Name: biomolecular imaging of cellular uptake of nanoparticles using multimodal nonlinear optical microscopy
Uploaded: 2022-05-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biomolecular Imaging of Cellular Uptake of Nanoparticles using Multimodal Nonlinear Optical Microscopy at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av EPSRC Grants: Raman Nanotheranostics (EP / R020965 / 1) og CONTRAST facility (EP / S009957 / 1).

1. Slå på lasersystemet
<ol><li>Slå på låsesystemet og velg armlaser før du starter systemet.</li>
	<li>Slå på PC-en med programvaren for å kontrollere femtosekundlaseren med dobbel utgang.</li>
	<li>Last inn programvaren for femtosekundlaseren med dobbel utgang; Denne programvaren gjør det mulig å slå laseren på og av og styrer bølgelengden til pumpestrålen direkte.</li>
	<li>Slå på laserutslippet ved å holde nede på strømikonet for en telling på 3.</li>
	<li>Vent til laseren har ...

<ol>
	<li>Tabish, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+gold+nanostructures+for+light+mediated+cancer+theranostics:+Combining+optical+diagnostics+with+photothermal+therapy.">Smart gold nanostructures for light mediated cancer theranostics: Combining optical diagnostics with photothermal therapy.</a> Advanced Science. 7 (15), 1903441 (2020).</li><li>Tian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanostars+for+efficient+in+vitro+and+in+vivo+real-time+SERS+detection+and+drug+delivery+via+plasmonic-tunable+Raman/FTIR+imaging.">Gold nanostars for efficient in vitro and in vivo real-time SERS detection and drug delivery via plasmonic-tunable Raman/FTIR imaging.</a> Biomaterials. 106, 87-97 (2016).</li><li>Jenkins, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+photothermal+treatment+efficacy+and+normal+tissue+protection+via+vascular+targeted+gold+nanocages.">Enhanced photothermal treatment efficacy and normal tissue protection via vascular targeted gold nanocages.</a> Nanotheranostics. 3 (2), 145-155 (2019).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+and+synthesis+of+gammaFe2+O3+@Au+magnetic+gold+nanoflowers+for+efficient+cancer+theranostics.">Rational design and synthesis of gammaFe2 O3 @Au magnetic gold nanoflowers for efficient cancer theranostics.</a> Advanced Materials. 27 (34), 5049-5056 (2015).</li><li>Dilipkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+multiphoton+endomicroscopy+for+minimally+invasive+in+vivo+imaging.">Label-free multiphoton endomicroscopy for minimally invasive in vivo imaging.</a> Advanced science. 6 (8), 1801735 (2019).</li><li>Wang, C. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+normal+and+cancerous+lung+tissues+by+multiphoton+imaging.">Differentiation of normal and cancerous lung tissues by multiphoton imaging.</a> Journal of Biomedical Optics. 14 (4), 044034 (2009).</li><li>Chrabaszcz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+standard+and+HD+FT-IR+with+multimodal+CARS/TPEF/SHG/FLIMS+imaging+in+the+detection+of+the+early+stage+of+pulmonary+metastasis+of+murine+breast+cancer.">Comparison of standard and HD FT-IR with multimodal CARS/TPEF/SHG/FLIMS imaging in the detection of the early stage of pulmonary metastasis of murine breast cancer.</a> The Analyst. 145 (14), 4982-4990 (2020).</li><li>Tsai, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+radiofrequency-skin+interaction+using+multiphoton+microscopy+in+vivo.">Visualizing radiofrequency-skin interaction using multiphoton microscopy in vivo.</a> Journal of Dermatological Science. 65 (2), 95-101 (2012).</li><li>Wang, C. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+cutaneous+cancer+revealed+by+intravital+nonlinear+optical+microscopy.">Early development of cutaneous cancer revealed by intravital nonlinear optical microscopy.</a> Applied Physics Letters. 97 (11), 113702 (2010).</li><li>Li, F. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+skin+fold+chamber+for+high+resolution+multiphoton+imaging.">Dorsal skin fold chamber for high resolution multiphoton imaging.</a> Optical and Quantum Electronics. 37 (13), 1439-1445 (2005).</li><li>Tong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+semiconducting+and+metallic+carbon+nanotubes+in+cells+and+mice+using+transient+absorption+microscopy.">Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy.</a> Nature Nanotechnology. 7 (1), 56-61 (2011).</li><li>Chong, S., Min, W., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground-state+depletion+microscopy:+Detection+sensitivity+of+single-molecule+optical+absorption+at+room+temperature.">Ground-state depletion microscopy: Detection sensitivity of single-molecule optical absorption at room temperature.</a> The Journal of Physical Chemistry Letters. 1 (23), 3316-3322 (2010).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+absorption+microscopy+of+gold+nanorods+as+spectrally+orthogonal+labels+in+live+cells.">Transient absorption microscopy of gold nanorods as spectrally orthogonal labels in live cells.</a> Nanoscale. 6 (18), 10536-10539 (2014).</li><li>Liu, J., Irudayaraj, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-fluorescent+quantification+of+single+mRNA+with+transient+absorption+microscopy.">Non-fluorescent quantification of single mRNA with transient absorption microscopy.</a> Nanoscale. 8 (46), 19242-19248 (2016).</li><li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).</li><li>Wang, C. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+chemically+specific+mapping+of+agrochemical+seed+coatings+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">In situ chemically specific mapping of agrochemical seed coatings using stimulated Raman scattering microscopy.</a> Journal of Biophotonics. 11 (11), 201800108 (2018).</li><li>Wang, C. -. C., Yoong, F. -. Y., Penfield, S., Moger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+active+ingredients+uptake+in+seed+coats+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Visualization of active ingredients uptake in seed coats with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings SPIE 10069, Multiphoton Microscopy the Biomedical Sciences XVII. , 1006928 (2017).</li><li>Hu, F., Shi, L., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+of+chemical+bonds+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).</li><li>Zeytunyan, A., Baldacchini, T., Zadoyan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Module+for+multiphoton+high-resolution+hyperspectral+imaging+and+spectroscopy.">Module for multiphoton high-resolution hyperspectral imaging and spectroscopy.</a> Proceedings SPIE 10498, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XVIII. , 104980 (2018).</li><li>Wang, C. -. C., Wu, R. -. J., Lin, S. -. J., Chen, Y. -. F., Dong, C. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+discrimination+of+normal+and+pulmonary+cancer+tissues+using+multiphoton+fluorescence+ratiometric+microscopy.">Label-free discrimination of normal and pulmonary cancer tissues using multiphoton fluorescence ratiometric microscopy.</a> Applied Physics Letters. 97 (4), 043706 (2010).</li><li>Wang, C. -. C., Chandrappa, D., Smirnoff, N., Moger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lipid+accumulation+in+the+green+microalga+botryococcus+braunii+with+frequency-modulated+stimulated+Raman+scattering.">Monitoring lipid accumulation in the green microalga botryococcus braunii with frequency-modulated stimulated Raman scattering.</a> Proceedings SPIE 9329, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XV. , 9329 (2015).</li><li>Figueroa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadband+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+parabolic+fiber+amplifier+source.">Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source.</a> Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).</li><li>Cui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+plasmon-enhanced+CARS+and+TPEF+for+Gram+staining+identification+of+non-fluorescent+bacteria.">In situ plasmon-enhanced CARS and TPEF for Gram staining identification of non-fluorescent bacteria.</a> Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 264, 120283 (2022).</li><li>Ma, J., Sun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+optical+microscopies+(NOMs)+and+plasmon-enhanced+NOMs+for+biology+and+2D+materials.">Nonlinear optical microscopies (NOMs) and plasmon-enhanced NOMs for biology and 2D materials.</a> Nanophotonics. 9 (6), 1341-1358 (2020).</li><li>Sun, L., Chen, Y., Sun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+nonemissive+excited-state+intramolecular+proton+transfer+by+plasmon-enhanced+hyper-Raman+scattering+and+two-photon+excitation+fluorescence.">Exploring nonemissive excited-state intramolecular proton transfer by plasmon-enhanced hyper-Raman scattering and two-photon excitation fluorescence.</a> The Journal of Physical Chemistry C. 126 (1), 487-492 (2022).</li></ol>

Denne studien har presentert kombinasjonen av SF-TRU-modul og ultrafast dual-output lasersystem demonstrerte sine applikasjoner for multimodal mikrospektroskopi. Med sin evne til å undersøke gull nanopartikler '(AuNPs) opptak av kreftceller, kan den multimodale bildebehandlingsplattformen visualisere cellulære responser på hypertermiske kreftbehandlinger når laserstråler absorberes av AuNPs.
Videre oppnås rask kjemisk spesifikk avbildning og høy spektral oppløsning ved å bruke spektr...

Gull nanopartikler (AuNPs) har vist stort potensial som biokompatible bildebehandlingsprober, for eksempel som effektive overflateforbedrede Raman-spektroskopi (SERS) substrater i ulike biomedisinske applikasjoner. Store applikasjoner inkluderer felt som biosensing, bioimaging, overflateforbedrede spektroskopier og fototermisk terapi for kreftbehandling1. Videre er sondering av AuNPs i levende systemer avgjørende for å vurdere og forstå samspillet mellom AuNPs og biologiske systemer. Det finnes ulike analytiske teknikker, inkludert Fourier transform infrared (FTIR) spektroskopi2, laserablasjon induktivt koblet massespektrometri (LA-ICP-MS) 3, og magnetisk resonansavbildning (MR) 4 som har blitt brukt til å undersøke fordelingen av AuNPs i vev. Likevel lider disse metodene av flere ulemper, for eksempel å være tidkrevende og involvere kompleks prøvepreparering3, som krever lange anskaffelsestider, eller mangelen på sub-mikron romlig oppløsning 2,4.
Sammenlignet med konvensjonelle bildebehandlingsteknikker, gir ikke-lineær optisk mikroskopi flere fordeler for sondering av levende celler og AuNPs: Den ikke-lineære optiske mikroskopien oppnår dypere bildedybde og gir egen 3D optisk seksjoneringskapasitet ved bruk av nær-IR ultrafaste lasere. Med den betydelige forbedringen av bildehastighet og deteksjonsfølsomhet har to-foton eksitert fluorescens (TPEF) 5,6,7 og andre harmoniske generasjon (SHG) 8,9,10 mikroskopi vist seg å ytterligere forbedre ikke-invasiv avbildning av endogene biomolekyler i levende celler og vev. Videre er det mulig å utlede etikettfri biokjemisk kontrast av cellulære strukturer og AuNP-er ved å bruke nye ikke-lineære optiske teknikker som forbigående absorpsjon (TA)11,12,13,14 og stimulert Raman-spredning (SRS)15,16,17,18. Visualisering av AuNPs uten bruk av ekstrinsiske etiketter er av stor betydning siden kjemiske forstyrrelser av nanopartiklene vil endre deres fysiske egenskaper og dermed deres opptak i celler.
Denne protokollen presenterer implementeringen av en Spectral Focusing Timing and Recombination Unit (SF-TRU) modul for en dual-bølgelengde pulslaser, noe som muliggjør rask multimodal avbildning av AuNPs og kreftceller. Dette arbeidet tar sikte på å demonstrere detaljene i integrerte TPEF-, TA- og SRS-teknikker på et laserskanningsmikroskop.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>APE SRS Detection Unit</td>
			<td>APE (Angewandte Physik &#38; Elektronik GmbH)</td>
			<td>APE Lock-in Module</td>
			<td>Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Scanning Unit</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV 3000</td>
			<td>Confocal scanning unit used for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 &#181;m</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C37483</td>
			<td>Polystyrene microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CG15CH2</td>
			<td>22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td>Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flouview</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV31S-SW</td>
			<td>Laser scanning microscope control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>BX precision</td>
			<td>40543</td>
			<td>Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV3000</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83P2ZF</td>
			<td>Other microscope frames can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Nanoparticles</td>
			<td>Nanopartz</td>
			<td>A11-60</td>
			<td>Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Input Output Interface</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV30 ANALOG</td>
			<td>This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSight X3</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680&#8211;1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Frame</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse 4T1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2539</td>
			<td>Mouse breast cancer cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA 1.2 Water Immersion Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XW/IR</td>
			<td>The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA 1.4 Condenser</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CSC1003</td>
			<td>Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R3896</td>
			<td>PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT Connector</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13654-01-Y002</td>
			<td>Connector for PMT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Supply</td>
			<td>RS</td>
			<td>RSPD-3303 C</td>
			<td>Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10491-01</td>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SF-TRU</td>
			<td>Newport Spectra Physics</td>
			<td>SF-TRU</td>
			<td>System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biomolecular imaging of cellular uptake of nanoparticles using multimodal nonlinear optical microscopy

Sondering av gull nanopartikler (AuNPs) i levende systemer er viktig for å avsløre samspillet mellom AuNPs og biologiske vev. Videre, ved å integrere ikke-lineære optiske signaler som stimulert Raman-spredning (SRS), to-foton eksitert fluorescens (TPEF) og forbigående absorpsjon (TA) i en bildeplattform, kan den brukes til å avsløre biomolekylær kontrast av cellulære strukturer og AuNPs på en multimodal måte. Denne artikkelen presenterer en multimodal ikke-lineær optisk mikroskopi og bruker den til å utføre kjemisk spesifikk avbildning av AuNPs i kreftceller. Denne bildebehandlingsplattformen gir en ny tilnærming for å utvikle mer effektive funksjonaliserte AuNPs og avgjøre om de er innenfor vaskulaturer som omgir svulsten, pericellulære eller cellulære rom.

Spectral Focusing Timing and Recombination Unit (SF-TRU)-modulen introduseres mellom femtosekundlaseren med dobbel utgang og det modifiserte laserskanningsmikroskopet. Det justerbare ultraraske lasersystemet som brukes i denne studien har to utgangsporter som leverer en stråle ved en fast 1,045 nm bølgelengde og den andre strålen som er justerbar i området 680-1,300 nm. Et detaljert skjema av SF-TRU-modulen og multimodal bildebehandlingsplattform er avbildet i figur 1. SF-TRU brukes til ...

Watch this Scientific Journal Video about Biomolecular Imaging of Cellular Uptake of Nanoparticles using Multimodal Nonlinear Optical Microscopy at JoVE.com

Biomolecular Imaging of Cellular Uptake of Nanoparticles using Multimodal Nonlinear Optical Microscopy

Denne artikkelen presenterer integrasjonen av en spektralfokuseringsmodul og en dual-output pulslaser, som muliggjør rask hyperspektral avbildning av gull nanopartikler og kreftceller. Dette arbeidet tar sikte på å demonstrere detaljene i multimodale ikke-lineære optiske teknikker på et standard laserskanningsmikroskop.

Biomolekylær avbildning av cellulær opptak av nanopartikler ved bruk av multimodal ikke-lineær optisk mikroskopi

Probing gold nanoparticles (AuNPs) in living systems is essential to reveal the interaction between AuNPs and biological tissues. Moreover, by integrating ...

Vår protokoll presenterer en multimodal, ikke-lineær, optisk mikroskopi og bruker den til å utføre kjemisk spesifikk avbildning av gull nanopartikler i kreftceller. Den største fordelen med vårt bildesystem er at det kan brukes til å gjennomgå den biomolekylære kontrasten til cellulære strukturer og gull nanopartikler på en multimodal måte. For å begynne, slå på pluggene til alt utstyret, unntatt fjernkontrollboksen.Slå deretter på baksiden av boksen og trykk Start drift etter at fjernlyset blir blått på kontrollboksen. Etterpå slår du på PCen til laserskanningsmikroskopet og kjører programvaren for konfokalmikroskop. Kontroller deretter mikroskopets lysbane ved hjelp av dataprogramvaren og kontroller fokuset gjennom berøringsskjermen eller fjernkontrollknappene eller dataprogramvaren.Velg de ønskede bildeinnstillingene i programvaren, inkludert Zoom, Bildestørrelse i piksler og Pikseloppholdstid, samtidig som du sikrer at pikseloppholdstiden er større enn integrasjonstiden. Plasser en dråpe destillert vann på toppen av vannets nedsenkningsmål som fokuserer laserstrålene inn i prøven og mellom kondensatoren og prøven for avbildning. Juster deretter kondensatorens høyde til omtrent en millimeter over prøven for å samle den maksimale mengden lys og flytt SRS-detektoren plassert på et bevegelig feste ut av strålebanen for å fokusere på prøven ved hjelp av hvitt lys.Bruk programvareinnstillingene til å velge pumpestrålen og endre laserbølgelengden til 802 nanometer for CH-vibrasjoner og 898 nanometer for amid I-topp, og ta hensyn til store endringer i Raman-skiftet. For å oppnå små justeringer i Raman-skiftet, skann forsinkelsestrinnet i SFTRU-enheten som beskrevet i manuskriptet. For det hyperspektrale datasettet, velg Trigger-fanen, klikk på Start av ttl-utløser på, og velg deretter Utløs hver ramme.Deretter setter du tidsserien på og Z-serien av i Serie-fanen. Videre angir du antall bilder i tidsserien slik at det samsvarer med antall trinn i minibankprogramvaren. Deretter går du til Kjør-fanen i minibankprogramvaren og angir forsinkelsestrinnsposisjonene for CH til 90,25 og 92,25, mens for amid I-regionen er 89 og 91 i millimeter, tilsvarende start- og stoppposisjonen til hyperspektralskanningen, samtidig som du sikrer at antall trinn samsvarer med antall bilder i dataprogramvaren.Etter å ha sjekket de riktige innstillingene, start hyperspektralstakken i dataprogramvaren ved først å gå til Erverv og deretter klikke på Start skanning. Deretter klikker du på Start i minibankprogramvaren, som starter samlingen av en serie bilder med inkrementelle økninger i forsinkelsestrinnsposisjonen mellom de valgte start- og stoppposisjonene. Ta deretter en tidsserie med bilder på forskjellige forsinkelsesfaseposisjoner for å generere en hyperspektral skanning.Bruk den analoge enheten til å sende og motta ttl-signaler til og fra SFTRU-systemet for å synkronisere bildeopptak og bevegelse av forsinkelsestrinnet. For å bytte mellom avbildning i CH-vibrasjonsområdet til amide I-vibrasjonsområdet, endre pumpebølgelengden i laserprogramvaren fra 802 nanometer til 898 nanometer. Videre endrer du Stokes-spredningsinnstillingen i minibankprogramvaren fra 30 millimeter til 5 millimeter.Juster den nedre knappen på speilfestet for å gjøre en liten justering av speilet i pumpestrålespredningsveien inne i SFTRU-boksen ved å endre speilvinkelen med en trinnvis mengde. For å validere den kjemiske selektiviteten til polystyrenmikrosfærene, ble hyperspektral stimulert Raman-spredning og spontane Raman-spektra registrert. Spektrene var identiske bortsett fra forskjellen observert i relativ intensitet.Den stimulerte Raman-spredningsavbildningen av 4T1 kreftceller ble utført ved 2, 852, 2, 930 og 2.968 bølgetall, tilsvarende karbon-hydrogen-strekkende vibrasjonsbånd av lipid-, protein- og DNA-biomolekyler. Multimodal avbildning av 4T1 kreftceller dosert med gull nanopartikler ble utført for å undersøke nanopartikkelfordelingene i kreftceller. De oppkjøpte stimulerte Raman-spredningsbildene ble oppnådd for CH2- og CH3-kanal, LysoTracker-fluorescerende sonder og off-resonansstimulert Raman-spredningskanal.Det viktigste å huske er å endre vibrasjonsområdet, pumpereferansen, i laserprogramvaren og også Stokes dispersjonsinnstilling under protokollen. Dette systemet kan enkelt byttes fra femtosekund til picosekundregion uten å påvirke optisk justering. Denne muligheten tillater oss å utføre multiphoton sammenhengende Raman spredning og pumpe sonde spektroskopi og deres applikasjoner.Denne multimodale bildebehandlingsplattformen gir ny innsikt i nanomedisin og baner vei for molekylær avbildning av celler, vev og gull nanopartikler.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

Kvantitativ Optisk mikroskopi: Måling av Cellular Biofysisk Funksjoner med en standard optisk mikroskop

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Utarbeidelse av Mica Støttet Lipid bilayers for High Resolution Optical Mikros Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescens-slukking av en Liposomalinnkapslet Nær-infrarød fluoroforen som et verktøy for<em&gt; I Vivo</em&gt; Optisk Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Biofunctionalized Prussian Blue Nanopartikler for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

Samsvarende lys- og elektronmikroskopi Bruke Quantum Dot Nanopartikler

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

Målrettet plasmamembran Levering av en hydrofob Cargo innkapslet i en Liquid Crystal partikler Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

Langsiktig Live bildeenheten forbedret eksperimentelle manipulering av sebrafisk larver

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...