Name: biomolecular imaging of cellular uptake of nanoparticles using multimodal nonlinear optical microscopy
Uploaded: 2022-05-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biomolecular Imaging of Cellular Uptake of Nanoparticles using Multimodal Nonlinear Optical Microscopy at JoVE.com

تم دعم هذا البحث من قبل منح EPSRC: Raman Notheranostics (EP / R020965 / 1) ومرفق CONTRAST (EP / S009957 / 1).

1. تشغيل نظام الليزر
<ol><li>قم بتشغيل نظام التعشيق وحدد ليزر الذراع قبل بدء تشغيل النظام.</li>
	<li>قم بتشغيل جهاز الكمبيوتر باستخدام البرنامج للتحكم في ليزر الفيمتو ثانية ثنائي الإخراج.</li>
	<li>قم بتحميل البرنامج لليزر الفيمتو ثانية ثنائي الإخراج ؛ يتيح هذا البرنامج تشغيل الليزر وإيقاف ...

<ol>
	<li>Tabish, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+gold+nanostructures+for+light+mediated+cancer+theranostics:+Combining+optical+diagnostics+with+photothermal+therapy.">Smart gold nanostructures for light mediated cancer theranostics: Combining optical diagnostics with photothermal therapy.</a> Advanced Science. 7 (15), 1903441 (2020).</li><li>Tian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanostars+for+efficient+in+vitro+and+in+vivo+real-time+SERS+detection+and+drug+delivery+via+plasmonic-tunable+Raman/FTIR+imaging.">Gold nanostars for efficient in vitro and in vivo real-time SERS detection and drug delivery via plasmonic-tunable Raman/FTIR imaging.</a> Biomaterials. 106, 87-97 (2016).</li><li>Jenkins, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+photothermal+treatment+efficacy+and+normal+tissue+protection+via+vascular+targeted+gold+nanocages.">Enhanced photothermal treatment efficacy and normal tissue protection via vascular targeted gold nanocages.</a> Nanotheranostics. 3 (2), 145-155 (2019).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+and+synthesis+of+gammaFe2+O3+@Au+magnetic+gold+nanoflowers+for+efficient+cancer+theranostics.">Rational design and synthesis of gammaFe2 O3 @Au magnetic gold nanoflowers for efficient cancer theranostics.</a> Advanced Materials. 27 (34), 5049-5056 (2015).</li><li>Dilipkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+multiphoton+endomicroscopy+for+minimally+invasive+in+vivo+imaging.">Label-free multiphoton endomicroscopy for minimally invasive in vivo imaging.</a> Advanced science. 6 (8), 1801735 (2019).</li><li>Wang, C. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+normal+and+cancerous+lung+tissues+by+multiphoton+imaging.">Differentiation of normal and cancerous lung tissues by multiphoton imaging.</a> Journal of Biomedical Optics. 14 (4), 044034 (2009).</li><li>Chrabaszcz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+standard+and+HD+FT-IR+with+multimodal+CARS/TPEF/SHG/FLIMS+imaging+in+the+detection+of+the+early+stage+of+pulmonary+metastasis+of+murine+breast+cancer.">Comparison of standard and HD FT-IR with multimodal CARS/TPEF/SHG/FLIMS imaging in the detection of the early stage of pulmonary metastasis of murine breast cancer.</a> The Analyst. 145 (14), 4982-4990 (2020).</li><li>Tsai, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+radiofrequency-skin+interaction+using+multiphoton+microscopy+in+vivo.">Visualizing radiofrequency-skin interaction using multiphoton microscopy in vivo.</a> Journal of Dermatological Science. 65 (2), 95-101 (2012).</li><li>Wang, C. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+cutaneous+cancer+revealed+by+intravital+nonlinear+optical+microscopy.">Early development of cutaneous cancer revealed by intravital nonlinear optical microscopy.</a> Applied Physics Letters. 97 (11), 113702 (2010).</li><li>Li, F. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+skin+fold+chamber+for+high+resolution+multiphoton+imaging.">Dorsal skin fold chamber for high resolution multiphoton imaging.</a> Optical and Quantum Electronics. 37 (13), 1439-1445 (2005).</li><li>Tong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+semiconducting+and+metallic+carbon+nanotubes+in+cells+and+mice+using+transient+absorption+microscopy.">Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy.</a> Nature Nanotechnology. 7 (1), 56-61 (2011).</li><li>Chong, S., Min, W., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground-state+depletion+microscopy:+Detection+sensitivity+of+single-molecule+optical+absorption+at+room+temperature.">Ground-state depletion microscopy: Detection sensitivity of single-molecule optical absorption at room temperature.</a> The Journal of Physical Chemistry Letters. 1 (23), 3316-3322 (2010).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+absorption+microscopy+of+gold+nanorods+as+spectrally+orthogonal+labels+in+live+cells.">Transient absorption microscopy of gold nanorods as spectrally orthogonal labels in live cells.</a> Nanoscale. 6 (18), 10536-10539 (2014).</li><li>Liu, J., Irudayaraj, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-fluorescent+quantification+of+single+mRNA+with+transient+absorption+microscopy.">Non-fluorescent quantification of single mRNA with transient absorption microscopy.</a> Nanoscale. 8 (46), 19242-19248 (2016).</li><li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).</li><li>Wang, C. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+chemically+specific+mapping+of+agrochemical+seed+coatings+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">In situ chemically specific mapping of agrochemical seed coatings using stimulated Raman scattering microscopy.</a> Journal of Biophotonics. 11 (11), 201800108 (2018).</li><li>Wang, C. -. C., Yoong, F. -. Y., Penfield, S., Moger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+active+ingredients+uptake+in+seed+coats+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Visualization of active ingredients uptake in seed coats with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings SPIE 10069, Multiphoton Microscopy the Biomedical Sciences XVII. , 1006928 (2017).</li><li>Hu, F., Shi, L., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+of+chemical+bonds+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).</li><li>Zeytunyan, A., Baldacchini, T., Zadoyan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Module+for+multiphoton+high-resolution+hyperspectral+imaging+and+spectroscopy.">Module for multiphoton high-resolution hyperspectral imaging and spectroscopy.</a> Proceedings SPIE 10498, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XVIII. , 104980 (2018).</li><li>Wang, C. -. C., Wu, R. -. J., Lin, S. -. J., Chen, Y. -. F., Dong, C. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+discrimination+of+normal+and+pulmonary+cancer+tissues+using+multiphoton+fluorescence+ratiometric+microscopy.">Label-free discrimination of normal and pulmonary cancer tissues using multiphoton fluorescence ratiometric microscopy.</a> Applied Physics Letters. 97 (4), 043706 (2010).</li><li>Wang, C. -. C., Chandrappa, D., Smirnoff, N., Moger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lipid+accumulation+in+the+green+microalga+botryococcus+braunii+with+frequency-modulated+stimulated+Raman+scattering.">Monitoring lipid accumulation in the green microalga botryococcus braunii with frequency-modulated stimulated Raman scattering.</a> Proceedings SPIE 9329, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XV. , 9329 (2015).</li><li>Figueroa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadband+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+parabolic+fiber+amplifier+source.">Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source.</a> Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).</li><li>Cui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+plasmon-enhanced+CARS+and+TPEF+for+Gram+staining+identification+of+non-fluorescent+bacteria.">In situ plasmon-enhanced CARS and TPEF for Gram staining identification of non-fluorescent bacteria.</a> Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 264, 120283 (2022).</li><li>Ma, J., Sun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+optical+microscopies+(NOMs)+and+plasmon-enhanced+NOMs+for+biology+and+2D+materials.">Nonlinear optical microscopies (NOMs) and plasmon-enhanced NOMs for biology and 2D materials.</a> Nanophotonics. 9 (6), 1341-1358 (2020).</li><li>Sun, L., Chen, Y., Sun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+nonemissive+excited-state+intramolecular+proton+transfer+by+plasmon-enhanced+hyper-Raman+scattering+and+two-photon+excitation+fluorescence.">Exploring nonemissive excited-state intramolecular proton transfer by plasmon-enhanced hyper-Raman scattering and two-photon excitation fluorescence.</a> The Journal of Physical Chemistry C. 126 (1), 487-492 (2022).</li></ol>

قدمت هذه الدراسة مزيجا من وحدة SF-TRU ونظام الليزر ثنائي الإخراج فائق السرعة الذي أظهر تطبيقاته في التحليل الطيفي متعدد الوسائط. بفضل قدرتها على التحقيق في امتصاص الخلايا السرطانية لجسيمات الذهب النانوية (AuNPs) ، يمكن لمنصة التصوير متعدد الوسائط تصور الاستجابات الخلوية لعلاجات السرطان شديدة...

أظهرت جسيمات الذهب النانوية (AuNPs) إمكانات كبيرة كمجسات تصوير متوافقة حيويا ، على سبيل المثال ، كركائز فعالة لمطيافية رامان (SERS) المحسنة سطحيا في مختلف التطبيقات الطبية الحيوية. تشمل التطبيقات الرئيسية مجالات مثل الاستشعار الحيوي والتصوير الحيوي والتحليل الطيفي المعزز للسطح والعلاج الحراري الضوئي لعلاج السرطان1. علاوة على ذلك ، يعد فحص AuNPs في الأنظمة الحية أمرا بالغ الأهمية لتقييم وفهم التفاعل بين AuNPs والأنظمة البيولوجية. هناك العديد من التقنيات التحليلية ، بما في ذلك التحليل الطيفيللأشعة تحت الحمراء لتحويل فورييه (FTIR) 2 ، وقياس الطيف الكتلي المقترن بالحث بالاجتثاث بالليزر (LA-ICP-MS)3 ، والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)4 التي تم استخدامها بنجاح للتحقيق في توزيع AuNPs في الأنسجة. ومع ذلك ، تعاني هذه الطرق من العديد من العيوب مثل كونها تستغرق وقتا طويلا وتتضمن تحضيرا معقداللعينة 3 ، أو تتطلب أوقات اكتساب طويلة ، أو عدم وجود دقة مكانية دون الميكرون 2,4.
بالمقارنة مع تقنيات التصوير التقليدية ، يوفر الفحص المجهري البصري غير الخطي العديد من المزايا لفحص الخلايا الحية و AuNPs: يحقق المجهر البصري غير الخطي عمق تصوير أعمق ويوفر قدرة التقسيم البصري 3D الجوهرية باستخدام الليزر فائق السرعة بالقرب من الأشعة تحت الحمراء. مع التحسن الكبير في سرعة التصوير وحساسية الكشف ، تم إثبات مضان متحمس ثنائي الفوتون (TPEF) 5،6،7 والجيل التوافقي الثاني (SHG) 8،9،10 المجهري لزيادة تحسين التصوير غير الجراحي للجزيئات الحيوية الداخلية في الخلايا والأنسجة الحية. علاوة على ذلك ، باستخدام تقنيات بصرية غير خطية جديدة لمسبار المضخة مثل الامتصاص العابر (TA) 11،12،13،14 وتشتت رامان المحفز (SRS) 15،16،17،18 ، من الممكن اشتقاق تباين كيميائي حيوي خال من الملصقات للهياكل الخلوية و AuNPs. يعد تصور AuNPs دون استخدام الملصقات الخارجية ذا أهمية كبيرة لأن الاضطرابات الكيميائية للجسيمات النانوية ستعدل خصائصها الفيزيائية وبالتالي امتصاصها في الخلايا.
يقدم هذا البروتوكول تنفيذ وحدة توقيت التركيز الطيفي وإعادة التركيب (SF-TRU) لليزر النبضي ثنائي الطول الموجي ، مما يتيح التصوير السريع متعدد الوسائط ل AuNPs والخلايا السرطانية. يهدف هذا العمل إلى إظهار تفاصيل تقنيات TPEF و TA و SRS المتكاملة على مجهر المسح بالليزر.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>APE SRS Detection Unit</td>
			<td>APE (Angewandte Physik &#38; Elektronik GmbH)</td>
			<td>APE Lock-in Module</td>
			<td>Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Scanning Unit</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV 3000</td>
			<td>Confocal scanning unit used for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 &#181;m</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C37483</td>
			<td>Polystyrene microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CG15CH2</td>
			<td>22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td>Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flouview</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV31S-SW</td>
			<td>Laser scanning microscope control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>BX precision</td>
			<td>40543</td>
			<td>Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV3000</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83P2ZF</td>
			<td>Other microscope frames can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Nanoparticles</td>
			<td>Nanopartz</td>
			<td>A11-60</td>
			<td>Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Input Output Interface</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV30 ANALOG</td>
			<td>This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSight X3</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680&#8211;1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Frame</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse 4T1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2539</td>
			<td>Mouse breast cancer cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA 1.2 Water Immersion Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XW/IR</td>
			<td>The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA 1.4 Condenser</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CSC1003</td>
			<td>Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R3896</td>
			<td>PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT Connector</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13654-01-Y002</td>
			<td>Connector for PMT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Supply</td>
			<td>RS</td>
			<td>RSPD-3303 C</td>
			<td>Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10491-01</td>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SF-TRU</td>
			<td>Newport Spectra Physics</td>
			<td>SF-TRU</td>
			<td>System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biomolecular imaging of cellular uptake of nanoparticles using multimodal nonlinear optical microscopy

يعد فحص جسيمات الذهب النانوية (AuNPs) في الأنظمة الحية أمرا ضروريا للكشف عن التفاعل بين AuNPs والأنسجة البيولوجية. علاوة على ذلك ، من خلال دمج الإشارات الضوئية غير الخطية مثل تشتت رامان المحفز (SRS) ، والتألق المثار ثنائي الفوتون (TPEF) ، والامتصاص العابر (TA) في منصة التصوير ، يمكن استخدامه للكشف عن التباين الجزيئي الحيوي للهياكل الخلوية و AuNPs بطريقة متعددة الوسائط. تقدم هذه المقالة مجهرا ضوئيا غير خطي متعدد الوسائط وتطبقه لإجراء تصوير كيميائي محدد ل AuNPs في الخلايا السرطانية. توفر منصة التصوير هذه نهجا جديدا لتطوير AuNPs وظيفية أكثر كفاءة وتحديد ما إذا كانت داخل الأوعية الدموية المحيطة بالورم أو المساحات المحيطة بالخلية أو الخلوية.

يتم تقديم وحدة توقيت التركيز الطيفي وإعادة التركيب (SF-TRU) بين ليزر الفيمتو ثانية ثنائي الإخراج ومجهر المسح الضوئي بالليزر المعدل. يحتوي نظام الليزر فائق السرعة القابل للضبط المستخدم في هذه الدراسة على منفذي إخراج يوفران شعاعا واحدا بطول موجي ثابت يبلغ 1045 نانومتر والحزمة الأخرى قابلة للضب?...

Watch this Scientific Journal Video about Biomolecular Imaging of Cellular Uptake of Nanoparticles using Multimodal Nonlinear Optical Microscopy at JoVE.com

Biomolecular Imaging of Cellular Uptake of Nanoparticles using Multimodal Nonlinear Optical Microscopy

تقدم هذه المقالة تكامل وحدة التركيز الطيفي وليزر النبض ثنائي الإخراج ، مما يتيح التصوير الطيفي السريع لجسيمات الذهب النانوية والخلايا السرطانية. يهدف هذا العمل إلى إظهار تفاصيل التقنيات البصرية غير الخطية متعددة الوسائط على مجهر المسح الضوئي بالليزر القياسي.

التصوير الجزيئي الحيوي للامتصاص الخلوي للجسيمات النانوية باستخدام المجهر البصري غير الخطي متعدد الوسائط

Probing gold nanoparticles (AuNPs) in living systems is essential to reveal the interaction between AuNPs and biological tissues. Moreover, by integrating ...

يقدم بروتوكولنا فحصا مجهريا ضوئيا متعدد الوسائط وغير خطي ويطبقه لإجراء تصوير كيميائي محدد لجسيمات الذهب النانوية في الخلايا السرطانية. الميزة الرئيسية لنظام التصوير لدينا هي أنه يمكن استخدامه لمراجعة التباين الجزيئي الحيوي للهياكل الخلوية وجسيمات الذهب النانوية بطريقة متعددة الوسائط. للبدء ، قم بتشغيل مقابس جميع المعدات ، باستثناء صندوق التحكم عن بعد.بعد ذلك ، قم بتشغيل الجزء الخلفي من الصندوق واضغط على بدء التشغيل بعد أن يتحول الضوء البعيد إلى اللون الأزرق في صندوق التحكم. بعد ذلك ، قم بتشغيل جهاز الكمبيوتر الخاص بمجهر المسح الضوئي بالليزر وقم بتشغيل برنامج المجهر متحد البؤر. بعد ذلك ، تحقق من مسار ضوء المجهر باستخدام برنامج الكمبيوتر وتحكم في التركيز من خلال شاشة اللمس أو مقابض التحكم عن بعد أو برنامج الكمبيوتر.حدد إعدادات الصورة المطلوبة في البرنامج ، بما في ذلك Zoom ، وحجم الصورة بالبكسل ، ووقت بقاء البكسل ، مع التأكد من أن وقت بقاء البكسل أكبر من وقت التكامل. ضع قطرة من الماء المقطر فوق هدف الغمر في الماء الذي يركز أشعة الليزر في العينة وبين المكثف والعينة للتصوير. بعد ذلك ، اضبط ارتفاع المكثف على ما يقرب من ملليمتر واحد فوق العينة لجمع أكبر قدر ممكن من الضوء وحرك كاشف SRS الموضوعة على حامل متحرك خارج مسار الحزمة للتركيز على العينة باستخدام الضوء الأبيض.باستخدام إعدادات البرنامج ، حدد شعاع المضخة وقم بتغيير الطول الموجي لليزر إلى 802 نانومتر لاهتزازات CH و 898 نانومتر لذروة الأميد I ، وهو ما يمثل التغييرات الكبيرة في إزاحة رامان. لتحقيق تعديلات صغيرة في إزاحة رامان ، امسح مرحلة التأخير في وحدة SFTRU كما هو موضح في المخطوطة. بالنسبة لمجموعة البيانات الطيفية ، حدد علامة التبويب Trigger ، وانقر فوق Start by ttl trigger on ، ثم حدد تشغيل كل إطار.بعد ذلك ، في علامة التبويب السلسلة ، قم بتعيين السلسلة الزمنية وإيقاف تشغيل السلسلة Z. علاوة على ذلك ، قم بتعيين عدد الإطارات في السلسلة الزمنية لمطابقة عدد الخطوات في برنامج أجهزة الصراف الآلي. بعد ذلك ، انتقل إلى علامة التبويب Run في برنامج ATM وقم بتعيين مواضع مرحلة التأخير ل CH عند 90.25 و 92.25 ، بينما بالنسبة لمنطقة amide I عند 89 و 91 بالمليمترات ، المقابلة لموضع البدء والإيقاف للمسح الطيفي الفائق ، مع التأكد من أن عدد الخطوات يطابق عدد الإطارات في برنامج الكمبيوتر.بعد التحقق من الإعدادات الصحيحة ، ابدأ المكدس الطيفي في برنامج الكمبيوتر بالانتقال أولا إلى اكتساب ثم النقر فوق بدء المسح. ثم ، في برنامج ATM ، انقر فوق ابدأ ، الذي يبدأ في جمع سلسلة من الصور مع زيادات تدريجية في موضع مرحلة التأخير بين مواضع البدء والإيقاف المحددة. بعد ذلك ، التقط سلسلة زمنية من الصور في مواضع مختلفة لمرحلة التأخير لإنشاء مسح فائق الطيف.باستخدام الوحدة التناظرية ، أرسل واستقبل إشارات ttl من وإلى نظام SFTRU لمزامنة الحصول على الصورة وحركة مرحلة التأخير. للتبديل بين التصوير في منطقة اهتزاز CH إلى منطقة اهتزاز amide I ، قم بتغيير الطول الموجي للمضخة في برنامج الليزر من 802 نانومتر إلى 898 نانومتر. علاوة على ذلك ، قم بتغيير إعداد تشتت Stokes في برنامج ATM من 30 ملم إلى 5 ملم.اضبط المقبض السفلي على حامل المرآة لإجراء تعديل صغير على المرآة في مسار تشتت شعاع المضخة داخل صندوق SFTRU عن طريق تغيير زاوية المرآة بمقدار متزايد. للتحقق من صحة الانتقائية الكيميائية للكرات المجهرية للبوليسترين ، تم تسجيل تشتت رامان المحفز الطيفي وأطياف رامان العفوية. كانت الأطياف متطابقة باستثناء الاختلاف الذي لوحظ في الكثافة النسبية.تم إجراء تصوير تشتت رامان المحفز للخلايا السرطانية 4T1 بأرقام موجية 2،852 ، 2،930 و 2،968 ، بما يتوافق مع النطاق الاهتزازي الممتد للكربون والهيدروجين للجزيئات الحيوية للدهون والبروتين والحمض النووي. تم إجراء تصوير متعدد الوسائط للخلايا السرطانية 4T1 المغطاة بجزيئات الذهب النانوية للتحقيق في توزيعات الجسيمات النانوية في الخلايا السرطانية. تم الحصول على صور تشتت رامان المحفزة المكتسبة لقناة CH2 و CH3 ، ومجسات الفلورسنت LysoTracker ، وقناة تشتت رامان المحفزة خارج الرنين.أهم شيء يجب تذكره هو تغيير المنطقة الاهتزازية ، مرجع المضخة ، في برنامج الليزر وكذلك إعداد تشتت Stokes أثناء البروتوكول. يمكن تحويل هذا النظام بسهولة من منطقة الفيمتو ثانية إلى منطقة بيكو ثانية دون التأثير على المحاذاة البصرية. تسمح لنا هذه القدرة بإجراء تشتت رامان متماسك متعدد الفوتونات والتحليل الطيفي لمسبار المضخة وتطبيقاتها.توفر منصة التصوير متعددة الوسائط هذه رؤى جديدة في الطب النانوي وتمهد الطريق للتصوير الجزيئي للخلايا والأنسجة والجسيمات النانوية الذهبية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

اكتشاف الجزيئية البيولوجية توظيف الانعكاس التداخل التصوير الاستشعار (IRIS)

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

ثلاثي الأبعاد البصرية الميكروسكوب الضوئي الاستبانة

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

تحليل التطبع الخلوي من الجزيئات الدقيقة والبكتيريا التي متعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

المجهر الضوئي الكمية: قياس الخلوية البيوفيزيائية الميزات مع مجهر بصري قياسي

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

إعداد ميكا المدعومة الدهون طبقات ثنائية لارتفاع القرار المجهر الضوئي التصوير

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

مضان تبريد لالقريبة من الأشعة تحت الحمراء Fluorophore-مغلفة Liposomal كأداة لل<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير الضوئي

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Biofunctionalized البروسية الأزرق النانوية الجزيئية لالمتعدد الوسائط تطبيقات التصوير

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

المتلازم الخفيفة والمجهر الإلكتروني عن طريق الكم دوت النانوية

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

استهدفت البلازما غشاء تسليم ومسعور الشحن مغلف في الكريستال السائل الجسيمات النانوية الناقل

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

جهاز التقاط الصور الحية طويلة الأجل لتحسين التلاعب التجريبية من اليرقات الزرد

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...