Name: application of rna interference in the pinewood nematode, bursaphelenchus xylophilus
Uploaded: 2022-03-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus at JoVE.com

Questa ricerca è stata finanziata dalla National Natural Science Foundation of China (31870637, 31200487) e finanziata congiuntamente dal Zhejiang Key Research Plan (2019C02024, LGN22C160004).

Lo studio è stato approvato dal consiglio per la sperimentazione animale della Zhejiang Agricultural & Forestry University. L'isolato di B. xylophilus NXY61 è stato originariamente estratto da un Pinus massoniana malato nell'area di Ningbo della provincia di Zhejiang, Cina11.
1. Clonazione genica
NOTA: Vedere la tabella dei materiali per i dettagli sui primer utilizzati in questo protocollo....

<ol>
	<li>Nicol, J. M., Jones, J., Gheysen, G., Fenoll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+nematode+threats+to+world+agriculture.">Current nematode threats to world agriculture.</a> Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions. , 21-43 (2011).</li><li>Jones, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+plant-parasitic+nematodes+in+molecular+plant+pathology.">Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 14 (9), 946-961 (2013).</li><li>Kikuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+insights+into+the+origin+of+parasitism+in+the+emerging+plant+pathogen+Bursaphelenchus+xylophilus.">Genomic insights into the origin of parasitism in the emerging plant pathogen Bursaphelenchus xylophilus.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002219 (2011).</li><li>Megen, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phylogenetic+tree+of+nematodes+based+on+about+1200+full-length+small+subunit+ribosomal+DNA+sequences.">A phylogenetic tree of nematodes based on about 1200 full-length small subunit ribosomal DNA sequences.</a> Nematology. 11 (6), 927-950 (2009).</li><li>Niu, J. H., Jian, H., Xu, J. M., Guo, Y. D., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+technology+extends+its+reach:+Engineering+plant+resistance+against+harmful+eukaryotes.">RNAi technology extends its reach: Engineering plant resistance against harmful eukaryotes.</a> African Journal of Biotechnology. 9 (45), 7573-7582 (2010).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 91 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Shahid, M., Imran, A., Mazhar, H., Yusuf, Z., Rob, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+novel+traits+in+plants+through+RNA+interference.">Engineering novel traits in plants through RNA interference.</a> Trends in Plant Science. 11 (11), 559-565 (2006).</li><li>Marmonier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+acquisition+of+specific+small+interfering+RNAs+inhibits+the+expression+of+some+target+genes+in+the+plant+ectoparasite+Xiphinema+index.">In vitro acquisition of specific small interfering RNAs inhibits the expression of some target genes in the plant ectoparasite Xiphinema index.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3266 (2019).</li><li>Iqbal, S., Fosu-Nyarko, J., Jones, M. G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attempt+to+silence+genes+of+the+RNAi+pathways+of+the+root-knot+nematode,+Meloidogyne+incognita+results+in+diverse+responses+including+increase+and+no+change+in+expression+of+some+genes.">Attempt to silence genes of the RNAi pathways of the root-knot nematode, Meloidogyne incognita results in diverse responses including increase and no change in expression of some genes.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 328 (2020).</li><li>Zhou, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+and+functional+analysis+of+akt-1+in+pinewood+nematode,+Bursaphelenchus+xylophilus.">Molecular characterization and functional analysis of akt-1 in pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Forest Pathology. 51 (1), 12647 (2021).</li><li>Zhou, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mab-3+in+spermatogenesis+and+ontogenesis+of+pinewood+nematode,+Bursaphelenchus+xylophilus.">The role of mab-3 in spermatogenesis and ontogenesis of pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Pest Management Science. 77 (1), 138-147 (2021).</li><li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bxy-fuca+encoding+&#945;-L-fucosidase+plays+crucial+roles+in+development+and+reproduction+of+the+pathogenic+pinewood+nematode,+Bursaphelenchus+xylophilus.">Bxy-fuca encoding &#945;-L-fucosidase plays crucial roles in development and reproduction of the pathogenic pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Pest Management Science. 76 (1), 205-214 (2020).</li><li>Wang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+and+functional+analysis+of+daf-8+in+the+pinewood+nematode,+Bursaphelenchus+xylophilus.">Molecular characterization and functional analysis of daf-8 in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Journal of Forestry Research. , (2021).</li><li>Viglierchio, D. R., Schmitt, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+methodology+of+nematode+extraction+from+field+samples:+Baermann+funnel+modifications.">On the methodology of nematode extraction from field samples: Baermann funnel modifications.</a> Journal of Nematology. 15 (3), 438-444 (1983).</li><li>Zhu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+and+quantification+of+mating+behavior+in+the+pinewood+nematode,+Bursaphelenchus+xylophilus.">Observation and quantification of mating behavior in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54842 (2016).</li><li>Zhou, L. F., Chen, F. M., Ye, J. R., Pan, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+reliable+reference+genes+for+RT-qPCR+analysis+of+Bursaphelenchus+mucronatus+gene+expression+from+different+habitats+and+developmental+stages.">Selection of reliable reference genes for RT-qPCR analysis of Bursaphelenchus mucronatus gene expression from different habitats and developmental stages.</a> Frontiers in Genetics. 9, 269-279 (2018).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA-mediated+interference+of+dumpy+genes+in+Bursaphelenchus+xylophilus+by+feeding+on+filamentous+fungal+transformants.">Double-stranded RNA-mediated interference of dumpy genes in Bursaphelenchus xylophilus by feeding on filamentous fungal transformants.</a> International Journal for Parasitology. 46 (5-6), 351-360 (2016).</li><li>Ma, H. B., Lu, Q., Liang, J., Zhang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+cellulose+gene+of+the+pine+wood+nematode,+Bursaphelenchus+xylophilus,+using+RNA+interference.">Functional analysis of the cellulose gene of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, using RNA interference.</a> Genetics and Molecular Research: GMR. 10 (3), 1931-1941 (2011).</li><li>Cheng, X. Y., Dai, S. M., Xiao, L., Xie, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cellulase+gene+knock+down+by+dsRNA+interference+on+the+development+and+reproduction+of+the+pine+wood+nematode,+Bursaphelenchus+xylophilus.">Influence of cellulase gene knock down by dsRNA interference on the development and reproduction of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Nematology. 12 (12), 225-233 (2010).</li><li>Xue, Q., Wu, X. Q., Zhang, W. J., Deng, L. N., Wu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+L-like+cysteine+proteinase+genes+are+associated+with+the+development+and+pathogenicity+of+pine+wood+nematode,+Bursaphelenchus+xylophilus.">Cathepsin L-like cysteine proteinase genes are associated with the development and pathogenicity of pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), 215 (2019).</li><li>Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+in+C.+elegans:+Soaking+in+the+genome+sequence.">RNAi in C. elegans: Soaking in the genome sequence.</a> Science. 282 (5388), 430-431 (1998).</li><li>Urwin, P. E., Lilley, C. J., Atkinson, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+double-stranded+RNA+by+pre+parasitic+juvenile+cyst+nematodes+leads+to+RNA+interference.">Ingestion of double-stranded RNA by pre parasitic juvenile cyst nematodes leads to RNA interference.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 15 (8), 747-752 (2002).</li><li>Bakhetia, M., Charlton, W., Atkinson, H. J., McPherson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+of+dual+oxidase+in+the+plant+nematode+Meloidogyne+incognita.">RNA interference of dual oxidase in the plant nematode Meloidogyne incognita.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (10), 1099-1106 (2005).</li><li>Rosso, M. N., Dubrana, M. P., Cimbolini, N., Jaubert, S., Abad, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+RNA+interference+to+root-knot+nematode+genes+encoding+esophageal+gland+proteins.">Application of RNA interference to root-knot nematode genes encoding esophageal gland proteins.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 615-620 (2005).</li><li>Chen, Q., Rehman, S., Smant, G., Jones, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+pathogenicity+proteins+of+the+potato+cyst+nematode+Globodera+rostochiensis+using+RNAi.">Functional analysis of pathogenicity proteins of the potato cyst nematode Globodera rostochiensis using RNAi.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 621-625 (2005).</li><li>Wang, D. D., Li, Y., Li, J., Xie, B. Y., Chen, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+clone+and+its+RNAi+interference+effect+analysis+of+mapk+gene+in+Bursaphelenchus+xylophilus+(+in+Chinese).">Molecular clone and its RNAi interference effect analysis of mapk gene in Bursaphelenchus xylophilus ( in Chinese).</a> Acta Phytopathologica Sinica. 46 (5), 662-669 (2016).</li><li>Qiu, X., Wu, X., Huang, L., Ye, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Bxpel1+gene+silencing+by+dsRNA+interference+on+the+development+and+pathogenicity+of+the+pine+wood+nematode,+Bursaphelenchus+xylophilus.">Influence of Bxpel1 gene silencing by dsRNA interference on the development and pathogenicity of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 125 (2016).</li><li>Dulovic, A., Streit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-mediated+knockdown+of+daf-12+in+the+model+parasitic+nematode+Strongyloides+ratti.">RNAi-mediated knockdown of daf-12 in the model parasitic nematode Strongyloides ratti.</a> PLoS Pathogens. 15 (3), 1007705 (2019).</li><li>Li, L., Zhao, H., Cui, Y., Wei, H., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+of+gene+editing+technology.">Research progress of gene editing technology.</a> Life Science Research. 21 (3), 268-274 (2017).</li><li>Bindhya, C. Y., Karuppannan, V., Kuppuswamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-generated+double+stranded+RNA+induces+RNAi+in+plant-parasitic+nematodes+and+protects+the+host+from+infection.">Host-generated double stranded RNA induces RNAi in plant-parasitic nematodes and protects the host from infection.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 148 (2), 219-222 (2006).</li><li>Jiang, Z., Sher, A. K., David, G. H., Ralph, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+insect-resistant+plants:+RNAi-mediated+crop+protection.">Next-generation insect-resistant plants: RNAi-mediated crop protection.</a> Trends in Biotechnology. 35 (9), 871-882 (2017).</li></ol>

Sebbene la storia della vita e l'ambiente parassitario di B. xylophilus siano diversi da quelli di altri nematodi, c'è stata una ricerca limitata sulla patogenesi molecolare di questo patogeno vegetale. Nonostante i grandi progressi compiuti nell'applicazione della tecnologia di modifica del genoma CRISPR / Cas9 in C. elegans e altri nematodi, solo la tecnologia RNAi applicata a B. xylophilus è stata pubblicata fino ad oggi17. RNAi è uno degli strumenti più potenti d...

I nematodi parassiti delle piante (PPN) sono una minaccia continua per la sicurezza alimentare e gli ecosistemi forestali. Causano circa 100 miliardi di dollari di perdite economiche ogni anno1, i più problematici dei quali sono principalmente i nematodi a nodo radicale, i nematodi a cisti e i nematodi di pino. Il nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus, è un nematode endoparassitario migratore, che è l'agente patogeno causale della malattia dell'avvizzimento del pino2. Ha causato gravi danni alle foreste di pini in tutto il mondo3. Usando la terminologia di Van Megen et al.4, B. xylophilus è un membro dei Parasitaphelenchidae e appartiene al clade 10, mentre la maggior parte degli altri principali parassiti delle piante appartengono al clade 12.
Come parassita vegetale indipendente e recentemente evoluto, B. xylophilus è un modello attraente per studi comparativi. Ad oggi, ci sono state ricerche sostanziali sui nematodi a nodo radicale e sui nematodi a cisti appartenenti al clade 12, che sono endoparassiti sedentari obbligati e sono alcuni dei nematodi più intensamente studiati. Tuttavia, condurre ulteriori ricerche in questo importante settore comporta una grande sfida: la funzione dei geni del parassitismo è un collo di bottiglia della ricerca. Gli studi funzionali generalmente includono esperimenti di espressione ectopica e knockdown / out, ma si basano su protocolli di trasformazione genetica efficaci per il nematode. Di conseguenza, la genetica inversa nei PPN si basa quasi esclusivamente sul silenziamento genico da parte dell'RNAi.
L'RNAi, un meccanismo ampiamente presente nelle cellule eucariotiche, silenzia l'espressione genica introducendo RNA a doppio filamento (dsRNA)5. Ad oggi, il meccanismo di silenziamento genico posttrascrizionale indotto dal dsRNA è stato trovato in tutti gli eucarioti studiati e la tecnologia RNAi, come strumento di ricerca sulla genomica funzionale e altre applicazioni, si è sviluppata rapidamente in molti organismi. Dalla scoperta del meccanismo RNAi in Caenorhabditis elegans nel 19986, le tecniche RNAi sono diventate metodi efficaci per identificare la funzione genica dei nematodi e sono proposte come un nuovo modo per controllare efficacemente i nematodi patogeni7.
L'RNAi è tecnicamente facile: può essere sufficiente immergere i giovani nel dsRNA; Tuttavia, l'efficacia e la riproducibilità di questo approccio variano ampiamente con le specie di nematodi e il gene bersaglio8. Il silenziamento di 20 geni coinvolti nelle vie RNAi del nematode nodo radicale, Meloidogyne incognita, è stato studiato utilizzando lunghi dsRNA come trigger, con conseguente risposte diverse, tra cui un aumento e nessun cambiamento nell'espressione di alcuni geni9. Questi risultati mostrano che i geni bersaglio possono rispondere al knockdown dell'RNAi in modo diverso, rendendo necessaria una valutazione esaustiva della loro idoneità come bersagli per il controllo dei nematodi tramite RNAi. Tuttavia, c'è attualmente una scarsità di ricerca sulla biologia dello sviluppo e della riproduzione di B. xylophilus.
Come continuazione del precedente lavoro10,11,12,13, descriviamo qui un protocollo per applicare RNAi per studiare la funzione del gene ppm-1 di B. xylophilus, compresa la sintesi di dsRNA, l'ammollo neurostimolante sintetico e il rilevamento della reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR). Le conoscenze acquisite da questo approccio sperimentale contribuiranno probabilmente notevolmente alla comprensione dei sistemi biologici di base e alla prevenzione della malattia dell'avvizzimento del pino.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Baermann funnel</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>to isolate nematodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beacon Designer 7.9</td>
			<td>Shanghai kangyusheng information technology co.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>to design qPCR primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Botrytis cinerea</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>as food for nematodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bursaphelenchus xylophilus</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>its number was NXY61 and was it was originally extracted from diseased 
			Pinus massoniana in Ningbo, Zhejiang province, China.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>constant temperature incubator</td>
			<td>Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.</td>
			<td>H1703544</td>
			<td>to cultur nematodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1704466</td>
			<td>to achieve electrophoretic analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 75%</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>80176961</td>
			<td>to extract RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq Polymerase Premix</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR030A</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq Polymerase Premix</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR390A</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td>LongGene Scientific Instruments Co.</td>
			<td>LG2020</td>
			<td>to make nucleic acid bands visible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>n/a</td>
			<td>to analyze the data and make figurs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Centrifuge</td>
			<td>Hangzhou Allsheng Instruments Co.</td>
			<td>AS0813000</td>
			<td>centrifug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-flux tissue grinder</td>
			<td>Bertin</td>
			<td></td>
			<td>to extract RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>n/a</td>
			<td>to measure the body lengths</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl alcohol</td>
			<td>Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.</td>
			<td>L1909022</td>
			<td>to extract RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM4B microscope</td>
			<td>Leica Microsystems Inc.</td>
			<td></td>
			<td>to observe nematodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic beads</td>
			<td>Aoran science technology co.</td>
			<td>150010C</td>
			<td>to extract RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>AM1333</td>
			<td>to synthesize dsRNA in vitro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-2000 spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>NanoDrop 2000/2000C</td>
			<td>to analyze the quality of the dsRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Amplifier</td>
			<td>Bio-Rad Life Medical Products Co.</td>
			<td>1851148</td>
			<td>to amplify nucleic acid sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>to cultur nematodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEM-T Easy vector</td>
			<td>Promega Corporation</td>
			<td>A1360</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (Medium)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>to cultur Botrytis cinerea</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR047B</td>
			<td>to synthetic cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Premier 5.0</td>
			<td>PREMIER Biosoft</td>
			<td>n/a</td>
			<td>to design PCR primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primers:ppm-1-F/R</td>
			<td>Tsingke Biotechnology Co.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>F: 5&#39;-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3&#39;; R: 5&#39;- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>q-ppm-1-F/R</td>
			<td>Tsingke Biotechnology Co.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>F: 5&#39;-CATCCGAATGGCAATACAG-3&#39;; R: 5&#39;-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time thermal cycler&#160;qTOWER 2.2</td>
			<td>Analytique Jena Instruments (Beijing) Co.</td>
			<td></td>
			<td>for qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shaking table</td>
			<td>Shanghai Zhicheng analytical instrument manufacturing co.</td>
			<td></td>
			<td>to soak nematodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereoscopic microscope</td>
			<td>Chongqing Optec Instrument Co.</td>
			<td>1814120</td>
			<td>to observe nematodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7-GFP-F/R</td>
			<td>Tsingke Biotechnology Co.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>F: 5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGGAAA 
			GGAGAAGAACTTTTCAC-3&#39;; R: 5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGGCTG 
			TTACAAACTCAAGAAGG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;T7 promoter</td>
			<td>Tsingke Biotechnology Co.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>TAATACGACTCACTATAGGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>9762</td>
			<td>to recover DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR820A</td>
			<td>for qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trichloroethane</td>
			<td>Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co.</td>
			<td></td>
			<td>to extract RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>15596026</td>
			<td>total RNA extraction reagent,to extract RNA</td>
		</tr>
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application of rna interference in the pinewood nematode, bursaphelenchus xylophilus

Il nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus, è una delle specie invasive più distruttive in tutto il mondo, causando l'avvizzimento e la morte finale dei pini. Nonostante il riconoscimento della loro importanza economica e ambientale, è stato finora impossibile studiare le funzioni genetiche dettagliate dei nematodi parassiti delle piante (PPN) utilizzando la genetica convenzionale e i metodi transgenici. Tuttavia, come tecnologia di genetica inversa, l'interferenza dell'RNA (RNAi) facilita lo studio dei geni funzionali dei nematodi, incluso B. xylophilus. 
Questo articolo delinea un nuovo protocollo per l'RNAi del gene ppm-1 in B. xylophilus, che è stato segnalato per svolgere ruoli cruciali nello sviluppo e nella riproduzione di altri nematodi patogeni. Per l'RNAi, il promotore T7 è stato collegato al 5′-terminale del frammento bersaglio mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) e l'RNA a doppio filamento (dsRNA) è stato sintetizzato mediante trascrizione in vitro . Successivamente, la consegna del dsRNA è stata realizzata immergendo i nematodi in una soluzione di dsRNA mescolata con neurostimolanti sintetici. I giovani sincronizzati di B. xylophilus (circa 20.000 individui) sono stati lavati e immersi in dsRNA (0,8 μg/ml) nel tampone di ammollo per 24 ore al buio a 25 °C.
La stessa quantità di nematodi è stata posta in un tampone di ammollo senza dsRNA come controllo. Nel frattempo, un'altra quantità identica di nematodi è stata posta in un tampone di ammollo con il gene della proteina fluorescente verde (gfp) dsRNA come controllo. Dopo l'immersione, il livello di espressione delle trascrizioni target è stato determinato utilizzando la PCR quantitativa in tempo reale. Gli effetti dell'RNAi sono stati poi confermati utilizzando l'osservazione microscopica dei fenotipi e un confronto delle dimensioni corporee degli adulti tra i gruppi. L'attuale protocollo può aiutare a far progredire la ricerca per comprendere meglio le funzioni dei geni di B. xylophilus e di altri nematodi parassiti verso lo sviluppo di strategie di controllo attraverso l'ingegneria genetica.

Analisi dell'espressione ppm-1 di B. xylophilus dopo RNAi Il livello di espressione relativa del gene ppm-1 di B. xylophilus imbevuto di dsRNA GFP e di quello imbevuto di dsRNA del gene bersaglio era rispettivamente 0,92 e 0,52 (il livello di espressione genica ppm-1 del gruppo di controllo trattato con ddH2O era impostato su 1) (Figura 1). Pertanto,...

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Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Qui, introduciamo un metodo dettagliato di ammollo dell'interferenza dell'RNA in Bursaphelenchus xylophilus per facilitare lo studio delle funzioni geniche.

Applicazione dell'interferenza dell'RNA nel nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of ...

L'RNAi è diventato un metodo efficace per identificare la funzione dei geni nei nematodi e viene proposto come un nuovo modo per controllare efficacemente i nematodi patogeni. RNAi sta immergendo i nematodi in dsRNA può essere sufficiente per la procedura. Per iniziare, raccogli i nematodi con il metodo dell'imbuto Baermann.Per questo, posizionare un tubo di gomma bloccato sotto un imbuto e posizionare due strati di carta da filtro nella bocca dell'imbuto. Trasferire le colture fungine di Botrytis cinerea nell'imbuto e aggiungere acqua per immergere il tappeto fungino. Quando vengono raccolti i nematodi, aggiungere 500 microlitri di reagente di estrazione e 100 microlitri di sfere magnetiche in una provetta da centrifuga da due millilitri.Aspirare 20 microlitri di nematodi e macinare i campioni a 9.000 x g per 30 secondi. Incubare per cinque minuti e centrifugare a 12.000 x g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il surnatante in una provetta da centrifuga fresca.Aggiungere 100 microlitri di cloroformio e mescolare capovolgendo più volte il tubo. Incubare per tre minuti e quindi centrifugare a 12.000 x g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Anche in questo caso, trasferire il surnatante in una provetta da centrifuga fresca.Aggiungere 250 microlitri di alcool isopropilico e vortice vigorosamente. Centrifugare a 12.000 x g per 10 minuti e vortice. Scartare il surnatante e aggiungere 500 microlitri di etanolo al 75% per lavare l'RNA.Vortice il campione seguito da centrifugazione a 12.000 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Asciugare all'aria il pellet di RNA per cinque minuti e risospenderlo in 30 microlitri di acqua priva di RNasi. Calcolare la concentrazione di RNA utilizzando questa formula e calcolare il rapporto tra A260 e A280.Quindi, utilizzare una coppia di primer per amplificare la sequenza codificante parziale del gene BX ppm-1 dal B.xylophilus. Quindi clonare le sequenze di gene ppm-1 in un vettore pGEM-T Easy contenente il promotore T7. Recuperare il frammento di gene ppm-1 lungo 894 coppie di basi utilizzando il plasmide clonato come modello per la pcr.Quindi, utilizzare un kit di trascrizione in vitro per sintetizzare il dsRNA. Analizzare la qualità del dsRNA utilizzando uno spettrofotometro e visualizzare i prodotti su un gel di agarosio all'1%. Aggiungere quattro microlitri di tampone di ammollo 5X e portare il volume a 20 microlitri con acqua distillata doppia per ottenere una concentrazione finale di RNA di 0,8 microgrammi per millilitro.Quindi posizionare i nematodi nel piatto per 30 minuti e attendere che le uova aderiscano al fondo. Rimuovere con attenzione l'acqua e i nematodi senza disturbare le uova fino a quando solo le uova rimangono nel piatto. Schiudere le uova raccolte al buio a 25 gradi Celsius per 24 ore per ottenere larve J2.Raccogliere le larve in un tubo e lavarle tre volte con acqua distillata doppia. Quindi, trasferire le larve nel tubo contenente la soluzione di dsRNA. A questo, aggiungere la soluzione di resorcinolo per ottenere una soluzione all'1%.Posizionare le larve su un tavolo vibrante per garantire un sufficiente assorbimento di dsRNA nelle larve. Per i controlli, immergere la stessa quantità di nematodi nel tampone di ammollo senza la sonda dsRNA o con una sonda dsRNA GFP. Eseguire una qPCR utilizzando i geni actB e tbb-2 come riferimenti interni per valutare i cambiamenti nel livello di espressione genica.Utilizzare il metodo delta delta Ct per stimare il livello di espressione genica relativa dalla curva di dissoluzione e dal valore Ct. Dopo RNAi, coltura delle larve J2 fino all'età adulta su prati di Botrytis cinerea su piastre PDA. Raccogliere gli adulti utilizzando il metodo dell'imbuto Baermann come mostrato nella prima sezione.Acquisire immagini dei nematodi adulti al microscopio e utilizzare il software ImageJ per misurare la lunghezza corporea di 50 nematodi maschi e 50 femmine. Analizzare i dati calcolando la media e la deviazione standard per ciascun campione. Applicare il test Student t per confrontare le medie dei campioni dei diversi gruppi.L'analisi dell'espressione genica relativa dopo RNAi ha indicato che il dsRNA ppm-1 può inibire efficacemente l'espressione del gene ppm-1 di B.Xylophilus. Mentre il dsRNA esogeno GFP non ha avuto alcun effetto sull'espressione di ppm-1. Dopo RNAi, le dimensioni degli adulti sono diminuite notevolmente nonostante il raggiungimento della maturità sessuale, con conseguente fenotipo mutante di piccole dimensioni corporee.La lunghezza corporea media delle femmine e dei maschi mutanti era di 544 e 526 micrometri rispetto ai 971 e 912 micrometri del gruppo di controllo La cosa più importante è trasferire i nematodi nella soluzione di RNA a doppio filamento e aggiungere un altro reagente per stimolare i nematodi a nutrirsi. Questo metodo è adatto per lo screening genetico su larga scala ed è comunemente usato nella ricerca cellulare. Lo studio della funzione genica di B.Xylophilus con questo metodo ha un valore guida per il controllo biologico di B.Xylophilus.

Research

JoVE Journal

Biology

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

Trascrizione in vitro e tappatura mRNA Luciferase Gaussia Seguito da cellule HeLa Transfection

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Ricerca

Biologia

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Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

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Utilizzo di RNA-mediata strategia di alimentazione di interferenza secondo schermo per geni coinvolti nella regolazione Dimensione del corpo nel nematode<em&gt; C. elegans</em

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The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

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A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

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