Name: assessment of open probability of the mitochondrial permeability transition pore in the setting of coenzyme q excess
Uploaded: 2022-06-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Open Probability of the Mitochondrial Permeability Transition Pore in the Setting of Coenzyme Q Excess at JoVE.com

Эта работа поддерживается следующими грантами: NIH/ NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), Премия Медицинского центра Ирвинга Колумбийского университета Цель возможностей Provost для отделения анестезиологии (K.K.G.), Общество детской анестезии Young Investigator Research Award (K.K.G.) и NIH / NINDS R01NS112706 (R.J.L.)

Для всех описанных методов было получено одобрение Институционального комитета по уходу за животными и их использованию Медицинского центра Колумбийского университета. FXS (Fmr1 KO) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J) и контрольные (FVB) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ) мыши, используе?...

<ol>
	<li>Rasola, A., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+permeability+transition+pore+and+its+involvement+in+cell+death+and+in+disease+pathogenesis.">The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis.</a> Apoptosis. 12 (5), 815-833 (2007).</li><li>Szab&#243;, I., Zoratti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+megachannel+is+the+permeability+transition+pore.">The mitochondrial megachannel is the permeability transition pore.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 24, 111-117 (1992).</li><li>Brand, M., Ferguson, S., Nunnari, J., K&#252;hlbrandt, W., Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. 14, 767-830 (2002).</li><li>Perez, M. J., Quintanilla, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+or+disease:+duality+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">Development or disease: duality of the mitochondrial permeability transition pore.</a> Developmental Biology. 426 (1), 1-7 (2017).</li><li>Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+pathological+roles+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+in+the+heart.">Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart.</a> Cell Metabolism. 21 (2), 206-214 (2015).</li><li>Javadov, S., Kuznetsov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+permeability+transition+and+cell+death:+the+role+of+cyclophilin+d.">Mitochondrial permeability transition and cell death: the role of cyclophilin d.</a> Frontiers in Physiology. 4, 76 (2013).</li><li>Dorn, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+non-apoptotic+programmed+cell+death+in+diabetes+and+heart+failure.">Mechanisms of non-apoptotic programmed cell death in diabetes and heart failure.</a> Cell Cycle. 9 (17), 3442-3448 (2010).</li><li>Boyman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore:+Transient+and+permanent+opening+events.">Dynamics of the mitochondrial permeability transition pore: Transient and permanent opening events.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 666, 31-39 (2019).</li><li>Hom, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+transition+pore+controls+cardiac+mitochondrial+maturation+and+myocyte+differentiation.">The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte differentiation.</a> Developmental Cell. 21 (3), 469-478 (2011).</li><li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+superoxide+production+negatively+regulates+neural+progenitor+proliferation+and+cerebral+cortical+development.">Mitochondrial superoxide production negatively regulates neural progenitor proliferation and cerebral cortical development.</a> Stem Cells. 30 (11), 2535-2547 (2012).</li><li>Elrod, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophilin+D+controls+mitochondrial+pore-dependent+Ca(2+)+exchange,+metabolic+flexibility,+and+propensity+for+heart+failure+in+mice.">Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca(2+) exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3680-3687 (2010).</li><li>Bonora, M., Giorgi, C., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+consequences+of+mitochondrial+permeability+transition.">Molecular mechanisms and consequences of mitochondrial permeability transition.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2021).</li><li>Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+mitochondrial+cyclosporin+A-sensitive+permeability+transition+pore+by+the+proton+electrochemical+gradient.+Evidence+that+the+pore+can+be+opened+by+membrane+depolarization.">Modulation of the mitochondrial cyclosporin A-sensitive permeability transition pore by the proton electrochemical gradient. Evidence that the pore can be opened by membrane depolarization.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (13), 8834-8839 (1992).</li><li>Petronilli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+voltage+sensor+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+is+tuned+by+the+oxidation-reduction+state+of+vicinal+thiols.+Increase+of+the+gating+potential+by+oxidants+and+its+reversal+by+reducing+agents.">The voltage sensor of the mitochondrial permeability transition pore is tuned by the oxidation-reduction state of vicinal thiols. Increase of the gating potential by oxidants and its reversal by reducing agents.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16638-16642 (1994).</li><li>Giorgio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+binding+to+F-ATP+synthase+beta+subunit+triggers+the+mitochondrial+permeability+transition.">Ca(2+) binding to F-ATP synthase beta subunit triggers the mitochondrial permeability transition.</a> European Molecular Biology Organization Reports. 18 (7), 1065-1076 (2017).</li><li>Halestrap, A. P., Woodfield, K. Y., Connern, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress,+thiol+reagents,+and+membrane+potential+modulate+the+mitochondrial+permeability+transition+by+affecting+nucleotide+binding+to+the+adenine+nucleotide+translocase.">Oxidative stress, thiol reagents, and membrane potential modulate the mitochondrial permeability transition by affecting nucleotide binding to the adenine nucleotide translocase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3346-3354 (1997).</li><li>Szabo, I., Bernardi, P., Zoratti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+mitochondrial+megachannel+by+divalent+cations+and+protons.">Modulation of the mitochondrial megachannel by divalent cations and protons.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (5), 2940-2946 (1992).</li><li>Karch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mitochondrial+permeability+transition+by+deletion+of+the+ANT+family+and+CypD.">Inhibition of mitochondrial permeability transition by deletion of the ANT family and CypD.</a> Science Advances. 5 (8), (2019).</li><li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+uncoupling+channel+within+the+c-subunit+ring+of+the+F1FO+ATP+synthase+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 10580-10585 (2014).</li><li>Antoniel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+histidine+in+OSCP+subunit+of+F-ATP+synthase+mediates+inhibition+of+the+permeability+transition+pore+by+acidic+pH.">The unique histidine in OSCP subunit of F-ATP synthase mediates inhibition of the permeability transition pore by acidic pH.</a> European Molecular Biology Organization Reports. 19 (2), 257-268 (2018).</li><li>Haworth, R. A., Hunter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ca2+-induced+membrane+transition+in+mitochondria.+II.+Nature+of+the+Ca2++trigger+site.">The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 195 (2), 460-467 (1979).</li><li>Halestrap, A. P., Connern, C. P., Griffiths, E. J., Kerr, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporin+A+binding+to+mitochondrial+cyclophilin+inhibits+the+permeability+transition+pore+and+protects+hearts+from+ischaemia/reperfusion+injury.">Cyclosporin A binding to mitochondrial cyclophilin inhibits the permeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusion injury.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 174 (1-2), 167-172 (1997).</li><li>Giorgio, V., Fogolari, F., Lippe, G., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OSCP+subunit+of+mitochondrial+ATP+synthase:+role+in+regulation+of+enzyme+function+and+of+its+transition+to+a+pore.">OSCP subunit of mitochondrial ATP synthase: role in regulation of enzyme function and of its transition to a pore.</a> British Journal of Pharmacology. 176 (22), 4247-4257 (2019).</li><li>Fontaine, E., Ichas, F., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ubiquinone-binding+site+regulates+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">A ubiquinone-binding site regulates the mitochondrial permeability transition pore.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (40), 25734-25740 (1998).</li><li>Griffiths, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+thermogenic+mitochondrial+respiration+due+to+futile+proton+leak+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Inefficient thermogenic mitochondrial respiration due to futile proton leak in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 34 (6), 7404-7426 (2020).</li><li>Barajas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+newborn+Fmr1+knockout+mouse:+a+novel+model+of+excess+ubiquinone+and+closed+mitochondrial+permeability+transition+pore+in+the+developing+heart.">The newborn Fmr1 knockout mouse: a novel model of excess ubiquinone and closed mitochondrial permeability transition pore in the developing heart.</a> Pediatric Research. 89 (3), 456-463 (2021).</li><li>Parks, R. J., Murphy, E., Liu, J. C., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 187-196 (2018).</li><li>Carraro, M., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+membrane+permeability+and+the+mitochondrial+permeability+transition.">Measurement of membrane permeability and the mitochondrial permeability transition.</a> Methods in Cell Biology. 155, 369-379 (2020).</li><li>Affourtit, C., Wong, H., Brand, M. D., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 157-170 (2018).</li><li>Teodoro, J. S., Palmeira, C. M., Rolo, A. P., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 109-119 (2018).</li><li>Neginskaya, M. A., Pavlov, E. V., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+properties+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pores:+Channel+diversity+and+disease+implication.">Electrophysiological properties of the mitochondrial permeability transition pores: Channel diversity and disease implication.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1862 (3), 148357 (2021).</li><li>Zoratti, M., Szabo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+permeability+transition.">The mitochondrial permeability transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1241 (2), 139-176 (1995).</li><li>Yajuan, X., Xin, L., Zhiyuan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+performance+and+application+differences+between+manual+and+automated+patch-clamp+techniques.">A comparison of the performance and application differences between manual and automated patch-clamp techniques.</a> Current Chemical Genomics. 6, 87-92 (2012).</li><li>Petronilli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+long-lasting+openings+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+can+be+monitored+directly+in+intact+cells+by+changes+in+mitochondrial+calcein+fluorescence.">Transient and long-lasting openings of the mitochondrial permeability transition pore can be monitored directly in intact cells by changes in mitochondrial calcein fluorescence.</a> Biophysical Journal. 76 (2), 725-734 (1999).</li></ol>

В данной работе описан метод оценки открытой вероятности mPTP. В частности, порог напряжения для открытия mPTP с низкой проводимостью определяли путем оценки влияния ингибирования CsA на утечку протонов в диапазоне ΔΨs. Используя этот метод, мы смогли бы идентифицировать различия в напряжен...

mPTP опосредует переход проницаемости (PT), в результате чего IMM становится резко проницаемым для малых молекул ирастворяет 1,2. Это поразительное явление является явным отходом от характерной непроницаемости ИММ, которая имеет основополагающее значение для установления электрохимического градиента, необходимого для окислительного фосфорилирования3. ПТ, в отличие от других митохондриальных транспортных механизмов, представляет собой высокопроводящий, неспецифический и неселективный процесс, позволяющий проходить в диапазоне молекул до 1,5 кДа 4,5. mPTP представляет собой канал с напряжением внутри IMM, открытие которого изменяет ΔΨ, выработку АТФ, гомеостаз кальция, выработку активных форм кислорода (АФК) и жизнеспособность клеток4.
В патологическом крайнем случае неконтролируемое и длительное высокопроводящее открытие mPTP приводит к коллапсу электрохимического градиента, набуханию матрицы, истощению матриксных пиридиновых нуклеотидов, разрыву наружной мембраны, высвобождению межмембранных белков (включая цитохром c) и, в конечном счете, гибели клеток 4,6. Такое патологическое открытие mPTP было связано с сердечной ишемией-реперфузионным повреждением, сердечной недостаточностью, черепно-мозговой травмой, различными нейродегенеративными заболеваниями и диабетом 1,7. Однако открытие mPTP с низкой проводимостью носит физиологический характер и, в отличие от открытия с высокой проводимостью, не приводит к глубокой деполяризации или митохондриальному отеку4.
Низкопроводящее открытие поры ограничивает проницаемость до ~300 Да, позволяет проходить протонам независимо от синтеза АТФ и является потенциальным источником физиологической утечки протонов5. Физиологическое открытие mPTP вызывает контролируемое снижение ΔΨ, увеличивает поток электронов через дыхательную транспортную цепь и приводит к короткому всплеску или вспышке супероксида, способствуя передаче сигналов АФК8. Регуляция такого переходного открытия mPTP важна для гомеостаза кальция и нормального клеточного развития и созревания 4,9,10,11. Транзиторное открытие пор в развивающихся нейронах, например, запускает дифференцировку, в то время как закрытие mPTP индуцирует созревание в незрелых кардиомиоцитах 4,5.
Хотя функциональное значение mPTP в здоровье и болезнях хорошо известно, его точная молекулярная идентичность остается спорной. Прогресс в области молекулярной структуры и функции mPTP был всесторонне рассмотрен в другом месте12. Вкратце, в настоящее время предполагается, что состояния mPTP с высокой и низкой проводимостью опосредованы различными сущностями12. Ведущими кандидатами являются F1/F0 АТФ-синтаза (АТФ-синтаза) и транспортер адениннуклеотидов (ANT) для режимов высокой и низкой проводимости соответственно12.
Несмотря на отсутствие консенсуса относительно точной идентичности порообразующего компонента mPTP, некоторые ключевые характеристики были детализированы. Хорошо известной особенностью mPTP является то, что он регулируется электрохимическим градиентом таким образом, что деполяризация ИММ приводит к открытию пор13. Предыдущая работа показала, что окислительно-восстановительное состояние вицинальных тиольных групп изменяет напряжение мПТП, так что окисление открывает поры при относительно более высоких ΔΨs, а восстановление тиольной группы приводит к закрытой вероятности mPTP14. Однако идентичность белкового датчика напряжения неизвестна.
Были идентифицированы различные малые молекулы, которые модулируют открытую вероятность поры. Например, mPTP может быть стимулирован к открытию кальцием, неорганическими фосфатами, жирными кислотами и АФК и может ингибироваться адениннуклеотидами (особенно АДФ), магнием, протонами и CsA 5,12. Выяснены механизмы действия некоторых из этих регуляторов. Митохондриальный кальций вызывает открытие mPTP, по меньшей мере, частично путем связывания с β субъединицей АТФ-синтазы15. АФК может активировать mPTP, уменьшая его сродство к АДФ и усиливая его сродство к циклофилину D (CypD), наиболее изученному белковому активатору mPTP16. Механизм активации mPTP неорганическими фосфатами и жирными кислотами менее ясен. Что касается эндогенных ингибиторов, считается, что АДФ ингибирует mPTP путем связывания в ANT или АТФ-синтазе, в то время как магний оказывает свое ингибирующее действие, вытесняя кальций из его сайта связывания 15,17,18,19.
Низкий рН ингибирует открытие mPTP путем протонирования гистидина 112 регуляторной субъединицы белка, придающего чувствительность к олигомицину (OSCP) АТФ-синтазы 12,20,21. Прототип фармакологического ингибитора mPTP, CsA, действует путем связывания CypD и предотвращения его ассоциации с OSCP22,23. Предыдущая работа также показала, что различные аналоги CoQ взаимодействуют с mPTP, ингибируя его или активируя его24. В недавней работе мы обнаружили доказательства патологически открытого mPTP, чрезмерной утечки протонов и неэффективного окислительного фосфорилирования из-за дефицита CoQ в митохондриях переднего мозга новорожденных щенков мышей FXS25.
Закрытие пор экзогенным CoQ блокировало патологическую утечку протонов и индуцировало морфологическую зрелость дендритных шипов25. Интересно, что у тех же животных кардиомиоциты FXS имели чрезмерные уровни CoQ и закрытую вероятность mPTP по сравнению с контрольной группой дикого типа26. Хотя причина этих тканеспецифических различий в уровнях CoQ неизвестна, результаты подчеркивают концепцию, что эндогенный CoQ, вероятно, является ключевым регулятором mPTP. Тем не менее, существует большой пробел в наших знаниях, потому что механизм CoQ-опосредованного ингибирования mPTP остается неизвестным.
Регуляция mPTP является критическим фактором, определяющим клеточную сигнализацию и выживаемость4. Таким образом, обнаружение открытия mPTP в митохондриях является ключевым при рассмотрении конкретных патофизиологических механизмов. Как правило, порог для открытия пор с высокой проводимостью определяется с использованием кальция для запуска перехода проницаемости. Такая кальциевая нагрузка приводит к коллапсу мембранного потенциала, быстрому разъединению окислительного фосфорилирования и митохондриальному набуханию27,28. Мы стремились разработать метод обнаружения открытия mPTP in situ с низкой проводимостью, не вызывая его как такового.
Этот подход использует роль mPTP в качестве канала утечки протонов. Для этого были использованы ионселективные электроды Типа Кларка и TPP+ для одновременного измерения потребления кислорода и мембранного потенциала, соответственно, в изолированных митохондриях во время утечного дыхания29. Порог вскрытия mPTP определяли по началу CsA-опосредованного ингибирования утечки протонов при специфических мембранных потенциалах. Используя этот подход, были точно определены различия в напряжении платы mPTP в контексте превышения CoQ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1</td>
			<td>PP systems</td>
			<td>941039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-11B</td>
			<td>to modify the length of the hamilton synringe as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm</td>
			<td>World Precision Inst. LLC</td>
			<td>DRIREF-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Holder for KWIK-Tips</td>
			<td>World Precision Inst. LLC</td>
			<td>KWIK-2</td>
			<td>&#160;ion selective electrode holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid&#160; (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J</td>
			<td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td></td>
			<td>FXS mice, Fmr1 KO&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ</td>
			<td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td></td>
			<td>FVB mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07938-30</td>
			<td>microsyringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07938-02</td>
			<td>microsyringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete</td>
			<td>PP systems</td>
			<td>OXYTHERM+R</td>
			<td>oxygen electrode and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1374248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9546-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1,P5-diadenosine-5&#8242; pentaphosphate pentasodium (AP5A)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4022-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1644</td>
			<td>medium for density gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5.43841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP+ Electrode Tips (3)</td>
			<td>World Precision Inst. LLC</td>
			<td>TIPTPP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of open probability of the mitochondrial permeability transition pore in the setting of coenzyme q excess

Переходная пора митохондриальной проницаемости (mPTP) представляет собой мегаканал с напряжением, неселективный мегаканал внутренней митохондриальной мембраны (ИММ), важный для здоровья и болезней. mPTP опосредует утечку протонов через ИММ во время открытия с низкой проводимостью и специфически ингибируется циклоспорином А (CsA). Коэнзим Q (CoQ) является регулятором mPTP, и были обнаружены тканеспецифические различия в содержании CoQ и открытой вероятности mPTP в митохондриях переднего мозга и сердца у новорожденной мышиной модели синдрома хрупкого X (FXS, нокаут Fmr1 ). Мы разработали методику определения порога напряжения для открытия mPTP в этом мутантном штамме, используя роль mPTP в качестве канала утечки протонов.
Для этого потребление кислорода и мембранный потенциал (ΔΨ) одновременно измеряли в изолированных митохондриях с использованием полярографии и ионселективного электрода тетрафенилфосфония (TPP+) во время утечного дыхания. Порог вскрытия mPTP определяли по началу CsA-опосредованного ингибирования утечки протонов при специфических мембранных потенциалах. Используя этот подход, различия в напряжении затвора mPTP были точно определены в контексте превышения CoQ. Этот новый метод позволит в будущем проводить исследования для улучшения понимания физиологической и патологической регуляции низкопроводящего открытия mPTP.

Показаны типичные кривые потребленияO2 и ΔΨ, полученные в этих экспериментах (рисунок 1A,B). Логарифмическое снижение сигнала напряжения при калибровке TPP+ показано в начале каждого эксперимента. Отсутствие этой логарифмической картины может указыва?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Open Probability of the Mitochondrial Permeability Transition Pore in the Setting of Coenzyme Q Excess at JoVE.com

Assessment of Open Probability of the Mitochondrial Permeability Transition Pore in the Setting of Coenzyme Q Excess

Этот метод использует вклад поры перехода митохондриальной проницаемости в утечку протонов с низкой проводимостью для определения порога напряжения для открытия пор у неонатальных хрупких мышей с синдромом X с повышенным содержанием митохондриального коэнзима Q кардиомиоцитов по сравнению с контролем дикого типа.

Оценка открытой вероятности поры перехода митохондриальной проницаемости в условиях избытка коэнзима Q

The mitochondrial permeability transition pore (mPTP) is a voltage-gated, nonselective, inner mitochondrial membrane (IMM) mega-channel important in ...

Этот протокол обеспечивает новый способ исследования открытия низкой проводимости переходной поры митохондриальной проницаемости. Основным преимуществом этого метода является то, что он обеспечивает простой способ измерения открытой вероятности поры в зависимости от потенциала митохондриальной мембраны. Этот метод может быть легко применен к митохондриям, выделенным из любой системы органов и видов.Начинают с калибровки кислородного электрода, помещая каплю 50% раствора электролита хлорида калия поверх купола электродного диска. Поместите небольшой кусочек сигаретной бумаги площадью два квадратных сантиметра, покрытый немного большим куском политетрафторэтиленовой мембраны над каплей электролита. Затем используйте инструмент аппликатора, чтобы протолкнуть небольшое уплотнительное кольцо электродного диска над куполом электрода.Далее хорошо доливаем резервуар раствором электролита. Поместите большее уплотнительное кольцо в углубление вокруг электродного диска. Затем установите диск в электродную камеру, и подключите его к блоку управления.Добавьте два миллилитра насыщенной воздухом деионизированной воды и магнит с политетрафторэтиленовым покрытием в реакционную камеру. По завершении подключите камеру к задней части блока управления. Установите температуру на 37 градусов Цельсия, а скорость перемешивания на 100.Уравновешивайте температуру системы в течение 10 минут перед калибровкой. После обеспечения правильной температуры, скорости перемешивания и давления на вкладке Калибровка выберите параметр Калибровка жидкой фазы для выполнения калибровки жидкой фазы. Затем нажмите OK и дождитесь выхода сигнала на плато.Как только плато будет достигнуто, нажмите OK. Затем добавьте около 20 миллиграммов дитионита натрия, чтобы установить нулевой кислород в камере. Снова нажмите OK и подождите, пока сигнал стабилизируется, прежде чем нажать кнопку Сохранить, чтобы принять калибровку. Чтобы приготовить тетрафенилфосфоний, или TPP-селективный электрод в сборе, заполните наконечник электрода TPP-селективным 10-миллимолярным раствором TPP с использованием шприца и гибкой иглы.Избегайте пузырьков воздуха при заполнении наконечника электрода. Ослабьте крышку держателя электрода, чтобы вставить внутренний опорный электрод в наконечник TPP. Когда это будет сделано, соберите TPP-селективный электродный аппарат, включая электрод сравнения и держатель электрода.Затяните колпачок, чтобы закрепить наконечник. Затем подключите кабель к вспомогательному порту блока управления и держателю электрода ТЭС. Вставьте электроды TPP-селективного и эталонного происхождения в адаптированный плунжерный узел для ионселективных электродов.Подключите опорный электрод к опорному порту блока управления. Далее, чтобы подготовить реакционную камеру, добавляют один миллилитр реакционной смеси в реакционную камеру без образования пузырьков воздуха. Закройте камеру с помощью адаптированного плунжерного узла с электродами TPP-селективными и эталонными электродами.После закрытия камеры вводят дополнительные реагенты непосредственно в реакционную камеру с помощью отдельных микрошприцев, модифицированных пластиковыми трубками. Когда настройка будет готова, нажмите кнопку Перейти, чтобы начать запись. Как только будет получен сигнал стабильного напряжения, откалибруйте TPP-селективный электрод, добавив один микромолярный приращение 0,1 миллимолярного раствора TPP для достижения конечной концентрации трех микромоляров.Наблюдайте логарифмическое снижение сигнала напряжения TPP с каждым добавлением. После стабилизации следов кислорода и ТЭС добавьте 100 мкг свежеприготовленных митохондрий кардиомиоцитов в реакционную камеру через порт добавления реагента в плунжерном сборе до конечной концентрации 0,1 миллиграмма на миллилитр. Наблюдайте за снижением уровня кислорода в камере, когда митохондрии заряжаются энергией и потребляют кислород.Кроме того, посмотрите на резкое увеличение сигнала напряжения TPP, поскольку митохондрии генерируют мембранный потенциал и поглощают TPP из раствора. Затем добавляют 2,5 мкг на миллилитр олигомицина, чтобы вызвать дыхание в состоянии 4. Чтобы оценить открытую вероятность перехода поры митохондриальной проницаемости, или mPTP, наблюдают снижение мембранного потенциала с течением времени во время утечек дыхания.Как только желаемый мембранный потенциал достигнут, добавьте один микромолярный циклоспорин А в качестве ингибитора mPTP в реакционную камеру для оценки открытой вероятности mPTP при этом конкретном мембранном потенциале. Затем измеряют влияние циклоспорина А на потребление кислорода и мембранный потенциал до и после добавления циклоспорина А. В репрезентативных кривых одновременного потребления кислорода и мембранного потенциала высокий мембранный потенциал был установлен на нуле, промежуточный — на пять, а низкий — на 10 милливольт относительно уровня калибровки двух микромолярных ТЭС.Митохондрии при нуле милливольт демонстрировали 100% mPTP замкнутую вероятность, а при 10 милливольтах — 100% открытую вероятность. После добавления олигомицина существенной разницы в потреблении кислорода не наблюдалось, что позволяет предположить, что аденозинтрифосфат, или АТФ-синтаза, минимально способствует дыханию в состоянии 2. Кроме того, сравнивали скорость потребления кислорода и мембранный потенциал до и после добавления циклоспорина А.Снижение скорости потребления кислорода и увеличение стабилизации мембранного потенциала свидетельствовали о закрытии открытого мПТП. При закрытии mPTP не наблюдалось снижения скорости потребления кислорода, а мембранный потенциал продолжал падать. Результаты продемонстрировали аналогичные закрытые и открытые вероятности mPTP при высоких и низких мембранных потенциалах в контроле FVB и нокаутированных сердечных митохондриях Fmr1.При промежуточном мембранном потенциале нокаутирующие сердечные митохондрии Fmr1 продемонстрировали повышенную вероятность закрытого mPTP по сравнению с контролем FVB. В камеру не должны вводиться пузырьки воздуха, так как это приведет к нестабильным показаниям потребления кислорода и затруднит интерпретацию. После этой процедуры можно измерить нагрузочную способность кальция.Этот метод оценивает высокую проводимость открытия поры, и дополняет результаты нашей методики.

Research

JoVE Journal

Biology

The Structure of Skilled Forelimb Reaching in the Rat: A Movement Rating Scale

Структура Квалифицированные передних конечностей Достижение в Крыса: Шкала Движение Рейтинг

Skilled reaching for food is an evolutionary ancient act and is displayed by many animal species, including those in the sister clades of rodents and ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

Использование Rotorod как метод Качественный анализ Прогулка по Крыса

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Трансплантация клеток непосредственно в почках взрослых данио рерио

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Multi-параметр измерения проницаемости пор Переход Открытие в изолированном сердце мыши Митохондрии

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Живая съемка Пробирной для оценки роли Са<sup&gt; 2 +</sup&gt; И сфингомиелиназы в Ремонт порообразующих токсинного ран

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Оценка кальция Sparks в малонарушенных скелетных мышечных волокон

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

<em&gt; Xenopus</em&gt; Ооцитов Cut открыть Вазелин Gap Напряжение-зажим Техника С флуорометрии

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

Количественная Single микрососудов проницаемость в изолированном крови-перфузии Rat Подготовка легких

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Измерение осмотического водопроницаемость Коэффициент (P<sub&gt; F</sub&gt;) Из сферических ячеек: изолированные протопласты растений в качестве примера

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...