Name: application of rna interference in the pinewood nematode, bursaphelenchus xylophilus
Uploaded: 2022-03-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus at JoVE.com

Esta pesquisa foi financiada pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31870637, 31200487) e financiada conjuntamente pelo Plano de Pesquisa Chave de Zhejiang (2019C02024, LGN22C160004).

O estudo foi aprovado pelo conselho para experimentação animal da Zhejiang Agricultural & Forestry University. O b . xylophilus isolante NXY61 foi originalmente extraído de uma massoniana pinus doente na área de Ningbo da província de Zhejiang, China11.
1. Clonagem de genes
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre os primers utilizados neste protocolo.
<ol><li>Co...

<ol>
	<li>Nicol, J. M., Jones, J., Gheysen, G., Fenoll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+nematode+threats+to+world+agriculture.">Current nematode threats to world agriculture.</a> Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions. , 21-43 (2011).</li><li>Jones, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+plant-parasitic+nematodes+in+molecular+plant+pathology.">Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 14 (9), 946-961 (2013).</li><li>Kikuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+insights+into+the+origin+of+parasitism+in+the+emerging+plant+pathogen+Bursaphelenchus+xylophilus.">Genomic insights into the origin of parasitism in the emerging plant pathogen Bursaphelenchus xylophilus.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002219 (2011).</li><li>Megen, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phylogenetic+tree+of+nematodes+based+on+about+1200+full-length+small+subunit+ribosomal+DNA+sequences.">A phylogenetic tree of nematodes based on about 1200 full-length small subunit ribosomal DNA sequences.</a> Nematology. 11 (6), 927-950 (2009).</li><li>Niu, J. H., Jian, H., Xu, J. M., Guo, Y. D., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+technology+extends+its+reach:+Engineering+plant+resistance+against+harmful+eukaryotes.">RNAi technology extends its reach: Engineering plant resistance against harmful eukaryotes.</a> African Journal of Biotechnology. 9 (45), 7573-7582 (2010).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 91 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Shahid, M., Imran, A., Mazhar, H., Yusuf, Z., Rob, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+novel+traits+in+plants+through+RNA+interference.">Engineering novel traits in plants through RNA interference.</a> Trends in Plant Science. 11 (11), 559-565 (2006).</li><li>Marmonier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+acquisition+of+specific+small+interfering+RNAs+inhibits+the+expression+of+some+target+genes+in+the+plant+ectoparasite+Xiphinema+index.">In vitro acquisition of specific small interfering RNAs inhibits the expression of some target genes in the plant ectoparasite Xiphinema index.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3266 (2019).</li><li>Iqbal, S., Fosu-Nyarko, J., Jones, M. G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attempt+to+silence+genes+of+the+RNAi+pathways+of+the+root-knot+nematode,+Meloidogyne+incognita+results+in+diverse+responses+including+increase+and+no+change+in+expression+of+some+genes.">Attempt to silence genes of the RNAi pathways of the root-knot nematode, Meloidogyne incognita results in diverse responses including increase and no change in expression of some genes.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 328 (2020).</li><li>Zhou, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+and+functional+analysis+of+akt-1+in+pinewood+nematode,+Bursaphelenchus+xylophilus.">Molecular characterization and functional analysis of akt-1 in pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Forest Pathology. 51 (1), 12647 (2021).</li><li>Zhou, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mab-3+in+spermatogenesis+and+ontogenesis+of+pinewood+nematode,+Bursaphelenchus+xylophilus.">The role of mab-3 in spermatogenesis and ontogenesis of pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Pest Management Science. 77 (1), 138-147 (2021).</li><li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bxy-fuca+encoding+&#945;-L-fucosidase+plays+crucial+roles+in+development+and+reproduction+of+the+pathogenic+pinewood+nematode,+Bursaphelenchus+xylophilus.">Bxy-fuca encoding &#945;-L-fucosidase plays crucial roles in development and reproduction of the pathogenic pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Pest Management Science. 76 (1), 205-214 (2020).</li><li>Wang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+and+functional+analysis+of+daf-8+in+the+pinewood+nematode,+Bursaphelenchus+xylophilus.">Molecular characterization and functional analysis of daf-8 in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Journal of Forestry Research. , (2021).</li><li>Viglierchio, D. R., Schmitt, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+methodology+of+nematode+extraction+from+field+samples:+Baermann+funnel+modifications.">On the methodology of nematode extraction from field samples: Baermann funnel modifications.</a> Journal of Nematology. 15 (3), 438-444 (1983).</li><li>Zhu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+and+quantification+of+mating+behavior+in+the+pinewood+nematode,+Bursaphelenchus+xylophilus.">Observation and quantification of mating behavior in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54842 (2016).</li><li>Zhou, L. F., Chen, F. M., Ye, J. R., Pan, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+reliable+reference+genes+for+RT-qPCR+analysis+of+Bursaphelenchus+mucronatus+gene+expression+from+different+habitats+and+developmental+stages.">Selection of reliable reference genes for RT-qPCR analysis of Bursaphelenchus mucronatus gene expression from different habitats and developmental stages.</a> Frontiers in Genetics. 9, 269-279 (2018).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA-mediated+interference+of+dumpy+genes+in+Bursaphelenchus+xylophilus+by+feeding+on+filamentous+fungal+transformants.">Double-stranded RNA-mediated interference of dumpy genes in Bursaphelenchus xylophilus by feeding on filamentous fungal transformants.</a> International Journal for Parasitology. 46 (5-6), 351-360 (2016).</li><li>Ma, H. B., Lu, Q., Liang, J., Zhang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+cellulose+gene+of+the+pine+wood+nematode,+Bursaphelenchus+xylophilus,+using+RNA+interference.">Functional analysis of the cellulose gene of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, using RNA interference.</a> Genetics and Molecular Research: GMR. 10 (3), 1931-1941 (2011).</li><li>Cheng, X. Y., Dai, S. M., Xiao, L., Xie, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cellulase+gene+knock+down+by+dsRNA+interference+on+the+development+and+reproduction+of+the+pine+wood+nematode,+Bursaphelenchus+xylophilus.">Influence of cellulase gene knock down by dsRNA interference on the development and reproduction of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Nematology. 12 (12), 225-233 (2010).</li><li>Xue, Q., Wu, X. Q., Zhang, W. J., Deng, L. N., Wu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+L-like+cysteine+proteinase+genes+are+associated+with+the+development+and+pathogenicity+of+pine+wood+nematode,+Bursaphelenchus+xylophilus.">Cathepsin L-like cysteine proteinase genes are associated with the development and pathogenicity of pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), 215 (2019).</li><li>Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+in+C.+elegans:+Soaking+in+the+genome+sequence.">RNAi in C. elegans: Soaking in the genome sequence.</a> Science. 282 (5388), 430-431 (1998).</li><li>Urwin, P. E., Lilley, C. J., Atkinson, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+double-stranded+RNA+by+pre+parasitic+juvenile+cyst+nematodes+leads+to+RNA+interference.">Ingestion of double-stranded RNA by pre parasitic juvenile cyst nematodes leads to RNA interference.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 15 (8), 747-752 (2002).</li><li>Bakhetia, M., Charlton, W., Atkinson, H. J., McPherson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+of+dual+oxidase+in+the+plant+nematode+Meloidogyne+incognita.">RNA interference of dual oxidase in the plant nematode Meloidogyne incognita.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (10), 1099-1106 (2005).</li><li>Rosso, M. N., Dubrana, M. P., Cimbolini, N., Jaubert, S., Abad, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+RNA+interference+to+root-knot+nematode+genes+encoding+esophageal+gland+proteins.">Application of RNA interference to root-knot nematode genes encoding esophageal gland proteins.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 615-620 (2005).</li><li>Chen, Q., Rehman, S., Smant, G., Jones, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+pathogenicity+proteins+of+the+potato+cyst+nematode+Globodera+rostochiensis+using+RNAi.">Functional analysis of pathogenicity proteins of the potato cyst nematode Globodera rostochiensis using RNAi.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 621-625 (2005).</li><li>Wang, D. D., Li, Y., Li, J., Xie, B. Y., Chen, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+clone+and+its+RNAi+interference+effect+analysis+of+mapk+gene+in+Bursaphelenchus+xylophilus+(+in+Chinese).">Molecular clone and its RNAi interference effect analysis of mapk gene in Bursaphelenchus xylophilus ( in Chinese).</a> Acta Phytopathologica Sinica. 46 (5), 662-669 (2016).</li><li>Qiu, X., Wu, X., Huang, L., Ye, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Bxpel1+gene+silencing+by+dsRNA+interference+on+the+development+and+pathogenicity+of+the+pine+wood+nematode,+Bursaphelenchus+xylophilus.">Influence of Bxpel1 gene silencing by dsRNA interference on the development and pathogenicity of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 125 (2016).</li><li>Dulovic, A., Streit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-mediated+knockdown+of+daf-12+in+the+model+parasitic+nematode+Strongyloides+ratti.">RNAi-mediated knockdown of daf-12 in the model parasitic nematode Strongyloides ratti.</a> PLoS Pathogens. 15 (3), 1007705 (2019).</li><li>Li, L., Zhao, H., Cui, Y., Wei, H., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+of+gene+editing+technology.">Research progress of gene editing technology.</a> Life Science Research. 21 (3), 268-274 (2017).</li><li>Bindhya, C. Y., Karuppannan, V., Kuppuswamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-generated+double+stranded+RNA+induces+RNAi+in+plant-parasitic+nematodes+and+protects+the+host+from+infection.">Host-generated double stranded RNA induces RNAi in plant-parasitic nematodes and protects the host from infection.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 148 (2), 219-222 (2006).</li><li>Jiang, Z., Sher, A. K., David, G. H., Ralph, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+insect-resistant+plants:+RNAi-mediated+crop+protection.">Next-generation insect-resistant plants: RNAi-mediated crop protection.</a> Trends in Biotechnology. 35 (9), 871-882 (2017).</li></ol>

Embora a história de vida e o ambiente parasitítico de B. xilophilus sejam diferentes dos de outros nematoides, tem havido pesquisas limitadas sobre a patogênese molecular deste patógeno vegetal. Apesar dos grandes avanços na aplicação da tecnologia de edição de genomas CRISPR/Cas9 em C. elegans e outros nematoides, apenas a tecnologia RNAi aplicada à B. xylophilus foi publicada atéo momento 17. A RNAi é uma das ferramentas mais poderosas disponíveis para es...

Os nematoides parasiticos vegetais (PPNs) são uma ameaça contínua à segurança alimentar e aos ecossistemas florestais. Eles causam cerca de 100 bilhões de USD em perdas econômicas a cadaano 1, dos quais os mais problemáticos são principalmente nematoides de nó raiz, nematoides de cisto e nematoides de pinheiros. O nematoide de pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus, é um nematoide migratório e endoparasitário, que é o patógeno causal da doençade murchar pinheiro 2. Causou grandes danos às florestas de pinheiros em todo o mundo3. Usando a terminologia de Van Megen et al.4, B. xylophilus é um membro do Parasitaphelenchidae e pertence ao clade 10, enquanto a maioria dos outros grandes parasitas vegetais pertencem ao clade 12.
Como um parasita vegetal independente e recentemente evoluído, B. xylophilus é um modelo atraente para estudos comparativos. Até o momento, tem havido pesquisas substanciais sobre nematoides de nó radicular e nematoides de cisto pertencentes ao clade 12, que são endoparasitas obrigatórias e sedentárias e são alguns dos nematoides mais intensamente estudados. No entanto, a realização de novas pesquisas nessa importante área vem com um grande desafio: a função dos genes do parasitismo é um gargalo de pesquisa. Estudos funcionais geralmente incluem expressões ectópicas e experimentos de knockdown/out, mas dependem de protocolos eficazes de transformação genética para o nematoide. Como resultado, a genética reversa em PPNs depende quase exclusivamente do silenciamento genético pela RNAi.
RNAi, um mecanismo amplamente presente em células eucarióticas, silencia a expressão genética introduzindo RNA de dupla cadeia (dsRNA)5. Até o momento, o mecanismo de silenciamento de genes pós-transcrição induzido pelo dsRNA foi encontrado em todos os eucariotes estudados, e a tecnologia RNAi, como uma ferramenta de pesquisa de genômica funcional e outras aplicações, desenvolveu-se rapidamente em muitos organismos. Desde a descoberta do maquinário RNAi em Caenorhabditis elegans em 19986, as técnicas RNAi tornaram-se métodos eficazes para identificar a função genética dos nematoides e são propostas como uma nova maneira de controlar efetivamente os nematoides patogênicos7.
RNAi é tecnicamente fácil de absorver os jovens no dsRNA pode ser suficiente; no entanto, a eficácia e a reprodutibilidade dessa abordagem variam amplamente com a espécie nematoide e o gene alvo8. O silenciamento de 20 genes envolvidos nas vias RNAi do nematode do nó radicular, Meloidogyne incognita, foi investigado usando dsRNAs longas como gatilhos, resultando em respostas diversas, incluindo um aumento e nenhuma mudança na expressão de alguns genes9. Esses resultados mostram que os genes-alvo podem responder ao knockdown da RNAi de forma diferente, exigindo uma avaliação exaustiva de sua adequação como alvos para o controle de nematoide via RNAi. No entanto, há atualmente uma escassez de pesquisas sobre a biologia do desenvolvimento e reprodutiva de B. xilophilus.
Como continuação do trabalho anterior 10,11,12,13, descrevemos aqui um protocolo para a aplicação da RNAi para estudar a função do gene ppm-1 de B. xylophilus, incluindo a síntese de dsRNA, imersão neuroestimulante sintética e detecção quantitativa de reação em cadeia polimerase (qPCR). O conhecimento adquirido com essa abordagem experimental provavelmente contribuirá significativamente para a compreensão dos sistemas biológicos básicos e a prevenção da doença do verrinho.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Baermann funnel</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>to isolate nematodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beacon Designer 7.9</td>
			<td>Shanghai kangyusheng information technology co.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>to design qPCR primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Botrytis cinerea</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>as food for nematodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bursaphelenchus xylophilus</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>its number was NXY61 and was it was originally extracted from diseased 
			Pinus massoniana in Ningbo, Zhejiang province, China.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>constant temperature incubator</td>
			<td>Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.</td>
			<td>H1703544</td>
			<td>to cultur nematodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1704466</td>
			<td>to achieve electrophoretic analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 75%</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>80176961</td>
			<td>to extract RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq Polymerase Premix</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR030A</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq Polymerase Premix</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR390A</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td>LongGene Scientific Instruments Co.</td>
			<td>LG2020</td>
			<td>to make nucleic acid bands visible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>n/a</td>
			<td>to analyze the data and make figurs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Centrifuge</td>
			<td>Hangzhou Allsheng Instruments Co.</td>
			<td>AS0813000</td>
			<td>centrifug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-flux tissue grinder</td>
			<td>Bertin</td>
			<td></td>
			<td>to extract RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>n/a</td>
			<td>to measure the body lengths</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl alcohol</td>
			<td>Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.</td>
			<td>L1909022</td>
			<td>to extract RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM4B microscope</td>
			<td>Leica Microsystems Inc.</td>
			<td></td>
			<td>to observe nematodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic beads</td>
			<td>Aoran science technology co.</td>
			<td>150010C</td>
			<td>to extract RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>AM1333</td>
			<td>to synthesize dsRNA in vitro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-2000 spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>NanoDrop 2000/2000C</td>
			<td>to analyze the quality of the dsRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Amplifier</td>
			<td>Bio-Rad Life Medical Products Co.</td>
			<td>1851148</td>
			<td>to amplify nucleic acid sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>to cultur nematodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEM-T Easy vector</td>
			<td>Promega Corporation</td>
			<td>A1360</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (Medium)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>to cultur Botrytis cinerea</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR047B</td>
			<td>to synthetic cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Premier 5.0</td>
			<td>PREMIER Biosoft</td>
			<td>n/a</td>
			<td>to design PCR primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primers:ppm-1-F/R</td>
			<td>Tsingke Biotechnology Co.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>F: 5&#39;-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3&#39;; R: 5&#39;- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>q-ppm-1-F/R</td>
			<td>Tsingke Biotechnology Co.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>F: 5&#39;-CATCCGAATGGCAATACAG-3&#39;; R: 5&#39;-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time thermal cycler&#160;qTOWER 2.2</td>
			<td>Analytique Jena Instruments (Beijing) Co.</td>
			<td></td>
			<td>for qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shaking table</td>
			<td>Shanghai Zhicheng analytical instrument manufacturing co.</td>
			<td></td>
			<td>to soak nematodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereoscopic microscope</td>
			<td>Chongqing Optec Instrument Co.</td>
			<td>1814120</td>
			<td>to observe nematodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7-GFP-F/R</td>
			<td>Tsingke Biotechnology Co.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>F: 5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGGAAA 
			GGAGAAGAACTTTTCAC-3&#39;; R: 5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGGCTG 
			TTACAAACTCAAGAAGG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;T7 promoter</td>
			<td>Tsingke Biotechnology Co.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>TAATACGACTCACTATAGGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>9762</td>
			<td>to recover DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR820A</td>
			<td>for qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trichloroethane</td>
			<td>Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co.</td>
			<td></td>
			<td>to extract RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>15596026</td>
			<td>total RNA extraction reagent,to extract RNA</td>
		</tr>
	</tbody>
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application of rna interference in the pinewood nematode, bursaphelenchus xylophilus

O nematode de pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus, é uma das espécies invasoras mais destrutivas do mundo, causando a murcha e eventual morte de pinheiros. Apesar do reconhecimento de sua significância econômica e ambiental, até agora tem sido impossível estudar as funções genéticas detalhadas dos nematoides parasiticos vegetais (PPNs) utilizando genética convencional para a frente e métodos transgênicos. No entanto, como uma tecnologia genética reversa, a interferência de RNA (RNAi) facilita o estudo dos genes funcionais de nematoides, incluindo B. xylophilus. 
Este artigo descreve um novo protocolo para RNAi do gene ppm-1 em B. xylophilus, que tem sido relatado para desempenhar papéis cruciais no desenvolvimento e reprodução de outros nematoides patogênicos. Para o RNAi, o promotor T7 foi ligado ao 5′-terminal do fragmento alvo por reação em cadeia de polimerase (PCR), e o RNA de dupla cadeia (dsRNA) foi sintetizado por transcrição in vitro . Posteriormente, a entrega de dsRNA foi realizada absorvendo os nematoides em uma solução dsRNA misturada com neuroestimulantes sintéticos. Os jovens sincronizados de B. xylophilus (aproximadamente 20.000 indivíduos) foram lavados e encharcados em dsRNA (0,8 μg/mL) no tampão de imersão por 24 h no escuro a 25 °C.
A mesma quantidade de nematoides foi colocada em um tampão de imersão sem dsRNA como controle. Enquanto isso, outra quantidade idêntica de nematoides foi colocada em um tampão de imersão com proteína fluorescente verde (gfp) gene dsRNA como controle. Após a imersão, o nível de expressão das transcrições de destino foi determinado por meio de PCR quantitativo em tempo real. Os efeitos da RNAi foram então confirmados utilizando-se observação microscópica dos fenótipos e comparação do tamanho do corpo dos adultos entre os grupos. O protocolo atual pode ajudar a avançar a pesquisa para entender melhor as funções dos genes de B. xilophilus e outros nematoides parasitas para o desenvolvimento de estratégias de controle através da engenharia genética.

Análise da expressão ppm-1 de B. xylophilus após RNAi O nível de expressão relativa do gene ppm-1 de B. xylophilus encharcado com DSRNA GFP e que encharcado com gene alvo dsRNA foi de 0,92 e 0,52, respectivamente (o nível de expressão genética ppm-1 do grupo de controle tratado ddH2O foi definido para 1) (Figura 1). Assim, o dsRNA exógeno n...

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Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Aqui, introduzimos um método de imersão detalhado da interferência de RNA em Bursaphelenchus xylophilus para facilitar o estudo das funções genéticas.

Aplicação de interferência de RNA no Nematode pinewood, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of ...

A RNAi tornou-se um método eficaz para identificar a função dos genes em nematoides e são propostas como uma nova maneira de controlar efetivamente nematoides patogênicos. RNAi está absorvendo nematoides no dsRNA pode ser suficiente para o procedimento. Para começar, colete os nematoides pelo método do funil Baermann.Para isso, coloque um tubo de borracha preso abaixo de um funil e coloque duas camadas de papel filtro na boca do funil. Transfira as culturas fúngicas botrytis cinerea para o funil e adicione água para imergir o tapete fúngico. Quando os nematoides forem coletados, adicione 500 microliters de reagente de extração e 100 microliters de contas magnéticas a um tubo de centrífuga de dois mililitros.Aspire 20 microliters dos nematoides e triture as amostras a 9.000 x g durante 30 segundos. Incubar por cinco minutos e centrífuga a 12.000 x g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o supernatante para um tubo de centrífuga fresco.Adicione 100 microliters de clorofórmio e misture invertendo o tubo várias vezes. Incubar por três minutos e depois centrífuga a 12.000 x g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Novamente, transfira o supernatante para um tubo de centrífuga fresco.Adicione 250 microliters de álcool isopropílico e vórtice vigorosamente. Centrifugar a 12.000 x g por 10 minutos e vórtice. Descarte o supernatante e adicione 500 microliters de 75% de etanol para lavar o RNA.Vórtice a amostra seguida de centrifugação a 12.000 x g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Seque a pelota de RNA por cinco minutos e resuspense-a em 30 microliters de água livre RNase. Calcule a concentração de RNA usando esta fórmula e calcule a razão A260 a A280.Em seguida, use um par de primers para amplificar a sequência de codificação parcial do gene BX ppm-1 do B.xylophilus. Em seguida, clone as sequências genéticas ppm-1 em um vetor pGEM-T Easy contendo o promotor T7. Recupere o fragmento genético ppm-1 do par base 894 usando o plasmídeo clonado como modelo para pcr.Em seguida, use um kit de transcrição in vitro para sintetizar o dsRNA. Analise a qualidade do dsRNA usando um espectotômetro e visualize os produtos em um gel de 1%agarose. Adicione quatro microliters de tampão de imersão 5X e compõe o volume para 20 microliters com água dupla destilada para obter uma concentração final de RNA de 0,8 microgramas por mililitro.Em seguida, coloque os nematoides no prato por 30 minutos e espere os ovos aderirem ao fundo. Remova cuidadosamente a água e os nematoides sem perturbar os ovos até que apenas os ovos permaneçam no prato. Eclode os ovos coletados no escuro a 25 graus Celsius durante 24 horas para obter larvas J2.Recolhe as larvas em um tubo e lave-as três vezes com água dupla destilada. Em seguida, transfira as larvas para o tubo contendo a solução dsRNA. Para isso, adicione solução resorcinol para obter uma solução de 1%.Coloque as larvas sobre uma mesa de agitação para garantir a absorção suficiente de dsRNA nas larvas. Para controles, mergulhe a mesma quantidade de nematoides no buffer de imersão sem a sonda dsRNA ou com uma sonda DSRNA GFP. Realize um qPCR usando os genes actB e tbb-2 como referências internas para avaliar as mudanças no nível de expressão genética.Use o método delta delta ct para estimar o nível relativo de expressão genética da curva de dissolução e do valor de TC. Depois da RNAi, cultura as larvas J2 até a idade adulta em gramados de Botrytis cinerea em placas PDA. Colete os adultos usando o método do funil Baermann, conforme mostrado na seção um.Adquira imagens dos nematoides adultos sob um microscópio e use o software ImageJ para medir o comprimento corporal de 50 nematoides masculinos e 50 fêmeas. Analise os dados calculando a média e o desvio padrão de cada amostra. Aplique o teste do aluno para comparar os meios das amostras dos diferentes grupos.A análise relativa da expressão genética após o RNAi indicou que o ppm-1 dsRNA pode efetivamente inibir a expressão do ppm-1 um gene de B.Xylophilus. Considerando que o exógeno GFP dsRNA não teve efeito na expressão ppm-1. Após a RNAi, o tamanho dos adultos diminuiu acentuadamente, apesar de atingir a maturidade sexual resultando no fenótipo mutante de pequeno tamanho corporal.O comprimento médio do corpo das fêmeas mutantes e machos foi de 544 e 526 micrômetros em comparação com 971 e 912 micrômetros para o grupo controle O mais importante é transferir os nematoides para a solução de RNA de dois fios e adicionar outro reagente para estimular os nematoides a se alimentarem. Este método é adequado para tela genética em grande escala e é comumente usado em pesquisas celulares. Estudar a função genética de B.Xylophilus por este método tem valor norteador para o controle biológico de B.Xylophilus.

Research

JoVE Journal

Biology

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

Transcrição in vitro e nivelamento de Gaussia mRNA luciferase Seguido por HeLa transfecção celular

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Biologia

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Isolamento de cromatina por purificação de RNA (CHIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Usando RNA mediada estratégia de alimentação Interferência em tela para genes envolvidos na regulação do tamanho corporal na Nemátodo<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

A interferência RNA larval no Red Flour Beetle,<em&gt; Tribolium castaneum</em

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Observação e quantificação do comportamento de acasalamento no nemátodo do pinheiro,<em&gt; Bursaphelenchus xylophilus</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

Uso prático da interferência do RNA: Oral entrega de RNA Double-stranded em lipossomas transportadoras para baratas

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

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Identificação de Splicing Alternativo e Poliadenilação em Dados de RNA-seq

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...