Name: biomolecular imaging of cellular uptake of nanoparticles using multimodal nonlinear optical microscopy
Uploaded: 2022-05-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biomolecular Imaging of Cellular Uptake of Nanoparticles using Multimodal Nonlinear Optical Microscopy at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מענקי EPSRC: Raman Nanotheranostics (EP/R020965/1) ומתקן CONTRAST (EP/S009957/1).

1. הפעלת מערכת הלייזר
<ol><li>הפעל את מערכת האינטרלוק ובחר לייזר זרוע לפני הפעלת המערכת.</li>
	<li>הפעל את המחשב עם התוכנה כדי לשלוט בלייזר femtosecond בעל הפלט הכפול.</li>
	<li>טען את התוכנה עבור לייזר femtosecond בעל פלט כפול; תוכנה זו מאפשרת להפעיל ולכבות את הלייזר ושולטת ישירות באורך הגל של קרן המשאב...

<ol>
	<li>Tabish, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+gold+nanostructures+for+light+mediated+cancer+theranostics:+Combining+optical+diagnostics+with+photothermal+therapy.">Smart gold nanostructures for light mediated cancer theranostics: Combining optical diagnostics with photothermal therapy.</a> Advanced Science. 7 (15), 1903441 (2020).</li><li>Tian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanostars+for+efficient+in+vitro+and+in+vivo+real-time+SERS+detection+and+drug+delivery+via+plasmonic-tunable+Raman/FTIR+imaging.">Gold nanostars for efficient in vitro and in vivo real-time SERS detection and drug delivery via plasmonic-tunable Raman/FTIR imaging.</a> Biomaterials. 106, 87-97 (2016).</li><li>Jenkins, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+photothermal+treatment+efficacy+and+normal+tissue+protection+via+vascular+targeted+gold+nanocages.">Enhanced photothermal treatment efficacy and normal tissue protection via vascular targeted gold nanocages.</a> Nanotheranostics. 3 (2), 145-155 (2019).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+and+synthesis+of+gammaFe2+O3+@Au+magnetic+gold+nanoflowers+for+efficient+cancer+theranostics.">Rational design and synthesis of gammaFe2 O3 @Au magnetic gold nanoflowers for efficient cancer theranostics.</a> Advanced Materials. 27 (34), 5049-5056 (2015).</li><li>Dilipkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+multiphoton+endomicroscopy+for+minimally+invasive+in+vivo+imaging.">Label-free multiphoton endomicroscopy for minimally invasive in vivo imaging.</a> Advanced science. 6 (8), 1801735 (2019).</li><li>Wang, C. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+normal+and+cancerous+lung+tissues+by+multiphoton+imaging.">Differentiation of normal and cancerous lung tissues by multiphoton imaging.</a> Journal of Biomedical Optics. 14 (4), 044034 (2009).</li><li>Chrabaszcz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+standard+and+HD+FT-IR+with+multimodal+CARS/TPEF/SHG/FLIMS+imaging+in+the+detection+of+the+early+stage+of+pulmonary+metastasis+of+murine+breast+cancer.">Comparison of standard and HD FT-IR with multimodal CARS/TPEF/SHG/FLIMS imaging in the detection of the early stage of pulmonary metastasis of murine breast cancer.</a> The Analyst. 145 (14), 4982-4990 (2020).</li><li>Tsai, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+radiofrequency-skin+interaction+using+multiphoton+microscopy+in+vivo.">Visualizing radiofrequency-skin interaction using multiphoton microscopy in vivo.</a> Journal of Dermatological Science. 65 (2), 95-101 (2012).</li><li>Wang, C. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+cutaneous+cancer+revealed+by+intravital+nonlinear+optical+microscopy.">Early development of cutaneous cancer revealed by intravital nonlinear optical microscopy.</a> Applied Physics Letters. 97 (11), 113702 (2010).</li><li>Li, F. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+skin+fold+chamber+for+high+resolution+multiphoton+imaging.">Dorsal skin fold chamber for high resolution multiphoton imaging.</a> Optical and Quantum Electronics. 37 (13), 1439-1445 (2005).</li><li>Tong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+semiconducting+and+metallic+carbon+nanotubes+in+cells+and+mice+using+transient+absorption+microscopy.">Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy.</a> Nature Nanotechnology. 7 (1), 56-61 (2011).</li><li>Chong, S., Min, W., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground-state+depletion+microscopy:+Detection+sensitivity+of+single-molecule+optical+absorption+at+room+temperature.">Ground-state depletion microscopy: Detection sensitivity of single-molecule optical absorption at room temperature.</a> The Journal of Physical Chemistry Letters. 1 (23), 3316-3322 (2010).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+absorption+microscopy+of+gold+nanorods+as+spectrally+orthogonal+labels+in+live+cells.">Transient absorption microscopy of gold nanorods as spectrally orthogonal labels in live cells.</a> Nanoscale. 6 (18), 10536-10539 (2014).</li><li>Liu, J., Irudayaraj, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-fluorescent+quantification+of+single+mRNA+with+transient+absorption+microscopy.">Non-fluorescent quantification of single mRNA with transient absorption microscopy.</a> Nanoscale. 8 (46), 19242-19248 (2016).</li><li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).</li><li>Wang, C. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+chemically+specific+mapping+of+agrochemical+seed+coatings+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">In situ chemically specific mapping of agrochemical seed coatings using stimulated Raman scattering microscopy.</a> Journal of Biophotonics. 11 (11), 201800108 (2018).</li><li>Wang, C. -. C., Yoong, F. -. Y., Penfield, S., Moger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+active+ingredients+uptake+in+seed+coats+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Visualization of active ingredients uptake in seed coats with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings SPIE 10069, Multiphoton Microscopy the Biomedical Sciences XVII. , 1006928 (2017).</li><li>Hu, F., Shi, L., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+of+chemical+bonds+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).</li><li>Zeytunyan, A., Baldacchini, T., Zadoyan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Module+for+multiphoton+high-resolution+hyperspectral+imaging+and+spectroscopy.">Module for multiphoton high-resolution hyperspectral imaging and spectroscopy.</a> Proceedings SPIE 10498, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XVIII. , 104980 (2018).</li><li>Wang, C. -. C., Wu, R. -. J., Lin, S. -. J., Chen, Y. -. F., Dong, C. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+discrimination+of+normal+and+pulmonary+cancer+tissues+using+multiphoton+fluorescence+ratiometric+microscopy.">Label-free discrimination of normal and pulmonary cancer tissues using multiphoton fluorescence ratiometric microscopy.</a> Applied Physics Letters. 97 (4), 043706 (2010).</li><li>Wang, C. -. C., Chandrappa, D., Smirnoff, N., Moger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lipid+accumulation+in+the+green+microalga+botryococcus+braunii+with+frequency-modulated+stimulated+Raman+scattering.">Monitoring lipid accumulation in the green microalga botryococcus braunii with frequency-modulated stimulated Raman scattering.</a> Proceedings SPIE 9329, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XV. , 9329 (2015).</li><li>Figueroa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadband+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+parabolic+fiber+amplifier+source.">Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source.</a> Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).</li><li>Cui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+plasmon-enhanced+CARS+and+TPEF+for+Gram+staining+identification+of+non-fluorescent+bacteria.">In situ plasmon-enhanced CARS and TPEF for Gram staining identification of non-fluorescent bacteria.</a> Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 264, 120283 (2022).</li><li>Ma, J., Sun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+optical+microscopies+(NOMs)+and+plasmon-enhanced+NOMs+for+biology+and+2D+materials.">Nonlinear optical microscopies (NOMs) and plasmon-enhanced NOMs for biology and 2D materials.</a> Nanophotonics. 9 (6), 1341-1358 (2020).</li><li>Sun, L., Chen, Y., Sun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+nonemissive+excited-state+intramolecular+proton+transfer+by+plasmon-enhanced+hyper-Raman+scattering+and+two-photon+excitation+fluorescence.">Exploring nonemissive excited-state intramolecular proton transfer by plasmon-enhanced hyper-Raman scattering and two-photon excitation fluorescence.</a> The Journal of Physical Chemistry C. 126 (1), 487-492 (2022).</li></ol>

מחקר זה הציג את השילוב של מודול SF-TRU ומערכת לייזר מהירה במיוחד עם פלט כפול המדגים את יישומיו למיקרוספקטרוסקופיה רב-מודאלית. עם יכולתה לחקור ספיגת ננו-חלקיקי זהב (AuNPs) על ידי תאים סרטניים, פלטפורמת ההדמיה הרב-מודאלית יכולה לדמיין את תגובות התאים לטיפולים בסרטן היפרתרמי כאשר קרני לייזר נספגו?...

ננו-חלקיקי זהב (AuNPs) הראו פוטנציאל גדול כבדיקות הדמיה תואמות ביולוגית, לדוגמה, כמצעי ספקטרוסקופיית ראמאן (SERS) יעילים משופרים על פני השטח ביישומים ביו-רפואיים שונים. יישומים עיקריים כוללים תחומים כגון ביוסנסינג, הדמיה ביולוגית, ספקטרוסקופיות משופרות פני השטח וטיפול פוטותרמי לטיפול בסרטן1. יתר על כן, בדיקת AuNPs במערכות חיות היא חיונית להערכה ולהבנה של יחסי הגומלין בין AuNPs למערכות ביולוגיות. ישנן טכניקות אנליטיות שונות, כולל ספקטרוסקופיית אינפרה-אדום התמרת פורייה (FTIR)2, ספקטרומטריית מסה מצומדת אינדוקטיבית בלייזר (LA-ICP-MS)3, והדמיית תהודה מגנטית (MRI)4 ששימשו בהצלחה לחקר התפלגות AuNPs ברקמות. עם זאת, שיטות אלה סובלות ממספר חסרונות כגון היותן גוזלות זמן וכרוכות בהכנת דגימות מורכבות3, הדורשות זמני רכישה ארוכים, או היעדר רזולוציה מרחבית תת-מיקרונית 2,4.
בהשוואה לטכניקות הדמיה קונבנציונליות, מיקרוסקופיה אופטית לא ליניארית מציעה מספר יתרונות לחקירת תאים חיים ו- AuNPs: המיקרוסקופיה האופטית הלא ליניארית משיגה עומק הדמיה עמוק יותר ומספקת יכולת חיתוך אופטית תלת-ממדית פנימית עם שימוש בלייזרים אולטרה-מהירים כמעט IR. עם השיפור המשמעותי במהירות ההדמיה וברגישות הגילוי, הודגמו כיצור פלואורסצנטי של שני פוטונים (TPEF)5,6,7 ומיקרוסקופיה של דור הרמוני שני (SHG)8,9,10 כדי לשפר עוד יותר את ההדמיה הלא פולשנית של ביומולקולות אנדוגניות בתאים ורקמות חיים. יתר על כן, באמצעות טכניקות אופטיות לא ליניאריות חדשניות של משאבה-בדיקה כגון ספיגה חולפת (TA)11,12,13,14 ופיזור ראמאן מגורה (SRS)15,16,17,18, ניתן לגזור ניגודיות ביוכימית נטולת תוויות של מבנים תאיים ו- AuNPs. להדמיה של AuNPs ללא שימוש בתוויות חיצוניות יש חשיבות רבה מכיוון שהפרעות כימיות של הננו-חלקיקים ישנו את תכונותיהם הפיזיקליות ומכאן את קליטתם בתאים.
פרוטוקול זה מציג את היישום של מודול יחידת תזמון ורקומבינציה של מיקוד ספקטרלי (SF-TRU) עבור לייזר פולסים באורך גל כפול, המאפשר הדמיה רב-מודאלית מהירה של AuNPs ותאים סרטניים. עבודה זו נועדה להדגים את הפרטים של טכניקות משולבות TPEF, TA ו- SRS במיקרוסקופ סריקת לייזר.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>APE SRS Detection Unit</td>
			<td>APE (Angewandte Physik &#38; Elektronik GmbH)</td>
			<td>APE Lock-in Module</td>
			<td>Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Scanning Unit</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV 3000</td>
			<td>Confocal scanning unit used for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 &#181;m</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C37483</td>
			<td>Polystyrene microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CG15CH2</td>
			<td>22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td>Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flouview</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV31S-SW</td>
			<td>Laser scanning microscope control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>BX precision</td>
			<td>40543</td>
			<td>Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV3000</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83P2ZF</td>
			<td>Other microscope frames can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Nanoparticles</td>
			<td>Nanopartz</td>
			<td>A11-60</td>
			<td>Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Input Output Interface</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV30 ANALOG</td>
			<td>This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSight X3</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680&#8211;1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Frame</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse 4T1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2539</td>
			<td>Mouse breast cancer cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA 1.2 Water Immersion Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XW/IR</td>
			<td>The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA 1.4 Condenser</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CSC1003</td>
			<td>Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R3896</td>
			<td>PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT Connector</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13654-01-Y002</td>
			<td>Connector for PMT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Supply</td>
			<td>RS</td>
			<td>RSPD-3303 C</td>
			<td>Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10491-01</td>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SF-TRU</td>
			<td>Newport Spectra Physics</td>
			<td>SF-TRU</td>
			<td>System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biomolecular imaging of cellular uptake of nanoparticles using multimodal nonlinear optical microscopy

חקירת ננו-חלקיקי זהב (AuNPs) במערכות חיות חיונית כדי לחשוף את האינטראקציה בין AuNPs לרקמות ביולוגיות. יתר על כן, על ידי שילוב אותות אופטיים לא ליניאריים כגון פיזור ראמאן מגורה (SRS), פלואורסצנציה מעוררת שני פוטונים (TPEF) ובליעה חולפת (TA) לפלטפורמת הדמיה, ניתן להשתמש בו כדי לחשוף ניגודיות ביומולקולרית של מבנים תאיים ו- AuNPs באופן רב-מודאלי. מאמר זה מציג מיקרוסקופיה אופטית רב-מודאלית לא ליניארית ומיישם אותה לביצוע הדמיה כימית ספציפית של AuNPs בתאים סרטניים. פלטפורמת הדמיה זו מספקת גישה חדשנית לפיתוח AuNPs פונקציונליים יעילים יותר ולקביעה אם הם נמצאים בתוך כלי הדם המקיפים את מרחבי הגידול, הציוד ההיקפי או התאי.

מודול התזמון ויחידת הרקומבינציה של מיקוד ספקטרלי (SF-TRU) מוצג בין לייזר הפמטו-שניות בעל הפלט הכפול לבין מיקרוסקופ סריקת הלייזר המותאם. מערכת הלייזר המהירה במיוחד המשמשת במחקר זה כוללת שתי יציאות יציאה המספקות קרן אחת באורך גל קבוע של 1,045 ננומטר והקרן השנייה ניתנת לכוונון בטווח של 680-1,300 ננומ?...

Watch this Scientific Journal Video about Biomolecular Imaging of Cellular Uptake of Nanoparticles using Multimodal Nonlinear Optical Microscopy at JoVE.com

Biomolecular Imaging of Cellular Uptake of Nanoparticles using Multimodal Nonlinear Optical Microscopy

מאמר זה מציג את השילוב של מודול מיקוד ספקטרלי ולייזר פולסים בעל פלט כפול, המאפשר הדמיה היפרספקטרלית מהירה של ננו-חלקיקי זהב ותאים סרטניים. עבודה זו נועדה להדגים את הפרטים של טכניקות אופטיות רב-מודאליות לא ליניאריות במיקרוסקופ סריקת לייזר סטנדרטי.

הדמיה ביומולקולרית של קליטת תאים של ננו-חלקיקים באמצעות מיקרוסקופיה אופטית רב-מודאלית לא ליניארית

Probing gold nanoparticles (AuNPs) in living systems is essential to reveal the interaction between AuNPs and biological tissues. Moreover, by integrating ...

הפרוטוקול שלנו מציג מיקרוסקופיה אופטית רב-מודאלית, לא ליניארית, ומיישם אותה לביצוע הדמיה כימית ספציפית של ננו-חלקיקי זהב בתאים סרטניים. היתרון העיקרי של מערכת ההדמיה שלנו הוא שניתן להשתמש בה כדי לסקור את הניגוד הביומולקולרי של מבנים תאיים וננו-חלקיקי זהב באופן רב-מודאלי. כדי להתחיל, הפעל את התקעים של כל הציוד, למעט תיבת השלט הרחוק.לאחר מכן, הפעל את גב הקופסה ולחץ על התחל פעולה לאחר שנורית השלט הופכת לכחולה על תיבת הבקרה. לאחר מכן, הפעל את המחשב האישי של מיקרוסקופ סריקת הלייזר והפעל את תוכנת המיקרוסקופ הקונפוקלי. לאחר מכן, בדוק את נתיב האור של המיקרוסקופ באמצעות תוכנת המחשב ושלוט במיקוד דרך מסך המגע או ידיות השלט הרחוק או תוכנת המחשב.בחר את הגדרות התמונה הרצויות בתוכנה, כולל זום, גודל תמונה בפיקסלים וזמן השהייה של פיקסלים, תוך הבטחה שזמן השהייה של הפיקסל גדול מזמן האינטגרציה. הניחו טיפת מים מזוקקים על גבי מטרת טבילת המים שממקדת את קרני הלייזר לתוך הדגימה ובין המעבה לדגימה לצורך הדמיה. לאחר מכן, כוונן את גובה המעבה למילימטר אחד מעל הדגימה כדי לאסוף את כמות האור המרבית ולהזיז את גלאי ה- SRS המוצב על תושבת ניידת אל מחוץ לנתיב הקרן כדי להתמקד בדגימה באמצעות אור לבן.באמצעות הגדרות התוכנה, בחר את קרן המשאבה ושנה את אורך גל הלייזר ל-802 ננומטר עבור תנודות CH ו-898 ננומטר עבור שיא אמיד I, תוך התחשבות בשינויים גדולים במשמרת ראמאן. כדי להשיג התאמות קטנות במשמרת ראמאן, סרוק את שלב ההשהיה ביחידת SFTRU כמתואר בכתב היד. עבור ערכת הנתונים ההיפרספקטרלית, בחר בכרטיסייה טריגר, לחץ על התחל על ידי טריגר ttl מופעל ולאחר מכן בחר הפעל כל מסגרת.לאחר מכן, בכרטיסיה סידרה, הגדר את סדרות הזמן למצב ואת סדרת Z כבויה. יתר על כן, הגדר את מספר המסגרות בסדרת הזמן כך שתתאים למספר השלבים בתוכנת הכספומט. לאחר מכן, עבור אל הכרטיסייה הפעלה בתוכנת ATM והגדר את עמדות שלב ההשהיה עבור CH ב- 90.25 ו- 92.25, ואילו עבור אזור אמיד I ב- 89 ו- 91 במילימטרים, המתאים למיקום ההתחלה והעצירה של הסריקה ההיפרספקטרלית, תוך הקפדה על כך שמספר הצעדים יתאים למספר המסגרות בתוכנת המחשב.לאחר בדיקת ההגדרות הנכונות, הפעל את המחסנית ההיפרספקטרלית בתוכנת המחשב על ידי מעבר תחילה אל רכוש ולאחר מכן לחיצה על התחל סריקה. לאחר מכן, בתוכנת הכספומט, לחץ על התחל, אשר יוזם את איסוף סדרת התמונות עם עליות מצטברות במיקום שלב ההשהיה בין עמדות ההתחלה והעצירה שנבחרו. לאחר מכן, צלם סדרת זמן של תמונות במיקומים שונים של שלבי השהיה כדי ליצור סריקה היפרספקטרלית.באמצעות היחידה האנלוגית, שלח וקבל אותות ttl אל מערכת SFTRU וממנה כדי לסנכרן את רכישת התמונה ואת התנועה של שלב ההשהיה. למעבר בין הדמיה באזור הרטט CH לאזור הרטט של אמיד I, שנה את אורך הגל של המשאבה בתוכנת הלייזר מ-802 ננומטר ל-898 ננומטר. יתר על כן, שנה את הגדרת הפיזור של סטוקס בתוכנת הכספומט מ -30 מילימטרים ל -5 מילימטרים.כוונן את הידית התחתונה בתושבת המראה כדי לבצע התאמה קטנה למראה במסלול פיזור קרן המשאבה בתוך תיבת SFTRU על ידי שינוי זווית המראה בכמות מצטברת. כדי לאמת את הסלקטיביות הכימית של המיקרוספרות הפוליסטירן, תועדו פיזור ראמאן מגורה היפרספקטרלי וספקטרום ראמאן ספונטני. הספקטרום היה זהה למעט ההבדל שנצפה בעוצמה היחסית.הדמיית פיזור הראמן המגורה של תאי סרטן 4T1 בוצעה במספרי גלים של 2, 852, 2, 930 ו-2, 968, המתאימים לפס הרטט המותח פחמן-מימן של ביומולקולות שומנים, חלבונים ודנ"א. הדמיה רב-מודאלית של תאי סרטן 4T1 במינון של ננו-חלקיקי זהב בוצעה כדי לחקור את התפלגות הננו-חלקיקים בתאים סרטניים. תמונות פיזור ראמאן המגורות שנרכשו התקבלו עבור ערוצי CH2 ו-CH3, בדיקות פלואורסצנטיות של LysoTracker, וערוץ פיזור ראמאן מגורה מחוץ לתהודה.הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא לשנות את אזור הרטט, את התייחסות המשאבה, בתוכנת הלייזר וגם את הגדרת הפיזור של סטוקס במהלך הפרוטוקול. ניתן להחליף מערכת זו בקלות מאזור פמטו-שניות לאזור פיקו-שניות מבלי להשפיע על היישור האופטי. יכולת זו מאפשרת לנו לבצע ספקטרוסקופיית גשושית רב-פוטונית קוהרנטית של ראמן ובדיקות משאבה ויישומיהן.פלטפורמת הדמיה רב-מודאלית זו מספקת תובנות חדשות על ננו-רפואה וסוללת את הדרך להדמיה מולקולרית של תאים, רקמות וננו-חלקיקי זהב.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

Biomolecular איתור העסקת ההחזרה interferometric דימות חיישן (IRIS)

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

תלת ממדית ברזולוציה אופטית photoacoustic מיקרוסקופית

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

ניתוח הפנמה נייד של חלקיקים וחיידקים על ידי Cytometry Multi-Flow דימות ספקטרלי

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

מיקרוסקופיה אופטית כמותי: מדידה נייד Biophysical תכונות עם תקן מיקרוסקופ אופטי

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

הכנת מיכה נתמכת יפידים bilayers לרזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה אופטית הדמיה

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

הקרינה-מרווה של Fluorophore הקרוב אינפרא אדום-כמוס liposomal ככלי ל<em&gt; In vivo</em&gt; דימות אופטי

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Biofunctionalized הכחול פרוסים חלקיקים ליישומי הדמיה מולקולריים Multimodal

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

מיקרוסקופי אלקטרונים בהירי-עור גומל באמצעות חלקיקי נקודה קוונטית

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

משלוח הממברנה ממוקד על Encapsulated מטענים הידרופובי בנושאת Nanoparticle קריסטל נוזלת

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

התקן הדמיה חיה לטווח ארוך עבור משופרת מניפולציה ניסויית של הזחלים דג זברה

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...