Name: assessment of open probability of the mitochondrial permeability transition pore in the setting of coenzyme q excess
Uploaded: 2022-06-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Open Probability of the Mitochondrial Permeability Transition Pore in the Setting of Coenzyme Q Excess at JoVE.com

Dette arbeidet støttes av følgende tilskudd: NIH/NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), Columbia University Irving Medical Center Target of Opportunity Provost award til Institutt for anestesiologi (K.K.G.), Society of Pediatric Anesthesia Young Investigator Research Award (K.K.G.) og NIH/NINDS R01NS112706 (R.J.L.G.)

Institutional Animal Care and Use Committee of Columbia University Medical Center godkjenning ble oppnådd for alle metoder beskrevet. FXS (Fmr1 KO) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J) og kontroll (FVB) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ) mus som brukes som modellsystemer for denne studien ble kommersielt anskaffet (se materialtabellen). Fem til elleve dyr ble brukt i hver eksperimentell gruppe. Postnatal dag 10 (P10) mus ble brukt til å mo...

<ol>
	<li>Rasola, A., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+permeability+transition+pore+and+its+involvement+in+cell+death+and+in+disease+pathogenesis.">The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis.</a> Apoptosis. 12 (5), 815-833 (2007).</li><li>Szab&#243;, I., Zoratti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+megachannel+is+the+permeability+transition+pore.">The mitochondrial megachannel is the permeability transition pore.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 24, 111-117 (1992).</li><li>Brand, M., Ferguson, S., Nunnari, J., K&#252;hlbrandt, W., Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. 14, 767-830 (2002).</li><li>Perez, M. J., Quintanilla, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+or+disease:+duality+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">Development or disease: duality of the mitochondrial permeability transition pore.</a> Developmental Biology. 426 (1), 1-7 (2017).</li><li>Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+pathological+roles+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+in+the+heart.">Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart.</a> Cell Metabolism. 21 (2), 206-214 (2015).</li><li>Javadov, S., Kuznetsov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+permeability+transition+and+cell+death:+the+role+of+cyclophilin+d.">Mitochondrial permeability transition and cell death: the role of cyclophilin d.</a> Frontiers in Physiology. 4, 76 (2013).</li><li>Dorn, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+non-apoptotic+programmed+cell+death+in+diabetes+and+heart+failure.">Mechanisms of non-apoptotic programmed cell death in diabetes and heart failure.</a> Cell Cycle. 9 (17), 3442-3448 (2010).</li><li>Boyman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore:+Transient+and+permanent+opening+events.">Dynamics of the mitochondrial permeability transition pore: Transient and permanent opening events.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 666, 31-39 (2019).</li><li>Hom, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+transition+pore+controls+cardiac+mitochondrial+maturation+and+myocyte+differentiation.">The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte differentiation.</a> Developmental Cell. 21 (3), 469-478 (2011).</li><li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+superoxide+production+negatively+regulates+neural+progenitor+proliferation+and+cerebral+cortical+development.">Mitochondrial superoxide production negatively regulates neural progenitor proliferation and cerebral cortical development.</a> Stem Cells. 30 (11), 2535-2547 (2012).</li><li>Elrod, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophilin+D+controls+mitochondrial+pore-dependent+Ca(2+)+exchange,+metabolic+flexibility,+and+propensity+for+heart+failure+in+mice.">Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca(2+) exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3680-3687 (2010).</li><li>Bonora, M., Giorgi, C., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+consequences+of+mitochondrial+permeability+transition.">Molecular mechanisms and consequences of mitochondrial permeability transition.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2021).</li><li>Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+mitochondrial+cyclosporin+A-sensitive+permeability+transition+pore+by+the+proton+electrochemical+gradient.+Evidence+that+the+pore+can+be+opened+by+membrane+depolarization.">Modulation of the mitochondrial cyclosporin A-sensitive permeability transition pore by the proton electrochemical gradient. Evidence that the pore can be opened by membrane depolarization.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (13), 8834-8839 (1992).</li><li>Petronilli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+voltage+sensor+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+is+tuned+by+the+oxidation-reduction+state+of+vicinal+thiols.+Increase+of+the+gating+potential+by+oxidants+and+its+reversal+by+reducing+agents.">The voltage sensor of the mitochondrial permeability transition pore is tuned by the oxidation-reduction state of vicinal thiols. Increase of the gating potential by oxidants and its reversal by reducing agents.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16638-16642 (1994).</li><li>Giorgio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+binding+to+F-ATP+synthase+beta+subunit+triggers+the+mitochondrial+permeability+transition.">Ca(2+) binding to F-ATP synthase beta subunit triggers the mitochondrial permeability transition.</a> European Molecular Biology Organization Reports. 18 (7), 1065-1076 (2017).</li><li>Halestrap, A. P., Woodfield, K. Y., Connern, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress,+thiol+reagents,+and+membrane+potential+modulate+the+mitochondrial+permeability+transition+by+affecting+nucleotide+binding+to+the+adenine+nucleotide+translocase.">Oxidative stress, thiol reagents, and membrane potential modulate the mitochondrial permeability transition by affecting nucleotide binding to the adenine nucleotide translocase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3346-3354 (1997).</li><li>Szabo, I., Bernardi, P., Zoratti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+mitochondrial+megachannel+by+divalent+cations+and+protons.">Modulation of the mitochondrial megachannel by divalent cations and protons.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (5), 2940-2946 (1992).</li><li>Karch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mitochondrial+permeability+transition+by+deletion+of+the+ANT+family+and+CypD.">Inhibition of mitochondrial permeability transition by deletion of the ANT family and CypD.</a> Science Advances. 5 (8), (2019).</li><li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+uncoupling+channel+within+the+c-subunit+ring+of+the+F1FO+ATP+synthase+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 10580-10585 (2014).</li><li>Antoniel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+histidine+in+OSCP+subunit+of+F-ATP+synthase+mediates+inhibition+of+the+permeability+transition+pore+by+acidic+pH.">The unique histidine in OSCP subunit of F-ATP synthase mediates inhibition of the permeability transition pore by acidic pH.</a> European Molecular Biology Organization Reports. 19 (2), 257-268 (2018).</li><li>Haworth, R. A., Hunter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ca2+-induced+membrane+transition+in+mitochondria.+II.+Nature+of+the+Ca2++trigger+site.">The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 195 (2), 460-467 (1979).</li><li>Halestrap, A. P., Connern, C. P., Griffiths, E. J., Kerr, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporin+A+binding+to+mitochondrial+cyclophilin+inhibits+the+permeability+transition+pore+and+protects+hearts+from+ischaemia/reperfusion+injury.">Cyclosporin A binding to mitochondrial cyclophilin inhibits the permeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusion injury.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 174 (1-2), 167-172 (1997).</li><li>Giorgio, V., Fogolari, F., Lippe, G., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OSCP+subunit+of+mitochondrial+ATP+synthase:+role+in+regulation+of+enzyme+function+and+of+its+transition+to+a+pore.">OSCP subunit of mitochondrial ATP synthase: role in regulation of enzyme function and of its transition to a pore.</a> British Journal of Pharmacology. 176 (22), 4247-4257 (2019).</li><li>Fontaine, E., Ichas, F., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ubiquinone-binding+site+regulates+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">A ubiquinone-binding site regulates the mitochondrial permeability transition pore.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (40), 25734-25740 (1998).</li><li>Griffiths, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+thermogenic+mitochondrial+respiration+due+to+futile+proton+leak+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Inefficient thermogenic mitochondrial respiration due to futile proton leak in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 34 (6), 7404-7426 (2020).</li><li>Barajas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+newborn+Fmr1+knockout+mouse:+a+novel+model+of+excess+ubiquinone+and+closed+mitochondrial+permeability+transition+pore+in+the+developing+heart.">The newborn Fmr1 knockout mouse: a novel model of excess ubiquinone and closed mitochondrial permeability transition pore in the developing heart.</a> Pediatric Research. 89 (3), 456-463 (2021).</li><li>Parks, R. J., Murphy, E., Liu, J. C., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 187-196 (2018).</li><li>Carraro, M., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+membrane+permeability+and+the+mitochondrial+permeability+transition.">Measurement of membrane permeability and the mitochondrial permeability transition.</a> Methods in Cell Biology. 155, 369-379 (2020).</li><li>Affourtit, C., Wong, H., Brand, M. D., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 157-170 (2018).</li><li>Teodoro, J. S., Palmeira, C. M., Rolo, A. P., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 109-119 (2018).</li><li>Neginskaya, M. A., Pavlov, E. V., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+properties+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pores:+Channel+diversity+and+disease+implication.">Electrophysiological properties of the mitochondrial permeability transition pores: Channel diversity and disease implication.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1862 (3), 148357 (2021).</li><li>Zoratti, M., Szabo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+permeability+transition.">The mitochondrial permeability transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1241 (2), 139-176 (1995).</li><li>Yajuan, X., Xin, L., Zhiyuan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+performance+and+application+differences+between+manual+and+automated+patch-clamp+techniques.">A comparison of the performance and application differences between manual and automated patch-clamp techniques.</a> Current Chemical Genomics. 6, 87-92 (2012).</li><li>Petronilli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+long-lasting+openings+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+can+be+monitored+directly+in+intact+cells+by+changes+in+mitochondrial+calcein+fluorescence.">Transient and long-lasting openings of the mitochondrial permeability transition pore can be monitored directly in intact cells by changes in mitochondrial calcein fluorescence.</a> Biophysical Journal. 76 (2), 725-734 (1999).</li></ol>

Dette dokumentet beskriver en metode for å vurdere den åpne sannsynligheten for mPTP. Spesielt ble spenningsterskelen for mPTP-åpning med lav ledning bestemt ved å vurdere effekten av CsA-hemming på protonlekkasje over en rekke ΔΨs. Ved hjelp av denne teknikken kunne vi identifisere forskjeller i spenningsgambling av mPTP mellom FXS-mus og FVB-kontroller i samsvar med deres forskjeller i vevsspesifikt CoQ-innhold. Kritisk for suksessen til denne metoden er at mitokondrier er nyisolert før bruk og er av god kvalit...

mPTP formidler permeabilitetsovergangen (PT), der IMM brått blir gjennomtrengelig for små molekyler og løsemidler 1,2. Dette slående fenomenet er et tydelig avvik fra IMM's karakteristiske impermeabilitet, noe som er grunnleggende for å etablere den elektrokjemiske gradienten som er nødvendig for oksidativ fosforylering3. PT, i motsetning til andre mitokondrietransportmekanismer, er en høylednings-, ikke-spesifikk og ikke-selektiv prosess, slik at passasjen av en rekke molekyler opp til 1,5 kDa 4,5. mPTP er en spenningsportert kanal i IMM hvis åpning endrer ΔΨ, ATP-produksjon, kalsium homeostase, reaktiv oksygenarter (ROS) produksjon og celle levedyktighet4.
Ved den patologiske ekstreme, ukontrollerte og langvarige høyledningsåpningen av mPTP fører til sammenbrudd av den elektrokjemiske gradienten, matrise hevelse, uttømming av matrise pyridin nukleotider, ytre membranbrudd, frigjøring av intermembrane proteiner (inkludert cytokrom c), og til slutt celledød 4,6. Slik patologisk mPTP-åpning har vært involvert i hjerte-iskemi-reperfusjonsskade, hjertesvikt, traumatisk hjerneskade, ulike nevrodegenerative sykdommer og diabetes 1,7. Imidlertid er lavlednings mPTP-åpning fysiologisk i naturen, og i motsetning til høyledningsåpning fører det ikke til dyp depolarisering eller mitokondrie hevelse4.
Lavledningsåpning av poren begrenser permeabiliteten til ~ 300 Da, tillater passasje av protoner uavhengig av ATP-syntese, og er en potensiell kilde til fysiologisk protonlekkasje5. Fysiolog mPTP-åpning forårsaker en kontrollert nedgang i ΔΨ, øker elektronstrømmen gjennom luftveiene i transportkjeden, og resulterer i en kort utbrudd eller blits av superoksid, noe som bidrar til ROS-signalering8. Regulering av slik forbigående mPTP-åpning er viktig for kalsium homeostase og normal cellulær utvikling og modning 4,9,10,11. Forbigående poreåpning i utvikling av nevroner utløser for eksempel differensiering, mens lukkingen av mPTP induserer modning i umodne kardiomyocytter 4,5.
Selv om den funksjonelle betydningen av mPTP i helse og sykdom er godt etablert, forblir den nøyaktige molekylære identiteten debattert. Fremdriften på mPTPs molekylære struktur og funksjon er grundig gjennomgått andre steder12. Kort sagt, for tiden har høy- og lavledningstilstander av mPTP blitt hypoteset om å bli formidlet av forskjellige enheter12. De ledende kandidatene er F1/F0 ATP syntase (ATP syntase) og adenin nukleotidtransportør (ANT) for høy- og lavledningsmodus, henholdsvis12.
Til tross for mangel på konsensus om den eksakte identiteten til den poredannende komponenten i mPTP, har visse nøkkelegenskaper blitt detaljert. Et veletablert trekk ved mPTP er at den er regulert av den elektrokjemiske gradienten slik at depolarisering av IMM fører til poreåpning13. Tidligere arbeid har vist at redokstilstanden til vicinal tiolgrupper endrer spenningsstrømmingen av mPTP, slik at oksidasjon åpner poren ved relativt høyere ΔΨs, og thiolgruppereduksjon resulterer i lukket mPTP-sannsynlighet14. Identiteten til den proteinholdige spenningssensoren er imidlertid ukjent.
Ulike små molekyler som modulerer porens åpne sannsynlighet er identifisert. For eksempel kan mPTP stimuleres til å åpne med kalsium, uorganisk fosfat, fettsyrer og ROS og kan hemmes av adeninkjerner (spesielt ADP), magnesium, protoner og CsA 5,12. Virkningsmekanismene til noen av disse regulatorene har blitt belyst. Mitokondriekalsium utløser mPTP-åpning i det minste delvis ved å binde seg til β-underenheten til ATP-syntasen15. ROS kan aktivere mPTP ved å redusere affiniteten for ADP og forbedre affiniteten for cyklofilin D (CypD), den best studerte proteinholdige mPTP-aktivatoren16. Aktiveringsmekanismen for mPTP ved uorganisk fosfat og fettsyrer er mindre klar. Når det gjelder endogene hemmere, antas ADP å hemme mPTP ved binding ved ANT- eller ATP-syntase, mens magnesium utøver sin hemmende effekt ved å fortrenge kalsium fra bindingsstedet 15,17,18,19.
Lav pH hemmer mPTP-åpning ved å protonere histidin 112 av den regulatoriske oligomycinfølsomhetsgivende protein (OSCP) subenheten til ATP-syntasen 12,20,21. Den prototypiske farmakologiske hemmeren av mPTP, CsA, virker ved å binde CypD og forhindre dens tilknytning til OSCP22,23. Tidligere arbeid har også vist at en rekke CoQ-analoger samhandler med mPTP, hemmer det eller aktiverer det24. I nyere arbeid fant vi bevis på en patologisk åpen mPTP, overdreven protonlekkasje og ineffektiv oksidativ fosforylering på grunn av en CoQ-mangel i forebrain mitokondrier av nyfødte FXS-musevalper25.
Lukking av poren med eksogen CoQ blokkerte den patologiske protonlekkasjen og induserte morfologiske modenhet av dendrittiske spines25. Interessant nok, i de samme dyrene, hadde FXS kardiomyocytter overdreven CoQ-nivåer og lukket mPTP-sannsynlighet sammenlignet med wildtype-kontroller26. Selv om årsaken til disse vevsspesifikke forskjellene i CoQ-nivåer er ukjent, understreker funnene konseptet om at endogen CoQ sannsynligvis er en nøkkelregulator for mPTP. Imidlertid er det et stort gap i vår kunnskap fordi mekanismen for CoQ-mediert hemming av mPTP forblir ukjent.
Regulering av mPTP er en kritisk determinant for cellesignalering og overlevelse4. Dermed er det viktig å oppdage mPTP-åpning innen mitokondrier når man vurderer spesifikke patofysiologiske mekanismer. Vanligvis bestemmes terskelen for poreåpning med høy ledning ved hjelp av kalsium for å utløse permeabilitetsovergangen. Slik kalsiumbelastning fører til sammenbrudd av membranpotensialet, rask frakobling av oksidativ fosforylering og mitokondrie hevelse27,28. Vi forsøkte å utvikle en metode for å oppdage mPTP-åpning med lav ledning in situ, uten å indusere den i seg selv.
Tilnærmingen utnytter rollen til mPTP som en protonlekkasjekanal. For å gjøre dette ble Clark-Type og TPP+ ion-selektive elektroder brukt til samtidig å måle oksygenforbruk og membranpotensial, henholdsvis i isolerte mitokondrier under lekkasje respirasjon29. Terskelen for mPTP-åpning ble bestemt ved utbruddet av CsA-mediert hemming av protonlekkasje ved spesifikke membranpotensialer. Ved hjelp av denne tilnærmingen ble forskjeller i spenningsgambling av mPTP i sammenheng med CoQ-overskudd nøyaktig definert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1</td>
			<td>PP systems</td>
			<td>941039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-11B</td>
			<td>to modify the length of the hamilton synringe as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm</td>
			<td>World Precision Inst. LLC</td>
			<td>DRIREF-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Holder for KWIK-Tips</td>
			<td>World Precision Inst. LLC</td>
			<td>KWIK-2</td>
			<td>&#160;ion selective electrode holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid&#160; (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J</td>
			<td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td></td>
			<td>FXS mice, Fmr1 KO&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ</td>
			<td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td></td>
			<td>FVB mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07938-30</td>
			<td>microsyringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07938-02</td>
			<td>microsyringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete</td>
			<td>PP systems</td>
			<td>OXYTHERM+R</td>
			<td>oxygen electrode and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1374248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9546-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1,P5-diadenosine-5&#8242; pentaphosphate pentasodium (AP5A)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4022-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1644</td>
			<td>medium for density gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5.43841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP+ Electrode Tips (3)</td>
			<td>World Precision Inst. LLC</td>
			<td>TIPTPP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of open probability of the mitochondrial permeability transition pore in the setting of coenzyme q excess

Mitokondriepermeabilitetsporering (mPTP) er en spenningsportert, ikke-selektiv, indre mitokondriemembran (IMM) megakanal som er viktig for helse og sykdom. mPTP formidler lekkasje av protoner over IMM under åpning med lav ledningsevne og er spesielt hemmet av ciklosporin A (CsA). Coenzyme Q (CoQ) er en regulator av mPTP, og vevsspesifikke forskjeller har blitt funnet i CoQ-innhold og åpen sannsynlighet for mPTP i forebrain og hjerte mitokondrier i en nyfødt musemodell av skjøre X syndrom (FXS, Fmr1 knockout). Vi utviklet en teknikk for å bestemme spenningsterskelen for mPTP-åpning i denne mutantstammen, og utnytte rollen som mPTP som en protonlekkasjekanal.
For å gjøre dette ble oksygenforbruk og membranpotensial (ΔΨ) samtidig målt i isolert mitokondrier ved hjelp av polarografi og et tetrafenylfosfonium (TPP +) ion-selektiv elektrode under lekkasje respirasjon. Terskelen for mPTP-åpning ble bestemt ved utbruddet av CsA-mediert hemming av protonlekkasje ved spesifikke membranpotensialer. Ved hjelp av denne tilnærmingen ble forskjeller i spenningsgambling av mPTP nøyaktig definert i sammenheng med CoQ-overskudd. Denne nye teknikken vil tillate fremtidig undersøkelse for å forbedre forståelsen av fysiologisk og patologisk regulering av lavledningsåpning av mPTP.

Typisk O2-forbruk og ΔΨ kurver som genereres i disse eksperimentene, vises (figur 1A,B). Den logaritmiske nedgangen i spenningssignalet med TPP+-kalibrering vises ved starten av hvert eksperiment. Fraværet av dette logaritmiske mønsteret kan tyde på et problem med TPP+ selektiv elektrode. Mitokondrier genererer vanligvis ΔΨ umiddelbart etter tillegg til respiratorisk buffer. ΔΨ kan tolkes fra endringer i TPP+-spenning base...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Open Probability of the Mitochondrial Permeability Transition Pore in the Setting of Coenzyme Q Excess at JoVE.com

Assessment of Open Probability of the Mitochondrial Permeability Transition Pore in the Setting of Coenzyme Q Excess

Denne metoden utnytter bidraget fra mitokondriell permeabilitetsporering til protonlekkasje med lav ledning for å bestemme spenningsterskelen for poreåpning hos neonatale skjøre X syndrommus med økt kardiomyyocytt mitokondrie coenzyme Q-innhold sammenlignet med wildtype-kontroll.

Vurdering av åpen sannsynlighet for mitokondriell permeabilitetsovergang pore i innstillingen av koenzym Q overskudd

The mitochondrial permeability transition pore (mPTP) is a voltage-gated, nonselective, inner mitochondrial membrane (IMM) mega-channel important in ...

Denne protokollen gir en ny måte å undersøke den lave ledningsåpningen av mitokondriell permeabilitetspor. Den største fordelen med denne teknikken er at den gir en enkel måte å måle porens åpne sannsynlighet som en funksjon av mitokondriemembranpotensial. Denne teknikken kan lett brukes på mitokondrier isolert fra ethvert organsystem og arter.Begynn med kalibreringen av oksygenelektroden ved å plassere en dråpe på 50% kaliumkloridelektrolyttløsning på toppen av kuppelen på elektrodeskiven. Legg et lite stykke to kvadratcentimeter sigarettpapir spacer dekket med et litt større stykke polytetrafluoretylenmembran over elektrolyttdråpen. Bruk deretter applikatorverktøyet til å skyve O-ringen med den lille elektrodeskiven over elektrodens kuppel.Fyll deretter reservoaret godt med elektrolyttoppløsningen. Plasser den større O-ringen i utsparingen rundt elektrodeskiven godt. Monter deretter platen i elektrodekammeret, og koble den til kontrollenheten.Tilsett to milliliter luftmettet deionisert vann, og den polytetrafluoreetylenbelagte magneten til reaksjonskammeret. Når du er ferdig, kobler du kammeret til baksiden av kontrollenheten. Sett temperaturen til 37 grader Celsius, og rørehastigheten til 100.La systemtemperaturen likevekte i 10 minutter før kalibrering. Etter å ha sikret riktig temperatur, rørehastighet og trykk, velger du alternativet Væskefasekalibrering under Kalibrering-fanen for å utføre væskefasekalibrering. Trykk deretter ok, og vent til signalet er platået.Når platået er nådd, trykker du på OK. Tilsett deretter ca 20 milligram natriumdithionitt for å etablere null oksygen i kammeret. Trykk på OK igjen, og vent til signalet er platået før du klikker Lagre-knappen for å godta kalibreringen. For å forberede tetrafenylfosfoniet, eller TPP-selektiv elektrodemontering, fyll TPP-selektiv elektrodespiss med en 10 millimolar TPP-løsning ved hjelp av en sprøyte og en fleksibel nål.Unngå luftbobler mens du fyller elektrodespissen. Løsne elektrodeholderhetten for å sette den interne referanseelektroden inn i TPP-spissen. Når du er ferdig, monterer du TPP-selektive elektrodeapparatet, inkludert referanseelektroden og elektrodeholderen.Stram hetten for å feste spissen. Koble deretter kabelen til hjelpeporten på kontrollboksen og TPP-elektrodeholderen. Sett TPP-selektive og referanseelektroder inn i den tilpassede stempelenheten for ion-selektive elektroder.Koble referanseelektroden til referanseporten på kontrollboksen. Deretter, for å forberede reaksjonskammeret, legg til en milliliter av reaksjonsblandingen til reaksjonskammeret uten å skape luftbobler. Lukk kammeret ved hjelp av den tilpassede stempelenheten med TPP-selektive og referanseelektroder på plass.Når kammeret er lukket, innfør ekstra reagenser direkte i reaksjonskammeret ved hjelp av separate mikrosprøyter modifisert med plastrør. Når oppsettet er klart, velger du Gå til for å starte innspillingen. Når et stabilt spenningssignal er oppnådd, kalibrerer du TPP-selektiv elektroden ved å legge til en mikromolarøkning på en 0,1 millimolar TPP-løsning for å oppnå en endelig konsentrasjon på tre mikromolar.Vær oppmerksom på den logaritmiske nedgangen i TPP-spenningssignalet ved hvert tillegg. Etter å ha stabilisert oksygen- og TPP-spor, tilsett 100 mikrogram nytilberedte kardiomyocytt mitokondrier til reaksjonskammeret via reagenstilsetningsporten i stempelenheten til en endelig konsentrasjon på 0,1 milligram per milliliter. Vær oppmerksom på nedgangen i oksygennivået i kammeret når mitokondriene blir energiske og forbruker oksygen.Se også den brå økningen i TPP-spenningssignalet da mitokondriene genererer et membranpotensial og tar opp TPP fra løsningen. Tilsett deretter 2,5 mikrogram per milliliter oligomycin for å indusere state 4-åndedrett. For å vurdere den åpne sannsynligheten for mitokondriell permeabilitetsporering, eller mPTP, må du observere nedgangen i membranpotensialet over tid under lekkasje respirasjon.Når ønsket membranpotensial er nådd, tilsett en mikromolar ciklosporin A som en mPTP-hemmer til reaksjonskammeret for å vurdere den åpne sannsynligheten for mPTP ved det spesifikke membranpotensialet. Mål deretter effekten av ciklosporin A på oksygenforbruk og membranpotensial før og etter ciklosporin A tillegg. I de representative kurvene for samtidig oksygenforbruk og membranpotensial ble det satt et høyt membranpotensial på null, mellomliggende på fem og lavt på 10 millivolt i forhold til de to mikromolar TPP-kalibreringsnivået.Mitokondriene ved null millivolt viste 100% mPTP lukket sannsynlighet, og ved 10 millivolt viste 100% åpen sannsynlighet. Etter oligomycintilskudd ble det ikke observert en signifikant forskjell i oksygenforbruket, noe som tyder på at adenosin tripfosfat, eller ATP-syntase, bidrar minimalt til stats 2-åndedrett. Videre ble oksygenforbruket og membranpotensialet før og etter ciklosporin A-tilsetning sammenlignet.En reduksjon i oksygenforbruket og en økning i stabilisering av membranpotensialet indikerte lukking av en åpen mPTP. Når mPTP er stengt, var det ingen reduksjon i oksygenforbruket, og membranpotensialet fortsatte å falle. Resultatene viste lignende lukkede og åpne mPTP-sannsynligheter ved høye og lave membranpotensialer i FVB-kontrollen og Fmr1 knockout hjerte mitokondrier.Ved mellomliggende membranpotensial viste Fmr1 knockout hjerte mitokondrier økt lukket mPTP-sannsynlighet sammenlignet med FVB-kontrollene. Ingen luftbobler må innføres i kammeret, da dette vil føre til ustabile oksygenforbruksavlesninger, og gjøre tolkning vanskelig. Etter denne prosedyren kan kalsiumbelastningskapasitet måles.Denne metoden vurderer porensåpningen av porene, og utfyller resultatene av teknikken vår.

Research

JoVE Journal

Biology

The Structure of Skilled Forelimb Reaching in the Rat: A Movement Rating Scale

Skilled reaching for food is an evolutionary ancient act and is displayed by many animal species, including those in the sister clades of rodents and ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Multi-parameter Måling av permeabilitet Transition pore åpningen i Isolert Mouse Hjerte Mitokondrier

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Lev Imaging analysen for vurdering av roller av Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Og Sphingomyelinase i Reparasjon av poredannende Gift Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Vurdering av kalsium Sparks i Intakt skjelettmuskelfibre

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

Den<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocytter Cut-open vaselin Gap Voltage-klemme teknikk med fluorometri

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

Kvantifisering Enkeltmicrovessel Permeabilitet i Isolert Blood-perfundert Rat Lung Forberedelse

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Måling av osmosevann permeabilitetskoeffisient (P<sub&gt; F</sub&gt;) Av sfæriske Cells: Isolerte Plant Protoplaster som et eksempel

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...