıyla mikrotemaslı baskıya dayanan hücresel çekiş kuvvetlerini ölçmek için standart bir yöntemdeki iyileştirmeleri açıklıyoruz. Bu yöntem, hücre kümesi şeklini kontrol etmek için gerekli olan ada desenlerinin daha basit ve daha tutarlı bir şekilde üretilmesini sağlar.

Mikrodesen Traksiyon Mikroskobu için Desen Oluşturma

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer ...

Bu protokol, istenen şekildeki yüksek doğruluklu protein mikro kalıplarının, özellikle hücre kümelerinin incelenmesi için izole edilmiş desen adalarının tutarlı bir şekilde oluşturulmasına izin verir. Bu teknik, herhangi bir şekil ve boyuttaki izole ada mikro desenlerini yalnızca bir adımda yapmak için kullanılabilirken, daha önce bu tür desenleri yapmak iki ayrı adım gerektiriyordu. PDMS'yi, üreticinin talimatlarında açıklandığı gibi doğru kürleme maddesi ile baz oranında karıştırarak başlayın.Oda sıcaklığında ve basınçta 15 dakika boyunca inkübe edin, ardından karışımı 15 dakika boyunca vakum altında gazdan arındırın. PDMS'yi ana kalıba dökün ve gece boyunca kürlenmek için 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir inkübatöre aktarın. Ana kalıbı inkübatörden çıkarın ve oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.Ana kalıp soğurken, 25 milimetrelik sonikat kapaklar 10 dakika boyunca etanol içinde kayar. Hazırlanmakta olan pul sayısı kadar kapak fişi kullanın. Kapak kapaklarını DI suyuyla iyice durulayın ve filtrelenmiş bir hava tabancası kullanarak kurulayın.Plazma temizleyiciyi yüksek vakum altında kullanarak kapakları bir dakika boyunca plazma ile tedavi edin. Kapak kapaklarının odanın içinde hareket etmesini önlemek için işlemden sonra vakumu yavaşça serbest bırakın. Her bir örtüyü, doğrudan güneş ışığından veya tepegöz aydınlatmasından yoksun bir odada 100 mikrolitre floresan etiketli protein çözeltisi ile kaplayın.Işıktan ekstra koruma için numuneleri örtün ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. Her bir kapak kaymasını DI suyu ile iyice durulayın. Her bir kapak kapağının kenarlarını bir kağıt havluya veya benzer bir emici malzemeye hafifçe vurarak fazla suyu yüzeyden çıkarın.Kapak kapaklarının en az 30 dakika boyunca karanlıkta açıkta bırakarak tamamen kurumasını bekleyin. Protein kaplı kapaklar kururken, PDMS damgasını bir neşter veya keskin bir bıçakla keserek ana kalıptan çıkarın. PDMS damgalarını yüksek vakum altında iki dakika boyunca plazma ile tedavi edin.Pulları duman başlığının altında kapaklı bir kaba yerleştirin, ardından her pulu% 100 etanol içinde seyreltilmiş ince% 103-APTMS tabakası ile kaplayın. Kabı pullarla örtün ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Her iki taraftaki her damgayı DI suyuyla iyice durulayın.Pulları temiz bir kaba koyun ve DI suyunda hazırlanan% 2.5 glutaraldehit ile kaplayın. Pulları örtün ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Pulları DI su ile iyice durulayın.Daha önce tarif edildiği gibi yüzeyden fazla suyu çıkarın ve pulların 30 dakika boyunca ortaya çıkarılmadan kurumasını bekleyin. 30 dakika sonra protein kaplı kapaklar veya pullar tamamen kuru değilse, tamamen kuruması için filtrelenmiş bir hava tabancası kullanın. Pulların desen tarafını, tam temas etmeleri için yeterli basınçla kapak fişlerine itin.15 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Ardından PDMS damgalarını kapak fişlerinden dikkatlice soyun. Uygun filtreye sahip bir floresan mikroskop kullanarak, desenli kapakların doğruluğunu kontrol edin.Desenli kapak fişlerini hemen kullanın veya daha fazla kullanana kadar doğrudan ışıktan uzak tutun. PAA hidrojel öncüsünü hazırlamadan önce, açılmadan önce oda sıcaklığına ulaşmak için akrilik asit NHS esterini buzdolabından çıkarın. % 70 etanol ile sterilize ederek değiştirilebilir bir kapaklı tabak seti hazırlayın, ardından kullanımdan önce en az 30 dakika boyunca bir biyogüvenlik kabininde UV ışığı altında inkübe edin.Duman başlığının altında, 15 mililitrelik konik bir tüpe DI suyunda hazırlanan 1.25 mililitre% 40 akrilamid ekleyin. Aynı tüpe DI suyunda hazırlanan 175 mikrolitre bis-akrilamid çözeltisi ekleyin. Daha sonra 500 mikrolitre 10X PBS, ardından 2.915 mililitre DI su ekleyin.Bu öncülün 969 mikrolitresini 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne pipet alın ve geri kalanını iki haftaya kadar dört santigrat derecede saklayın. Taze bir mikrosantrifüj tüpünde 50 ila 100 miligram APS ölçün ve DI suyunda mililitre başına 100 miligrama kadar seyreltin. NHS esterini kaputta açın ve bir mikrosantrifüj tüpünde üç miligrama kadar NHS'yi dikkatlice ölçün.NHS esterini 1X PBS'de mililitre başına bir miligrama seyreltin. Duman başlığının altında, PAA öncülünün 969 mikrolitrelik aliquot'unu içeren mikrosantrifüj tüpüne iki mikrolitre TEMED ekleyin. Hidrojel çözeltisinin pH'ını azaltmak ve NHS esterinin hidrolizini önlemek için 15 mikrolitre bir molar HCL ekleyin.Tüpe 10 mikrolitre NHS ester çözeltisi ekleyin. Bir biyogüvenlik kabininde aşağıdaki adımları uygulayın. 30 milimetrelik kapak kaymasını, 3-APTMS ve glutaraldehit ile işlenmiş tarafı yukarı bakacak şekilde ayarlanmış kapak kapağının orta kısmına dikkatlice yerleştirin ve plastik halkayı üstüne vidalayın.Bir sonraki adıma hazırlanmak için desenli kapak kapağını minimum ışığa maruz kalacak şekilde ayarlayın. PAA öncü aliquot tüpüne beş mikrolitre APS çözeltisi pipetin, ardından ters çevirin ve karıştırın. Hemen pipetin 35 mikrolitresini bu çözeltinin 30 milimetrelik kapağına yerleştirin.Desenli kapak kapağını, protein tarafı aşağı bakacak şekilde çözeltinin üzerine yerleştirin. Hidrojelde hava kabarcıkları oluşturmamaya dikkat edin. Hidrojeli ışıktan koruyun ve 90 dakika boyunca polimerize olmasına izin verin.Hidrojel polimerize olduktan sonra, üst kapak kaymasını çıkarmak için bir tıraş bıçağı veya neşter kullanın, jelin yüzeyindeki deseni mahvetmekten kaçınmak için kapak kaymasının geri düşmediğinden veya jelden kaymadığından emin olun. Hidrojelde kalan NHS esterini pasifleştirmek için, jele iki mililitre steril PBS ekleyin ve 45 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Jelleri derhal deneyler için hazırlayın veya daha fazla kullanana kadar steril PBS'de dört santigrat derecede steril PBS'de gece boyunca saklayın.Hidrojeller, kümeler içindeki hücresel çekiş kuvvetlerini görselleştirmek ve ölçmek ve önceden belirlenmiş boyut ve şekle sahip ada desenleri oluşturmak için dolaylı olarak floresan fibronektin ile desenlendi. Desen kalitesi, PDMS damgasının döküldüğü ana kalıbın aslına uygunluğu ile doğrudan ilişkiliydi. Bu yöntem, önceden belirlenmiş şekle sahip izole edilmiş, iyi tanımlanmış ada desenleri üretebilir.Fibronektin adezyon noktaları sadece adanın istenilen bölgesinde mevcuttu. Bu izole yapışma noktaları adaları, küme şeklinin daha iyi kontrol edilmesini sağladı. PDMS pullarının iki küçük 3-APTMS ile kaplanması kritik öneme sahiptir, çünkü çıkarma yönteminin etkinliğini sınırlarken, çok fazla damga yüzeyinde turuncu bir kalıntı yaratacaktır.Burada oluşturulan desenler, hem bireysel hücrelerde hem de kümelerde hücresel çekiş kuvvetlerini belirlemek için kullanılabilir, bu da mekanik homeostazı sürdürme yetenekleri hakkında fikir verir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Düşük Maliyetli Cryo-Işık Mikroskopi Sahne İmalatı İlişkili Işık / Elektron Mikroskopi

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Biyomühendislik

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Çekme Kuvveti Mikroskopi Hücre Kültürü Yüzey civarında yerelleştirme raportör flöresan Beads için Yeni Bir Yöntem

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

Kuantum Nokta Nanopartiküller kullanma Korelatif Işık- ve Elektron Mikroskobu

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Hücre farklılaşması ve Çekiş Kuvvetleri Korelatif Analizi için Yüksek verim Hücre Mikroarray Platformu

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Pattern-based Search of Epigenomic Data Using GeNemo

Desen tabanlı arama Epigenomic verileri GeNemo kullanarak

Compared with the robust text-based search tools for genomic or RNA sequencing data, current methodologies for pattern-based searches of epigenomic and ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Cryo-immobilize hücreler yapılarda bağdaşık ışık elektron izleme ve Viral Protein Imaging mikroskobu (CLEM) ilişkili

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Hücreleri tarafından seçilmiş adezyon oluşumunda görselleştirme gelişmiş Disk-toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

İlk 3D hücre küme denetimi içinde a Hybrid jel küp aygıt için tekrarlanabilir model oluşumları

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

PDMS kullanarak yüksek verim çekiş kuvveti mikroskobu dönüşüm büyüme faktörü-β epitelyal-mezenkimal geçiş üzerinde doz bağımlı etkileri ortaya çıkarır

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Görselleştirme Germinosomes ve Bacillus subtilis sporlar iç zar

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...