Name: application of rna interference in the pinewood nematode, bursaphelenchus xylophilus
Uploaded: 2022-03-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus at JoVE.com

Denne forskning blev finansieret af National Natural Science Foundation of China (31870637, 31200487) og finansieret i fællesskab af Zhejiang Key Research Plan (2019C02024, LGN22C160004).

Undersøgelsen blev godkendt af rådet for dyreforsøg ved Zhejiang Agricultural &forestry university. B. xylophilus-isolatet NXY61 blev oprindeligt ekstraheret fra en syg Pinus massoniana i Ningbo-området i Zhejiang-provinsen, Kina11.
1. Kloning af gen
BEMÆRK: Se materialetabellen for detaljer om de primere, der anvendes i denne protokol.
<ol><li>Saml nematoder.<ol><li>B. xylophilus...

<ol>
	<li>Nicol, J. M., Jones, J., Gheysen, G., Fenoll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+nematode+threats+to+world+agriculture.">Current nematode threats to world agriculture.</a> Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions. , 21-43 (2011).</li><li>Jones, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+plant-parasitic+nematodes+in+molecular+plant+pathology.">Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 14 (9), 946-961 (2013).</li><li>Kikuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+insights+into+the+origin+of+parasitism+in+the+emerging+plant+pathogen+Bursaphelenchus+xylophilus.">Genomic insights into the origin of parasitism in the emerging plant pathogen Bursaphelenchus xylophilus.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002219 (2011).</li><li>Megen, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phylogenetic+tree+of+nematodes+based+on+about+1200+full-length+small+subunit+ribosomal+DNA+sequences.">A phylogenetic tree of nematodes based on about 1200 full-length small subunit ribosomal DNA sequences.</a> Nematology. 11 (6), 927-950 (2009).</li><li>Niu, J. H., Jian, H., Xu, J. M., Guo, Y. D., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+technology+extends+its+reach:+Engineering+plant+resistance+against+harmful+eukaryotes.">RNAi technology extends its reach: Engineering plant resistance against harmful eukaryotes.</a> African Journal of Biotechnology. 9 (45), 7573-7582 (2010).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 91 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Shahid, M., Imran, A., Mazhar, H., Yusuf, Z., Rob, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+novel+traits+in+plants+through+RNA+interference.">Engineering novel traits in plants through RNA interference.</a> Trends in Plant Science. 11 (11), 559-565 (2006).</li><li>Marmonier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+acquisition+of+specific+small+interfering+RNAs+inhibits+the+expression+of+some+target+genes+in+the+plant+ectoparasite+Xiphinema+index.">In vitro acquisition of specific small interfering RNAs inhibits the expression of some target genes in the plant ectoparasite Xiphinema index.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3266 (2019).</li><li>Iqbal, S., Fosu-Nyarko, J., Jones, M. G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attempt+to+silence+genes+of+the+RNAi+pathways+of+the+root-knot+nematode,+Meloidogyne+incognita+results+in+diverse+responses+including+increase+and+no+change+in+expression+of+some+genes.">Attempt to silence genes of the RNAi pathways of the root-knot nematode, Meloidogyne incognita results in diverse responses including increase and no change in expression of some genes.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 328 (2020).</li><li>Zhou, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+and+functional+analysis+of+akt-1+in+pinewood+nematode,+Bursaphelenchus+xylophilus.">Molecular characterization and functional analysis of akt-1 in pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Forest Pathology. 51 (1), 12647 (2021).</li><li>Zhou, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mab-3+in+spermatogenesis+and+ontogenesis+of+pinewood+nematode,+Bursaphelenchus+xylophilus.">The role of mab-3 in spermatogenesis and ontogenesis of pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Pest Management Science. 77 (1), 138-147 (2021).</li><li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bxy-fuca+encoding+&#945;-L-fucosidase+plays+crucial+roles+in+development+and+reproduction+of+the+pathogenic+pinewood+nematode,+Bursaphelenchus+xylophilus.">Bxy-fuca encoding &#945;-L-fucosidase plays crucial roles in development and reproduction of the pathogenic pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Pest Management Science. 76 (1), 205-214 (2020).</li><li>Wang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+and+functional+analysis+of+daf-8+in+the+pinewood+nematode,+Bursaphelenchus+xylophilus.">Molecular characterization and functional analysis of daf-8 in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Journal of Forestry Research. , (2021).</li><li>Viglierchio, D. R., Schmitt, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+methodology+of+nematode+extraction+from+field+samples:+Baermann+funnel+modifications.">On the methodology of nematode extraction from field samples: Baermann funnel modifications.</a> Journal of Nematology. 15 (3), 438-444 (1983).</li><li>Zhu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+and+quantification+of+mating+behavior+in+the+pinewood+nematode,+Bursaphelenchus+xylophilus.">Observation and quantification of mating behavior in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54842 (2016).</li><li>Zhou, L. F., Chen, F. M., Ye, J. R., Pan, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+reliable+reference+genes+for+RT-qPCR+analysis+of+Bursaphelenchus+mucronatus+gene+expression+from+different+habitats+and+developmental+stages.">Selection of reliable reference genes for RT-qPCR analysis of Bursaphelenchus mucronatus gene expression from different habitats and developmental stages.</a> Frontiers in Genetics. 9, 269-279 (2018).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA-mediated+interference+of+dumpy+genes+in+Bursaphelenchus+xylophilus+by+feeding+on+filamentous+fungal+transformants.">Double-stranded RNA-mediated interference of dumpy genes in Bursaphelenchus xylophilus by feeding on filamentous fungal transformants.</a> International Journal for Parasitology. 46 (5-6), 351-360 (2016).</li><li>Ma, H. B., Lu, Q., Liang, J., Zhang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+cellulose+gene+of+the+pine+wood+nematode,+Bursaphelenchus+xylophilus,+using+RNA+interference.">Functional analysis of the cellulose gene of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, using RNA interference.</a> Genetics and Molecular Research: GMR. 10 (3), 1931-1941 (2011).</li><li>Cheng, X. Y., Dai, S. M., Xiao, L., Xie, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cellulase+gene+knock+down+by+dsRNA+interference+on+the+development+and+reproduction+of+the+pine+wood+nematode,+Bursaphelenchus+xylophilus.">Influence of cellulase gene knock down by dsRNA interference on the development and reproduction of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Nematology. 12 (12), 225-233 (2010).</li><li>Xue, Q., Wu, X. Q., Zhang, W. J., Deng, L. N., Wu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+L-like+cysteine+proteinase+genes+are+associated+with+the+development+and+pathogenicity+of+pine+wood+nematode,+Bursaphelenchus+xylophilus.">Cathepsin L-like cysteine proteinase genes are associated with the development and pathogenicity of pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), 215 (2019).</li><li>Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+in+C.+elegans:+Soaking+in+the+genome+sequence.">RNAi in C. elegans: Soaking in the genome sequence.</a> Science. 282 (5388), 430-431 (1998).</li><li>Urwin, P. E., Lilley, C. J., Atkinson, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+double-stranded+RNA+by+pre+parasitic+juvenile+cyst+nematodes+leads+to+RNA+interference.">Ingestion of double-stranded RNA by pre parasitic juvenile cyst nematodes leads to RNA interference.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 15 (8), 747-752 (2002).</li><li>Bakhetia, M., Charlton, W., Atkinson, H. J., McPherson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+of+dual+oxidase+in+the+plant+nematode+Meloidogyne+incognita.">RNA interference of dual oxidase in the plant nematode Meloidogyne incognita.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (10), 1099-1106 (2005).</li><li>Rosso, M. N., Dubrana, M. P., Cimbolini, N., Jaubert, S., Abad, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+RNA+interference+to+root-knot+nematode+genes+encoding+esophageal+gland+proteins.">Application of RNA interference to root-knot nematode genes encoding esophageal gland proteins.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 615-620 (2005).</li><li>Chen, Q., Rehman, S., Smant, G., Jones, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+pathogenicity+proteins+of+the+potato+cyst+nematode+Globodera+rostochiensis+using+RNAi.">Functional analysis of pathogenicity proteins of the potato cyst nematode Globodera rostochiensis using RNAi.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 621-625 (2005).</li><li>Wang, D. D., Li, Y., Li, J., Xie, B. Y., Chen, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+clone+and+its+RNAi+interference+effect+analysis+of+mapk+gene+in+Bursaphelenchus+xylophilus+(+in+Chinese).">Molecular clone and its RNAi interference effect analysis of mapk gene in Bursaphelenchus xylophilus ( in Chinese).</a> Acta Phytopathologica Sinica. 46 (5), 662-669 (2016).</li><li>Qiu, X., Wu, X., Huang, L., Ye, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Bxpel1+gene+silencing+by+dsRNA+interference+on+the+development+and+pathogenicity+of+the+pine+wood+nematode,+Bursaphelenchus+xylophilus.">Influence of Bxpel1 gene silencing by dsRNA interference on the development and pathogenicity of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 125 (2016).</li><li>Dulovic, A., Streit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-mediated+knockdown+of+daf-12+in+the+model+parasitic+nematode+Strongyloides+ratti.">RNAi-mediated knockdown of daf-12 in the model parasitic nematode Strongyloides ratti.</a> PLoS Pathogens. 15 (3), 1007705 (2019).</li><li>Li, L., Zhao, H., Cui, Y., Wei, H., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+of+gene+editing+technology.">Research progress of gene editing technology.</a> Life Science Research. 21 (3), 268-274 (2017).</li><li>Bindhya, C. Y., Karuppannan, V., Kuppuswamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-generated+double+stranded+RNA+induces+RNAi+in+plant-parasitic+nematodes+and+protects+the+host+from+infection.">Host-generated double stranded RNA induces RNAi in plant-parasitic nematodes and protects the host from infection.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 148 (2), 219-222 (2006).</li><li>Jiang, Z., Sher, A. K., David, G. H., Ralph, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+insect-resistant+plants:+RNAi-mediated+crop+protection.">Next-generation insect-resistant plants: RNAi-mediated crop protection.</a> Trends in Biotechnology. 35 (9), 871-882 (2017).</li></ol>

Selvom livshistorien og det parasitære miljø af B. xylophilus er forskellige fra andre nematoder, har der været begrænset forskning på den molekylære patogenese af dette plantepatogen. På trods af store fremskridt med anvendelsen af CRISPR/Cas9 genomredigeringsteknologi i C. elegans og andre nematoder er kun RNAi-teknologi anvendt på B. xylophilus blevet offentliggjort til dato17. RNAi er et af de mest kraftfulde værktøjer til rådighed til at studere genfunkti...

Planteparasitiske nematoder (PPN'er) er en fortsat trussel mod fødevaresikkerheden og skovøkosystemerne. De forårsager anslået 100 milliarder USD i økonomiske tab hvert år1, hvoraf de mest problematiske primært er rodknude nematoder, cyste nematoder og fyrretræ nematoder. Pinewood nematoden, Bursaphelenchus xylophilus, er en vandrende, endoparasitisk nematode, som er årsagspatogenet for pine wilt disease2. Det har forårsaget stor skade på fyrreskove over hele verden3. Ved hjælp af terminologien i Van Megen et al.4 er B. xylophilus medlem af Parasitaphelenchidae og tilhører klade 10, mens de fleste andre større planteparasitter tilhører klade 12.
Som en uafhængig og nyligt udviklet planteparasit er B. xylophilus en attraktiv model for sammenlignende undersøgelser. Til dato har der været betydelig forskning på rodknude nematoder og cyste nematoder tilhørende klade 12, som er obligatoriske, stillesiddende endoparasitter og er nogle af de mest intenst studerede nematoder. At udføre yderligere forskning på dette vigtige område kommer imidlertid med en stor udfordring: funktionen af parasitismegener er en forskningsflaskehals. Funktionelle undersøgelser omfatter generelt ektopisk ekspression og knockdown / out eksperimenter, men er afhængige af effektive genetiske transformationsprotokoller for nematoden. Som følge heraf er omvendt genetik i PPN'er næsten udelukkende afhængig af genhæmning af RNAi.
RNAi, en mekanisme, der er bredt til stede i eukaryote celler, dæmper genekspression ved at indføre dobbeltstrenget RNA (dsRNA)5. Til dato er den posttranskriptionelle genhæmningsmekanisme induceret af dsRNA fundet i alle studerede eukaryoter, og RNAi-teknologi, som et værktøj til funktionel genomforskning og andre applikationer, har udviklet sig hurtigt i mange organismer. Siden opdagelsen af RNAi-maskineriet i Caenorhabditis elegans i 19986 er RNAi-teknikker blevet effektive metoder til at identificere nematoders genfunktion og foreslås som en ny måde til effektivt at kontrollere patogene nematoder7.
RNAi er teknisk letkøbt at blødgøre de unge i dsRNA kan være tilstrækkeligt; Effektiviteten og reproducerbarheden af denne tilgang varierer imidlertid meget med nematodearten og målgenet8. Hæmning af 20 gener involveret i RNAi-veje i rodknude nematoden, Meloidogyne incognita, blev undersøgt ved hjælp af lange dsRNA'er som udløsere, hvilket resulterede i forskellige reaktioner, herunder en stigning og ingen ændring i ekspressionen af nogle gener9. Disse resultater viser, at målgener kan reagere forskelligt på RNAi knockdown, hvilket nødvendiggør en udtømmende vurdering af deres egnethed som mål for nematodekontrol via RNAi. Imidlertid er der i øjeblikket en mangel på forskning om udviklings- og reproduktionsbiologi af B. xylophilus.
Som en fortsættelse af tidligere arbejde 10,11,12,13 beskriver vi her en protokol til anvendelse af RNAi til at studere funktionen af ppm-1-genet af B. xylophilus, herunder syntesen af dsRNA, syntetisk neurostimulerende blødgøring og kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) detektion. Den viden, der opnås fra denne eksperimentelle tilgang, vil sandsynligvis bidrage markant til at forstå grundlæggende biologiske systemer og forebygge pine wilt sygdom.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Baermann funnel</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>to isolate nematodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beacon Designer 7.9</td>
			<td>Shanghai kangyusheng information technology co.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>to design qPCR primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Botrytis cinerea</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>as food for nematodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bursaphelenchus xylophilus</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>its number was NXY61 and was it was originally extracted from diseased 
			Pinus massoniana in Ningbo, Zhejiang province, China.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>constant temperature incubator</td>
			<td>Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.</td>
			<td>H1703544</td>
			<td>to cultur nematodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1704466</td>
			<td>to achieve electrophoretic analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 75%</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>80176961</td>
			<td>to extract RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq Polymerase Premix</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR030A</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq Polymerase Premix</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR390A</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td>LongGene Scientific Instruments Co.</td>
			<td>LG2020</td>
			<td>to make nucleic acid bands visible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>n/a</td>
			<td>to analyze the data and make figurs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Centrifuge</td>
			<td>Hangzhou Allsheng Instruments Co.</td>
			<td>AS0813000</td>
			<td>centrifug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-flux tissue grinder</td>
			<td>Bertin</td>
			<td></td>
			<td>to extract RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>n/a</td>
			<td>to measure the body lengths</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl alcohol</td>
			<td>Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.</td>
			<td>L1909022</td>
			<td>to extract RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM4B microscope</td>
			<td>Leica Microsystems Inc.</td>
			<td></td>
			<td>to observe nematodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic beads</td>
			<td>Aoran science technology co.</td>
			<td>150010C</td>
			<td>to extract RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>AM1333</td>
			<td>to synthesize dsRNA in vitro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-2000 spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>NanoDrop 2000/2000C</td>
			<td>to analyze the quality of the dsRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Amplifier</td>
			<td>Bio-Rad Life Medical Products Co.</td>
			<td>1851148</td>
			<td>to amplify nucleic acid sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>to cultur nematodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEM-T Easy vector</td>
			<td>Promega Corporation</td>
			<td>A1360</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (Medium)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>to cultur Botrytis cinerea</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR047B</td>
			<td>to synthetic cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Premier 5.0</td>
			<td>PREMIER Biosoft</td>
			<td>n/a</td>
			<td>to design PCR primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primers:ppm-1-F/R</td>
			<td>Tsingke Biotechnology Co.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>F: 5&#39;-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3&#39;; R: 5&#39;- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>q-ppm-1-F/R</td>
			<td>Tsingke Biotechnology Co.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>F: 5&#39;-CATCCGAATGGCAATACAG-3&#39;; R: 5&#39;-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time thermal cycler&#160;qTOWER 2.2</td>
			<td>Analytique Jena Instruments (Beijing) Co.</td>
			<td></td>
			<td>for qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shaking table</td>
			<td>Shanghai Zhicheng analytical instrument manufacturing co.</td>
			<td></td>
			<td>to soak nematodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereoscopic microscope</td>
			<td>Chongqing Optec Instrument Co.</td>
			<td>1814120</td>
			<td>to observe nematodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7-GFP-F/R</td>
			<td>Tsingke Biotechnology Co.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>F: 5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGGAAA 
			GGAGAAGAACTTTTCAC-3&#39;; R: 5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGGCTG 
			TTACAAACTCAAGAAGG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;T7 promoter</td>
			<td>Tsingke Biotechnology Co.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>TAATACGACTCACTATAGGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>9762</td>
			<td>to recover DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR820A</td>
			<td>for qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trichloroethane</td>
			<td>Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co.</td>
			<td></td>
			<td>to extract RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>15596026</td>
			<td>total RNA extraction reagent,to extract RNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of rna interference in the pinewood nematode, bursaphelenchus xylophilus

Fyrretræsnematoden, Bursaphelenchus xylophilus, er en af de mest destruktive invasive arter på verdensplan, der forårsager visning og eventuel død af fyrretræer. På trods af anerkendelsen af deres økonomiske og miljømæssige betydning har det hidtil været umuligt at studere de detaljerede genfunktioner af planteparasitiske nematoder (PPN'er) ved hjælp af konventionel fremadrettet genetik og transgene metoder. Som en omvendt genetikteknologi letter RNA-interferens (RNAi) imidlertid undersøgelsen af de funktionelle gener af nematoder, herunder B. xylophilus. 
Dette papir skitserer en ny protokol for RNAi af ppm-1-genet i B. xylophilus, som er blevet rapporteret at spille afgørende roller i udviklingen og reproduktionen af andre patogene nematoder. For RNAi var T7-promotoren forbundet med 5′-terminalen af målfragmentet ved polymerasekædereaktion (PCR), og dobbeltstrenget RNA (dsRNA) blev syntetiseret ved in vitro-transkription . Efterfølgende blev dsRNA-levering opnået ved at blødgøre nematoderne i en dsRNA-opløsning blandet med syntetiske neurostimulerende midler. Synkroniserede unge b . xylophilus (ca. 20.000 individer) blev vasket og gennemblødt i dsRNA (0,8 μg/ml) i blødgøringsbufferen i 24 timer i mørke ved 25 °C.
Den samme mængde nematoder blev anbragt i en blødgøringsbuffer uden dsRNA som en kontrol. I mellemtiden blev en anden identisk mængde nematoder anbragt i en blødgøringsbuffer med grønt fluorescerende protein (gfp) gen dsRNA som en kontrol. Efter blødgøring blev ekspressionsniveauet for måludskrifterne bestemt ved hjælp af kvantitativ PCR i realtid. Virkningerne af RNAi blev derefter bekræftet ved hjælp af mikroskopisk observation af fænotyperne og en sammenligning af kropsstørrelsen hos de voksne blandt grupperne. Den nuværende protokol kan hjælpe med at fremme forskning for bedre at forstå funktionerne i generne af B. xylophilus og andre parasitære nematoder mod udvikling af kontrolstrategier gennem genteknologi.

Analyse af ppm-1 ekspression af B. xylophilus efter RNAi Det relative ekspressionsniveau for ppm-1-genet af B. xylophilus gennemblødt med GFP dsRNA og det gennemblødt med målgenet dsRNA var henholdsvis 0,92 og 0,52 ( ppm-1-genekspressionsniveauet for den ddH2O-behandlede kontrolgruppe blev indstillet til 1) (figur 1). Eksogent dsRNA har således i...

Watch this Scientific Journal Video about Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus at JoVE.com

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Her introducerer vi en detaljeret blødgøringsmetode for RNA-interferens i Bursaphelenchus xylophilus for at lette undersøgelsen af genfunktioner.

Anvendelse af RNA-interferens i Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of ...

RNAi er blevet en effektiv metode til at identificere funktionen af gener i nematoder og foreslås som en ny måde at effektivt kontrollere patogene nematoder på. RNAi er blødning nematoder i dsRNA kan være tilstrækkelig til proceduren. Til at begynde med skal du samle nematoderne ved hjælp af Baermann-tragtmetoden.Til dette skal du placere et fastspændt gummirør under en tragt og placere to lag filterpapir i tragtens munding. Overfør Botrytis cinerea svampekulturer til tragten og tilsæt vand for at nedsænke svampemåtten. Når nematoder opsamles, tilsættes 500 mikroliter ekstraktionsreagens og 100 mikroliter magnetiske perler til et to milliliter centrifugerør.Aspirer 20 mikroliter af nematoderne og slib prøverne ved 9.000 x g i 30 sekunder. Inkuberes i fem minutter og centrifuge ved 12.000 x g i 10 minutter ved fire grader Celsius. Overfør supernatanten til et frisk centrifugerør.Tilsæt 100 mikroliter chloroform og bland ved at vende røret flere gange. Inkuberes i tre minutter og centrifugeres derefter ved 12.000 x g i 10 minutter ved fire grader Celsius. Overfør igen supernatanten til et frisk centrifugerør.Tilsæt 250 mikroliter isopropylalkohol og hvirvel kraftigt. Centrifuge ved 12.000 x g i 10 minutter og hvirvel. Kassér supernatanten og tilsæt 500 mikroliter 75% ethanol for at vaske RNA'et.Hvirvel prøven efterfulgt af centrifugering ved 12.000 x g i fem minutter ved fire grader Celsius. Lufttør RNA-pelleten i fem minutter og suspenderer den i 30 mikroliter RNasefrit vand. Beregn RNA-koncentrationen ved hjælp af denne formel og beregn A260 til A280-forholdet.Brug derefter et par primere til at forstærke den delvise kodningssekvens af BX ppm-1-genet fra B.xylophilus. Klon derefter ppm-1 et gensekvenser i en pGEM-T Easy vektor indeholdende T7-promotoren. Gendan 894 basepar langt ppm-1 genfragment ved at bruge det klonede plasmid som skabelon for pcr.Brug derefter et in vitro-transkriptionssæt til at syntetisere dsRNA. Analyser kvaliteten af dsRNA'et ved hjælp af et spektrofotometer og visualiser produkterne på en 1% agarosegel. Tilsæt fire mikroliter 5X blødgøringsbuffer og fyld volumenet op til 20 mikroliter med dobbelt destilleret vand for at få en endelig RNA-koncentration på 0,8 mikrogram pr. Milliliter.Læg derefter nematoderne i skålen i 30 minutter og vent på, at æggene klæber til bunden. Fjern forsigtigt vandet og nematoderne uden at forstyrre æggene, indtil kun æggene forbliver i skålen. Klække de indsamlede æg i mørket ved 25 grader Celsius i 24 timer for at opnå J2 larver.Saml larverne i et rør og vask dem tre gange med dobbeltdestilleret vand. Overfør derefter larverne til røret, der indeholder dsRNA-opløsningen. Til dette tilsættes resorcinolopløsning for at få en 1% opløsning.Placer larverne på et rystebord for at sikre tilstrækkelig absorption af dsRNA i larverne. Til kontrol blødlægges den samme mængde nematoder i blødgøringsbufferen uden dsRNA-sonden eller med en GFP dsRNA-sonde. Udfør en qPCR ved hjælp af actB- og tbb-2-generne som interne referencer for at evaluere ændringerne i genekspressionsniveauet.Brug delta delta Ct-metoden til at estimere det relative genekspressionsniveau ud fra opløsningskurven og Ct-værdien. Efter RNAi dyrkes J2-larverne indtil voksenalderen på Botrytis cinerea-græsplæner på PDA-plader. Saml de voksne ved hjælp af Baermann-tragtmetoden som vist i afsnit et.Anskaf billeder af de voksne nematoder under et mikroskop og brug ImageJ-softwaren til at måle kropslængden på 50 mandlige og 50 kvindelige nematoder. Analyser dataene ved at beregne middel- og standardafvigelsen for hver prøve. Anvend Student's t test for at sammenligne midlerne til prøverne fra de forskellige grupper.Relativ genekspressionsanalyse efter RNAi viste, at ppm-1 dsRNA effektivt kan hæmme ekspressionen af ppm-1 et gen af B.Xylophilus. Mens eksogen GFP dsRNA ikke havde nogen effekt på ppm-1-ekspressionen. Efter RNAi faldt størrelsen af de voksne markant på trods af at de opnåede seksuel modenhed, hvilket resulterede i den lille kropsstørrelse mutante fænotype.Den gennemsnitlige kropslængde for de mutante hunner og hanner var 544 og 526 mikrometer sammenlignet med 971 og 912 mikrometer for kontrolgruppen Det vigtigste er at overføre nematoderne til dobbeltstrenget RNA-opløsning og tilføje et andet reagens for at stimulere nematoderne til at fodre. Denne metode er velegnet til storskala genskærm og er almindeligt anvendt i celleforskning. At studere genfunktionen af B.Xylophilus ved denne metode har vejledende værdi for den biologiske bekæmpelse af B.Xylophilus.

Research

JoVE Journal

Biology

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transskription og lukning af Gaussia luciferase-mRNA Efterfulgt af HeLa Celletransfektion

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Chromatin Isolering af RNA Oprensning (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Brug af RNA-medieret Interferens fodringsstrategien at screene for gener involveret i Body Size forordning i Nematode<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

Larve RNA-interferens i Den Røde rismelbille,<em&gt; Tribolium castaneum</em

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Observation og Kvantificering af parringsadfærd i fyrretræsnematoden,<em&gt; Bursaphelenchus xylophilus</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

Praktisk brug af RNA-interferens: Oral levering af dobbelt-strenget RNA i Liposom bærere af kakerlakker

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: Celle-Type-specifikke Epigenome profilering

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

Identifikation af alternativ splejsning og polyadenylering i RNA-seq-data

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...