Name: assessment of open probability of the mitochondrial permeability transition pore in the setting of coenzyme q excess
Uploaded: 2022-06-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Open Probability of the Mitochondrial Permeability Transition Pore in the Setting of Coenzyme Q Excess at JoVE.com

NIH/NIGMS T32GM008464(K.K.G.)、コロンビア大学アーヴィング医療センター麻酔科への機会プロボスト目標賞(K.K.G.)、小児麻酔学会若手研究者研究賞(K.K.G.)、NIH/NINDS R01NS112706(R.J.L.)

コロンビア大学医療センターの施設動物ケアおよび使用委員会の承認は、記載されたすべての方法について得られた。本研究のモデル系として用いたFXS(Fmr1 KO)(FVB.129P2-Pde6b+Tyr c-ch Fmr1tm1Cgr/J)および対照(FVB)(FVB.129P2-Pde6b+Tyrc-ch/AntJ)マウスを商業的に取得した(材料表参照)。各実験群で5~11匹を用いた。生後10日目(P10)マウスを、ヒト乳児期?...

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	<li>Rasola, A., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+permeability+transition+pore+and+its+involvement+in+cell+death+and+in+disease+pathogenesis.">The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis.</a> Apoptosis. 12 (5), 815-833 (2007).</li><li>Szab&#243;, I., Zoratti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+megachannel+is+the+permeability+transition+pore.">The mitochondrial megachannel is the permeability transition pore.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 24, 111-117 (1992).</li><li>Brand, M., Ferguson, S., Nunnari, J., K&#252;hlbrandt, W., Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. 14, 767-830 (2002).</li><li>Perez, M. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+pathological+roles+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+in+the+heart.">Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart.</a> Cell Metabolism. 21 (2), 206-214 (2015).</li><li>Javadov, S., Kuznetsov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+permeability+transition+and+cell+death:+the+role+of+cyclophilin+d.">Mitochondrial permeability transition and cell death: the role of cyclophilin d.</a> Frontiers in Physiology. 4, 76 (2013).</li><li>Dorn, G. 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Evidence that the pore can be opened by membrane depolarization.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (13), 8834-8839 (1992).</li><li>Petronilli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+voltage+sensor+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+is+tuned+by+the+oxidation-reduction+state+of+vicinal+thiols.+Increase+of+the+gating+potential+by+oxidants+and+its+reversal+by+reducing+agents.">The voltage sensor of the mitochondrial permeability transition pore is tuned by the oxidation-reduction state of vicinal thiols. Increase of the gating potential by oxidants and its reversal by reducing agents.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16638-16642 (1994).</li><li>Giorgio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+binding+to+F-ATP+synthase+beta+subunit+triggers+the+mitochondrial+permeability+transition.">Ca(2+) binding to F-ATP synthase beta subunit triggers the mitochondrial permeability transition.</a> European Molecular Biology Organization Reports. 18 (7), 1065-1076 (2017).</li><li>Halestrap, A. P., Woodfield, K. Y., Connern, C. 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本稿では、mPTPのオープン確率を評価する方法について述べる。具体的には、低コンダクタンスmPTPオープニングの電圧閾値は、ΔΨの範囲にわたるプロトンリークに対するCsA阻害の影響を評価することによって決定された。この技術を用いて、FXSマウスとFVB対照との間のmPTPの電圧ゲーティングの違いを、組織特異的CoQ含量の違いと一致するように同定することができた。この方法論の成功に不...

mPTPは透過性遷移(PT)を媒介し、それによってIMMは小分子および溶質1,2に対して突然透過性になる。この顕著な現象は、酸化的リン酸化3に必要な電気化学的勾配を確立するための基本であるIMMの特徴的な不透過性からの明確な逸脱である。PTは、他のミトコンドリア輸送機構とは異なり、高コンダクタンス、非特異的、および非選択的プロセスであり、最大1.5kDa4、5の範囲の分子の通過を可能にする。mPTPはIMM内の電位依存性チャネルであり、その開口部はΔΨ、ATP産生、カルシウム恒常性、活性酸素種(ROS)産生、および細胞生存率4を変化させる。
病理学的極限では、mPTPの制御不能で長期にわたる高コンダクタンス開口部は、電気化学的勾配の崩壊、マトリックス腫脹、マトリックスピリジンヌクレオチドの枯渇、外膜破裂、膜間タンパク質(シトクロムcを含む)の放出、および最終的には細胞死4,6をもたらす。このような病理学的mPTP開口は、心臓虚血・再灌流傷害、心不全、外傷性脳損傷、種々の神経変性疾患、および糖尿病に関与している1、7。しかしながら、低コンダクタンスmPTP開口は本質的に生理学的であり、高コンダクタンス開口とは対照的に、深い脱分極またはミトコンドリア腫脹をもたらさない4。
細孔の低コンダクタンス開口部は、透過性を〜300Daに制限し、ATP合成とは無関係にプロトンの通過を可能にし、そして生理学的プロトンリーク5の潜在的な発生源である。生理学的mPTP開口は、ΔΨの制御された減少を引き起こし、呼吸輸送鎖を通る電子流束を増加させ、スーパーオキシドの短いバーストまたはフラッシュをもたらし、ROSシグナル伝達に寄与する8。このような一過性のmPTP開口の調節は、カルシウム恒常性ならびに正常な細胞発生および成熟にとって重要である4、9、10、11。例えば、発達中のニューロンにおける一過性の細孔開放は分化を誘発し、一方、mPTPの閉鎖は未熟心筋細胞における成熟を誘導する4,5。
健康と疾患におけるmPTPの機能的意義は十分に確立されているが、その正確な分子的同一性は依然として議論されている。mPTPの分子構造と機能に関する進歩は、他の場所で包括的にレビューされている12。簡単に言えば、現在、mPTPの高コンダクタンス状態および低コンダクタンス状態は、別個の実体12によって媒介されると仮定されている。主要な候補は、それぞれ高コンダクタンスモードおよび低コンダクタンスモード用のF1/F0 ATP合成酵素(ATP合成酵素)およびアデニンヌクレオチドトランスポーター(ANT)である12。
mPTPの孔形成成分の正確な同一性に関するコンセンサスの欠如にもかかわらず、特定の重要な特性が詳述されている。mPTPの十分に確立された特徴は、IMMの脱分極が細孔開口部13につながるように電気化学的勾配によって調節されることである。以前の研究は、ビシナルチオール基の酸化還元状態がmPTPの電圧ゲーティングを変化させ、酸化が比較的高いΔΨsで細孔を開き、チオール基の減少が閉mPTP確率をもたらすことを示している14。しかしながら、タンパク質性電圧センサの同一性は不明である。
細孔の開放確率を調節する様々な小分子が同定されている。例えば、mPTPは、カルシウム、無機リン酸、脂肪酸、およびROSで開くように刺激することができ、アデニンヌクレオチド(特にADP)、マグネシウム、プロトン、およびCsA5、12によって阻害され得る。これらの調節因子のいくつかの作用機序が解明されている。ミトコンドリアカルシウムは、ATP合成酵素15のβサブユニットに結合することによって少なくとも部分的にmPTP開口を誘発する。ROSは、ADPに対する親和性を低下させ、最も研究されたタンパク質性mPTP活性化剤16であるサイクロフィリンD(CypD)に対する親和性を増強することによって、mPTPを活性化することができる。無機リン酸や脂肪酸によるmPTPの活性化のメカニズムはあまり明らかではない。内因性阻害剤については、ADPはANTまたはATP合成酵素で結合することによってmPTPを阻害すると考えられ、マグネシウムはその結合部位からカルシウムを置換することによってその阻害効果を発揮すると考えられている15,17,18,19。
低pHは、ATP合成酵素12、20、21の調節オリゴマイシン感受性付与タンパク質(OSCP)サブユニットのヒスチジン112をプロトン化することによってmPTP開口を阻害する。mPTPのプロトタイプ薬理学的阻害剤であるCsAは、CypDを結合させ、OSCP22,23との会合を予防することによって作用する。これまでの研究はまた、様々なCoQ類似体がmPTPと相互作用し、それを阻害または活性化することを示した24。最近の研究では、新生児FXSマウス仔の前脳ミトコンドリアにおけるCoQ欠損による病理学的に開放的なmPTP、過剰なプロトン漏出、および非効率的な酸化的リン酸化の証拠を発見した25。
外因性CoQによる細孔の閉鎖は、病的陽子漏出を遮断し、樹状突起棘25の形態学的成熟を誘導した。興味深いことに、同じ動物において、FXS心筋細胞は、野生型対照と比較して過剰なCoQレベルおよび閉mPTP確率を有していた26。CoQレベルのこれらの組織特異的な差異の原因は不明であるが、この知見は、内因性CoQがmPTPの主要な調節因子である可能性が高いという概念を強調している。しかし、mPTPのCoQ媒介性阻害のメカニズムは不明のままであるため、我々の知識には大きなギャップがある。
mPTPの調節は、細胞シグナル伝達および生存の重要な決定因子である4。したがって、ミトコンドリア内のmPTP開口部を検出することは、特定の病態生理学的メカニズムを考える際に重要である。典型的には、高コンダクタンス細孔開口の閾値は、透過性遷移をトリガするためにカルシウムを用いて決定される。このようなカルシウム負荷は、膜電位の崩壊、酸化的リン酸化の急速な脱結合、およびミトコンドリア腫脹27、28をもたらす。我々は、低コンダクタンスmPTPの開口部を その場で、 それ自体を誘導することなく検出する方法の開発を目指し た。
このアプローチは、プロトンリークチャネルとしてのmPTPの役割を利用する。そうするために、クラーク型およびTPP+ イオン選択電極を用いて、漏出呼吸中の単離ミトコンドリアにおける酸素消費量および膜電位をそれぞれ同時に測定した29。mPTP開口の閾値は、特定の膜電位におけるプロトンリークのCsA媒介性阻害の開始によって決定された。このアプローチを用いて、CoQ過剰の文脈におけるmPTPの電圧ゲーティングの違いが正確に定義された。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1</td>
			<td>PP systems</td>
			<td>941039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-11B</td>
			<td>to modify the length of the hamilton synringe as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm</td>
			<td>World Precision Inst. LLC</td>
			<td>DRIREF-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Holder for KWIK-Tips</td>
			<td>World Precision Inst. LLC</td>
			<td>KWIK-2</td>
			<td>&#160;ion selective electrode holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid&#160; (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J</td>
			<td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td></td>
			<td>FXS mice, Fmr1 KO&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ</td>
			<td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td></td>
			<td>FVB mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07938-30</td>
			<td>microsyringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07938-02</td>
			<td>microsyringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete</td>
			<td>PP systems</td>
			<td>OXYTHERM+R</td>
			<td>oxygen electrode and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1374248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9546-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1,P5-diadenosine-5&#8242; pentaphosphate pentasodium (AP5A)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4022-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1644</td>
			<td>medium for density gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5.43841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP+ Electrode Tips (3)</td>
			<td>World Precision Inst. LLC</td>
			<td>TIPTPP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of open probability of the mitochondrial permeability transition pore in the setting of coenzyme q excess

ミトコンドリア透過性遷移孔(mPTP)は、健康と病気に重要な電位依存性の非選択的、内側ミトコンドリア膜(IMM)メガチャネルです。mPTPは、低コンダクタンス開口時にIMMを横切る陽子の漏れを媒介し、シクロスポリンA(CsA)によって特異的に阻害される。コエンザイムQ(CoQ)はmPTPの調節因子であり、脆弱X症候群(FXS、 Fmr1 ノックアウト)の新生児マウスモデルにおける前脳および心臓ミトコンドリアにおけるmPTPのCoQ含有量およびオープン確率において組織特異的な差異が見出されている。我々は、この変異株におけるmPTP開口の電圧閾値を決定する技術を開発し、プロトンリークチャネルとしてのmPTPの役割を利用した。
これを行うために、酸素消費量と膜電位(ΔΨ)は、漏れ呼吸中にポラログラフィーとテトラフェニルホスホニウム(TPP+)イオン選択電極を使用して、単離されたミトコンドリアで同時に測定されました。mPTP開口の閾値は、特定の膜電位におけるプロトンリークのCsA媒介性阻害の開始によって決定された。このアプローチを使用して、mPTPの電圧ゲーティングの違いは、CoQ過剰の文脈で正確に定義されました。この新規技術は、mPTPの低コンダクタンス開口部の生理学的および病理学的調節の理解を深めるための将来の研究を可能にするであろう。

これらの実験で生成された典型的なO2消費量およびΔΨ曲線が示されている(図1A、B)。TPP+キャリブレーションによる電圧信号の対数低下は、各実験の開始時に示されています。この対数パターンがないことは、TPP+選択電極の問題を示唆している可能性がある。ミトコンドリアは、典型的には、呼吸緩衝液への添加直後にΔΨを生成する...

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Assessment of Open Probability of the Mitochondrial Permeability Transition Pore in the Setting of Coenzyme Q Excess

この方法は、低コンダクタンスプロトンリークに対するミトコンドリア透過性遷移細孔の寄与を利用して、野生型対照と比較して心筋細胞ミトコンドリアコエンザイムQ含量が増加した新生児脆弱X症候群マウスにおける細孔開放の電圧閾値を決定する。

コエンザイムQ過剰の設定におけるミトコンドリア透過性転移細孔の開放確率の評価

The mitochondrial permeability transition pore (mPTP) is a voltage-gated, nonselective, inner mitochondrial membrane (IMM) mega-channel important in ...

このプロトコルは、ミトコンドリア透過性遷移細孔の低コンダクタンス開口部を調査する新しい方法を提供する。この技術の主な利点は、ミトコンドリア膜電位の関数として孔の開放確率を測定する簡単な方法を提供することである。この技術は、任意の器官系および種から単離されたミトコンドリアに容易に適用することができる。酸素電極の校正は、電極ディスクのドームの上に50%塩化カリウム電解質溶液を滴下して開始します。電解質滴の上に、わずかに大きいポリテトラフルオロエチレン膜で覆われた2平方センチメートルのタバコ紙スペーサーの小片を置く。次に、アプリケーターツールを使用して、小さな電極ディスクOリングを電極のドームに押し込みます。次に、電解液で貯水池をよく補充します。大きなOリングを電極ディスクの周りの凹部によく置きます。次に、ディスクを電極チャンバーに取り付け、コントロールユニットに接続します。2ミリリットルの空気飽和脱イオン水、およびポリテトラフルオロエチレン被覆磁石を反応チャンバに加える。完了したら、チャンバーをコントロールユニットの背面に接続します。温度を摂氏37度に設定し、攪拌速度を100に設定します。校正前にシステム温度を10分間平衡化させます。正しい温度、攪拌速度、および圧力を確認した後、[校正]タブで[液相校正]オプションを選択して液相校正を実行します。次に、OKを押して、信号がプラトーするのを待ちます。プラトーに到達したら、OKを押します。次に、約20ミリグラムの亜ジチオン酸ナトリウムを加えて、チャンバー内にゼロ酸素を確立する。もう一度OKを押し、信号がプラトーするのを待ってから、[保存]ボタンをクリックしてキャリブレーションを受け入れます。テトラフェニルホスホニウムまたはTPP選択的電極アセンブリを調製するには、シリンジおよび柔軟な針を使用して、TPP選択的電極チップを10ミリモルのTPP溶液で充填する。電極先端を充填している間は気泡を避けてください。電極ホルダーキャップを緩めて、内部参照電極をTPPチップに挿入します。完了したら、参照電極と電極ホルダーを含むTPP選択電極装置を組み立てます。キャップを締めて先端を固定します。次に、ケーブルをコントロールボックスの補助ポートとTPP電極ホルダーに接続します。TPP選択電極と参照電極をイオン選択電極用の適合プランジャーアセンブリに挿入します。参照電極をコントロールボックスの参照ポートに接続します。次に、反応チャンバを作製し、気泡を生じさせることなく反応混合物を1ミリリットルの反応チャンバに加える。TPP選択電極と参照電極を配置した適合プランジャーアセンブリを使用してチャンバを閉じます。チャンバーが閉じられたら、プラスチックチューブで修飾された別のマイクロシリンジを使用して、追加の試薬を反応チャンバーに直接導入します。セットアップの準備ができたら、[移動] を選択して記録を開始します。安定した電圧信号が得られたら、0.1ミリモルのTPP溶液を1マイクロモル刻みで加えてTPP選択電極を較正し、3マイクロモルの最終濃度を達成する。TPP電圧信号が加算されるたびに対数的に低下する様子を観察します。微量の酸素およびTPPを安定化させた後、プランジャーアセンブリ内の試薬添加口を介して、新たに調製した心筋細胞ミトコンドリア100マイクログラムを反応チャンバに最終濃度0.1ミリグラム/ミリリットルで加える。ミトコンドリアが活性化し、酸素を消費するにつれて、チャンバー内の酸素レベルの低下を観察します。また、ミトコンドリアが膜電位を生成し、溶液からTPPを取り込むにつれて、TPP電圧信号の急激な増加を見てください。次いで、オリゴマイシン1ミリリットル当たり2.5マイクログラムを加えて、状態4呼吸を誘導する。ミトコンドリア透過性移行孔、またはmPTPの開放確率を評価するために、漏れ呼吸中の時間にわたる膜電位の低下を観察する。所望の膜電位に達したら、mPTP阻害剤として1マイクロモルのシクロスポリンAを反応チャンバに追加して、その特定の膜電位におけるmPTPの開放確率を評価する。次に、シクロスポリンA添加前後の酸素消費量および膜電位に対するシクロスポリンAの効果を測定する。同時酸素消費量と膜電位の代表的な曲線では、2つのマイクロモルTPP較正レベルに対して、高い膜電位をゼロ、中間を5、10ミリボルトで低く設定した。0ミリボルトのミトコンドリアは100%mPTPの閉確率を示し、10ミリボルトのミトコンドリアは100%の開確率を示した。オリゴマイシン添加後、酸素消費量に有意な差は認められず、アデノシン三リン酸またはATP合成酵素が状態2呼吸に最小限に寄与することが示唆された。また、シクロスポリンA添加前後の酸素消費量と膜電位を比較した。酸素消費速度の低下および膜電位の安定化の増加は、開放mPTPの閉鎖を示した。mPTPが閉じられると、酸素消費速度の低下はなく、膜電位は低下し続けた。結果は、FVB対照およびFmr1ノックアウト心臓ミトコンドリアにおける高および低膜電位における同様の閉および開放mPTP確率を実証した。中間膜電位において、Fmr1ノックアウト心臓ミトコンドリアは、FVB対照と比較して閉閉mPTP確率の増加を示した。気泡をチャンバに導入してはならないのは、酸素消費量の読み取り値が不安定になり、解釈が困難になるためです。この手順に従って、カルシウム負荷容量を測定することができる。この方法は、細孔の高いコンダクタンス開口部を評価し、当社の技術の結果を補完します。

Research

JoVE Journal

Biology

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