Name: assessment of open probability of the mitochondrial permeability transition pore in the setting of coenzyme q excess
Uploaded: 2022-06-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Open Probability of the Mitochondrial Permeability Transition Pore in the Setting of Coenzyme Q Excess at JoVE.com

Detta arbete stöds av följande bidrag: NIH / NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), Columbia University Irving Medical Center Target of Opportunity Provost award till Institutionen för anestesiologi (K.K.G.), Society of Pediatric Anesthesia Young Investigator Research Award (K.K.G.) och NIH / NINDS R01NS112706 (R.J.L.)

Institutional Animal Care and Use Committee of Columbia University Medical Center godkännande erhölls för alla beskrivna metoder. FXS (Fmr1 KO) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J) och kontroll (FVB) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ) möss som användes som modellsystem för denna studie förvärvades kommersiellt (se materialtabellen). Fem till elva djur användes i varje försöksgrupp. Postnatal dag 10 (P10) möss användes för att m...

<ol>
	<li>Rasola, A., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+permeability+transition+pore+and+its+involvement+in+cell+death+and+in+disease+pathogenesis.">The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis.</a> Apoptosis. 12 (5), 815-833 (2007).</li><li>Szab&#243;, I., Zoratti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+megachannel+is+the+permeability+transition+pore.">The mitochondrial megachannel is the permeability transition pore.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 24, 111-117 (1992).</li><li>Brand, M., Ferguson, S., Nunnari, J., K&#252;hlbrandt, W., Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. 14, 767-830 (2002).</li><li>Perez, M. J., Quintanilla, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+or+disease:+duality+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">Development or disease: duality of the mitochondrial permeability transition pore.</a> Developmental Biology. 426 (1), 1-7 (2017).</li><li>Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+pathological+roles+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+in+the+heart.">Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart.</a> Cell Metabolism. 21 (2), 206-214 (2015).</li><li>Javadov, S., Kuznetsov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+permeability+transition+and+cell+death:+the+role+of+cyclophilin+d.">Mitochondrial permeability transition and cell death: the role of cyclophilin d.</a> Frontiers in Physiology. 4, 76 (2013).</li><li>Dorn, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+non-apoptotic+programmed+cell+death+in+diabetes+and+heart+failure.">Mechanisms of non-apoptotic programmed cell death in diabetes and heart failure.</a> Cell Cycle. 9 (17), 3442-3448 (2010).</li><li>Boyman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore:+Transient+and+permanent+opening+events.">Dynamics of the mitochondrial permeability transition pore: Transient and permanent opening events.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 666, 31-39 (2019).</li><li>Hom, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+transition+pore+controls+cardiac+mitochondrial+maturation+and+myocyte+differentiation.">The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte differentiation.</a> Developmental Cell. 21 (3), 469-478 (2011).</li><li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+superoxide+production+negatively+regulates+neural+progenitor+proliferation+and+cerebral+cortical+development.">Mitochondrial superoxide production negatively regulates neural progenitor proliferation and cerebral cortical development.</a> Stem Cells. 30 (11), 2535-2547 (2012).</li><li>Elrod, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophilin+D+controls+mitochondrial+pore-dependent+Ca(2+)+exchange,+metabolic+flexibility,+and+propensity+for+heart+failure+in+mice.">Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca(2+) exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3680-3687 (2010).</li><li>Bonora, M., Giorgi, C., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+consequences+of+mitochondrial+permeability+transition.">Molecular mechanisms and consequences of mitochondrial permeability transition.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2021).</li><li>Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+mitochondrial+cyclosporin+A-sensitive+permeability+transition+pore+by+the+proton+electrochemical+gradient.+Evidence+that+the+pore+can+be+opened+by+membrane+depolarization.">Modulation of the mitochondrial cyclosporin A-sensitive permeability transition pore by the proton electrochemical gradient. Evidence that the pore can be opened by membrane depolarization.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (13), 8834-8839 (1992).</li><li>Petronilli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+voltage+sensor+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+is+tuned+by+the+oxidation-reduction+state+of+vicinal+thiols.+Increase+of+the+gating+potential+by+oxidants+and+its+reversal+by+reducing+agents.">The voltage sensor of the mitochondrial permeability transition pore is tuned by the oxidation-reduction state of vicinal thiols. Increase of the gating potential by oxidants and its reversal by reducing agents.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16638-16642 (1994).</li><li>Giorgio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+binding+to+F-ATP+synthase+beta+subunit+triggers+the+mitochondrial+permeability+transition.">Ca(2+) binding to F-ATP synthase beta subunit triggers the mitochondrial permeability transition.</a> European Molecular Biology Organization Reports. 18 (7), 1065-1076 (2017).</li><li>Halestrap, A. P., Woodfield, K. Y., Connern, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress,+thiol+reagents,+and+membrane+potential+modulate+the+mitochondrial+permeability+transition+by+affecting+nucleotide+binding+to+the+adenine+nucleotide+translocase.">Oxidative stress, thiol reagents, and membrane potential modulate the mitochondrial permeability transition by affecting nucleotide binding to the adenine nucleotide translocase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3346-3354 (1997).</li><li>Szabo, I., Bernardi, P., Zoratti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+mitochondrial+megachannel+by+divalent+cations+and+protons.">Modulation of the mitochondrial megachannel by divalent cations and protons.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (5), 2940-2946 (1992).</li><li>Karch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mitochondrial+permeability+transition+by+deletion+of+the+ANT+family+and+CypD.">Inhibition of mitochondrial permeability transition by deletion of the ANT family and CypD.</a> Science Advances. 5 (8), (2019).</li><li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+uncoupling+channel+within+the+c-subunit+ring+of+the+F1FO+ATP+synthase+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 10580-10585 (2014).</li><li>Antoniel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+histidine+in+OSCP+subunit+of+F-ATP+synthase+mediates+inhibition+of+the+permeability+transition+pore+by+acidic+pH.">The unique histidine in OSCP subunit of F-ATP synthase mediates inhibition of the permeability transition pore by acidic pH.</a> European Molecular Biology Organization Reports. 19 (2), 257-268 (2018).</li><li>Haworth, R. A., Hunter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ca2+-induced+membrane+transition+in+mitochondria.+II.+Nature+of+the+Ca2++trigger+site.">The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 195 (2), 460-467 (1979).</li><li>Halestrap, A. P., Connern, C. P., Griffiths, E. J., Kerr, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporin+A+binding+to+mitochondrial+cyclophilin+inhibits+the+permeability+transition+pore+and+protects+hearts+from+ischaemia/reperfusion+injury.">Cyclosporin A binding to mitochondrial cyclophilin inhibits the permeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusion injury.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 174 (1-2), 167-172 (1997).</li><li>Giorgio, V., Fogolari, F., Lippe, G., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OSCP+subunit+of+mitochondrial+ATP+synthase:+role+in+regulation+of+enzyme+function+and+of+its+transition+to+a+pore.">OSCP subunit of mitochondrial ATP synthase: role in regulation of enzyme function and of its transition to a pore.</a> British Journal of Pharmacology. 176 (22), 4247-4257 (2019).</li><li>Fontaine, E., Ichas, F., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ubiquinone-binding+site+regulates+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">A ubiquinone-binding site regulates the mitochondrial permeability transition pore.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (40), 25734-25740 (1998).</li><li>Griffiths, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+thermogenic+mitochondrial+respiration+due+to+futile+proton+leak+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Inefficient thermogenic mitochondrial respiration due to futile proton leak in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 34 (6), 7404-7426 (2020).</li><li>Barajas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+newborn+Fmr1+knockout+mouse:+a+novel+model+of+excess+ubiquinone+and+closed+mitochondrial+permeability+transition+pore+in+the+developing+heart.">The newborn Fmr1 knockout mouse: a novel model of excess ubiquinone and closed mitochondrial permeability transition pore in the developing heart.</a> Pediatric Research. 89 (3), 456-463 (2021).</li><li>Parks, R. J., Murphy, E., Liu, J. C., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 187-196 (2018).</li><li>Carraro, M., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+membrane+permeability+and+the+mitochondrial+permeability+transition.">Measurement of membrane permeability and the mitochondrial permeability transition.</a> Methods in Cell Biology. 155, 369-379 (2020).</li><li>Affourtit, C., Wong, H., Brand, M. D., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 157-170 (2018).</li><li>Teodoro, J. S., Palmeira, C. M., Rolo, A. P., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 109-119 (2018).</li><li>Neginskaya, M. A., Pavlov, E. V., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+properties+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pores:+Channel+diversity+and+disease+implication.">Electrophysiological properties of the mitochondrial permeability transition pores: Channel diversity and disease implication.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1862 (3), 148357 (2021).</li><li>Zoratti, M., Szabo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+permeability+transition.">The mitochondrial permeability transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1241 (2), 139-176 (1995).</li><li>Yajuan, X., Xin, L., Zhiyuan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+performance+and+application+differences+between+manual+and+automated+patch-clamp+techniques.">A comparison of the performance and application differences between manual and automated patch-clamp techniques.</a> Current Chemical Genomics. 6, 87-92 (2012).</li><li>Petronilli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+long-lasting+openings+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+can+be+monitored+directly+in+intact+cells+by+changes+in+mitochondrial+calcein+fluorescence.">Transient and long-lasting openings of the mitochondrial permeability transition pore can be monitored directly in intact cells by changes in mitochondrial calcein fluorescence.</a> Biophysical Journal. 76 (2), 725-734 (1999).</li></ol>

Detta dokument beskriver en metod för att bedöma den öppna sannolikheten för mPTP. Specifikt bestämdes spänningströskeln för mPTP-öppning med låg konduktans genom att bedöma effekten av CsA-hämning på protonläckage över ett intervall av ΔΨs. Med hjälp av denna teknik kunde vi identifiera skillnader i spänningsgavel av mPTP mellan FXS-möss och FVB-kontroller som överensstämmer med deras skillnader i vävnadsspecifikt Q-innehåll. Avgörande för framgången med denna metod är att mitokondrier är ny...

mPTP förmedlar permeabilitetsövergången (PT), varigenom IMM blir plötsligt permeabel för små molekyler och löster 1,2. Detta slående fenomen är en tydlig avvikelse från IMM: s karakteristiska ogenomtränglighet, vilket är grundläggande för att fastställa den elektrokemiska gradienten som är nödvändig för oxidativ fosforylering3. PT, till skillnad från andra mitokondriella transportmekanismer, är en högkonduktans, ospecifik och icke-selektiv process, vilket möjliggör passage av en rad molekyler upp till 1,5 kDa 4,5. mPTP är en spänningsstyrd kanal inom IMM vars öppning förändrar ΔΨ, ATP-produktion, kalciumhomeostas, reaktiv syreart (ROS) produktion och cellviabilitet4.
Vid den patologiska extrema leder okontrollerad och långvarig högkonduktansöppning av mPTP till kollaps av den elektrokemiska gradienten, matrissvullnad, utarmning av matrispyridinnukleotider, yttre membranbrott, frisättning av intermembranproteiner (inklusive cytokrom c) och slutligen celldöd 4,6. Sådan patologisk mPTP-öppning har varit inblandad i hjärtischemi-reperfusionsskada, hjärtsvikt, traumatisk hjärnskada, olika neurodegenerativa sjukdomar och diabetes 1,7. MPTP-öppning med låg konduktans är emellertid fysiologisk till sin natur och leder i motsats till högkonduktansöppning inte till djup depolarisering eller mitokondriell svullnad4.
Lågkonduktansöppning av poren begränsar permeabiliteten till ~ 300 Da, tillåter passage av protoner oberoende av ATP-syntes och är en potentiell källa till fysiologisk protonläcka5. Fysiologisk mPTP-öppning orsakar en kontrollerad nedgång i ΔΨ, ökar elektronflödet genom andningstransportkedjan och resulterar i en kort burst eller blixt av superoxid, vilket bidrar till ROS-signalering8. Reglering av sådan övergående mPTP-öppning är viktig för kalciumhomeostas och normal cellulär utveckling och mognad 4,9,10,11. Övergående poröppning vid utveckling av neuroner utlöser till exempel differentiering, medan stängningen av mPTP inducerar mognad i omogna kardiomyocyter 4,5.
Även om den funktionella betydelsen av mPTP i hälsa och sjukdom är väl etablerad, är dess exakta molekylära identitet fortfarande debatterad. Framstegen när det gäller mPTP:s molekylära struktur och funktion har granskats utförligt på annat håll12. Kortfattat har för närvarande hög- och lågkonduktanstillstånd för mPTP antagits förmedlas av distinkta enheter12. De ledande kandidaterna är F1/F0 ATP-syntas (ATP-syntas) och adeninnukleotidtransportör (ANT) för hög- respektive lågkonduktanslägen12.
Trots bristen på konsensus om den exakta identiteten hos den porbildande komponenten i mPTP har vissa nyckelegenskaper beskrivits. En väletablerad egenskap hos mPTP är att den regleras av den elektrokemiska gradienten så att depolarisering av IMM leder till poröppning13. Tidigare arbete har visat att redoxtillståndet för vicinala tiolgrupper förändrar spänningskopplingen hos mPTP, så att oxidation öppnar poren vid relativt högre ΔΨs, och tiolgruppsreduktion resulterar i sluten mPTP-sannolikhet14. Identiteten hos den proteinhaltiga spänningssensorn är emellertid okänd.
Olika små molekyler som modulerar porens öppna sannolikhet har identifierats. Till exempel kan mPTP stimuleras att öppna med kalcium, oorganiskt fosfat, fettsyror och ROS och kan hämmas av adeninnukleotider (särskilt ADP), magnesium, protoner och CsA 5,12. Verkningsmekanismerna hos vissa av dessa tillsynsmyndigheter har belysts. Mitokondriellt kalcium utlöser mPTP-öppning åtminstone delvis genom att binda till β-underenheten i ATP-syntas15. ROS kan aktivera mPTP genom att minska dess affinitet för ADP och förbättra dess affinitet för cyklofilin D (CypD), den bäst studerade proteinhaltiga mPTP-aktivatorn16. Mekanismen för aktivering av mPTP med oorganiskt fosfat och fettsyror är mindre tydlig. När det gäller endogena hämmare tros ADP hämma mPTP genom att binda vid ANT- eller ATP-syntaset, medan magnesium utövar sin hämmande effekt genom att förskjuta kalcium från dess bindningsställe 15,17,18,19.
Lågt pH hämmar mPTP-öppningen genom att protonera histidin 112 av den regulatoriska oligomycinkänslighetsgivande protein (OSCP) -underenheten i ATP-syntaset 12,20,21. Den prototypiska farmakologiska hämmaren av mPTP, CsA, verkar genom att binda CypD och förhindra dess koppling till OSCP 22,23. Tidigare arbete har också visat att en mängd olika Q-analoger interagerar med mPTP, hämmar den eller aktiverar den24. I det senaste arbetet fann vi bevis på en patologiskt öppen mPTP, överdriven protonläcka och ineffektiv oxidativ fosforylering på grund av en Q-brist i mitokondrier i framhjärnan hos nyfödda FXS-musungar25.
Stängning av poren med exogen q blockerade den patologiska protonläckan och inducerade morfologisk mognad hos dendritiska ryggar25. Intressant nog hade FXS-kardiomyocyter hos samma djur överdrivna Q-nivåer och sluten mPTP-sannolikhet jämfört med vildtypskontroller26. Även om orsaken till dessa vävnadsspecifika skillnader i Q-nivåer är okänd, understryker resultaten konceptet att endogen q sannolikt är en nyckelregulator för mPTP. Det finns dock ett stort gap i vår kunskap eftersom mekanismen för Q-medierad hämning av mPTP fortfarande är okänd.
Reglering av mPTP är en kritisk determinant för cellsignalering och överlevnad4. Således är det viktigt att detektera mPTP-öppning inom mitokondrier när man överväger specifika patofysiologiska mekanismer. Vanligtvis bestäms tröskeln för poröppning med hög konduktans med användning av kalcium för att utlösa permeabilitetsövergången. Sådan kalciumbelastning leder till kollaps av membranpotentialen, snabb frikoppling av oxidativ fosforylering och mitokondriell svullnad27,28. Vi försökte utveckla en metod för att detektera mPTP-öppning med låg konduktans in situ, utan att inducera det i sig.
Tillvägagångssättet utnyttjar mPTP: s roll som en protonläckkanal. För att göra detta användes Clark-Type och TPP + jonselektiva elektroder för att samtidigt mäta syreförbrukning respektive membranpotential i isolerade mitokondrier under läckageandning29. Tröskeln för mPTP-öppning bestämdes av uppkomsten av CsA-medierad hämning av protonläckage vid specifika membranpotentialer. Med hjälp av detta tillvägagångssätt definierades skillnader i spänningstilldelning av mPTP i samband med Q-överskott exakt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1</td>
			<td>PP systems</td>
			<td>941039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-11B</td>
			<td>to modify the length of the hamilton synringe as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm</td>
			<td>World Precision Inst. LLC</td>
			<td>DRIREF-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Holder for KWIK-Tips</td>
			<td>World Precision Inst. LLC</td>
			<td>KWIK-2</td>
			<td>&#160;ion selective electrode holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid&#160; (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J</td>
			<td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td></td>
			<td>FXS mice, Fmr1 KO&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ</td>
			<td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td></td>
			<td>FVB mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07938-30</td>
			<td>microsyringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07938-02</td>
			<td>microsyringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete</td>
			<td>PP systems</td>
			<td>OXYTHERM+R</td>
			<td>oxygen electrode and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1374248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9546-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1,P5-diadenosine-5&#8242; pentaphosphate pentasodium (AP5A)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4022-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1644</td>
			<td>medium for density gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5.43841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP+ Electrode Tips (3)</td>
			<td>World Precision Inst. LLC</td>
			<td>TIPTPP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of open probability of the mitochondrial permeability transition pore in the setting of coenzyme q excess

Den mitokondriella permeabilitetsövergångsporen (mPTP) är en spänningsstyrd, icke-selektiv, inre mitokondriell membran (IMM) megakanal som är viktig för hälsa och sjukdom. mPTP förmedlar läckage av protoner över IMM under öppning med låg konduktans och hämmas specifikt av cyklosporin A (CsA). Koenzym Q (Q) är en regulator för mPTP, och vävnadsspecifika skillnader har hittats i Q-innehåll och öppen sannolikhet för mPTP i framhjärnan och hjärtmitokondrier i en nyfödd musmodell av bräckligt X-syndrom (FXS, Fmr1 knockout). Vi utvecklade en teknik för att bestämma spänningströskeln för mPTP-öppning i denna mutantstam och utnyttjade mPTP: s roll som en protonläckkanal.
För att göra detta mättes syreförbrukning och membranpotential (ΔΨ) samtidigt i isolerade mitokondrier med hjälp av polarografi och en tetrafenylfosfonium (TPP+) jonselektiv elektrod under läckageandning. Tröskeln för mPTP-öppning bestämdes av uppkomsten av CsA-medierad hämning av protonläckage vid specifika membranpotentialer. Med hjälp av detta tillvägagångssätt definierades skillnader i spänningsgatning av mPTP exakt i samband med Q-överskott. Denna nya teknik kommer att möjliggöra framtida undersökningar för att förbättra förståelsen för fysiologisk och patologisk reglering av lågkonduktansöppning av mPTP.

TypiskaO2-förbruknings- och ΔΨ-kurvor som genereras i dessa experiment visas (figur 1A,B). Den logaritmiska nedgången i spänningssignalen med TPP+-kalibrering visas i början av varje experiment. Frånvaron av detta logaritmiska mönster kan tyda på ett problem med den selektiva elektroden TPP+. Mitokondrier genererar vanligtvis ΔΨ omedelbart vid tillägg till andningsbuffert. ΔΨ kan tolkas från förändringar i TPP+-sp?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Open Probability of the Mitochondrial Permeability Transition Pore in the Setting of Coenzyme Q Excess at JoVE.com

Assessment of Open Probability of the Mitochondrial Permeability Transition Pore in the Setting of Coenzyme Q Excess

Denna metod utnyttjar bidraget från mitokondriell permeabilitetsövergångspor till protonläckage med låg konduktans för att bestämma spänningströskeln för poröppning hos neonatala bräckliga X-syndrommöss med ökat kardiomyocyt mitokondriellt koenzym Q-innehåll jämfört med vildtypskontroll.

Bedömning av öppen sannolikhet för mitokondriell permeabilitetsövergångspor vid inställning av koenzym Q-överskott

The mitochondrial permeability transition pore (mPTP) is a voltage-gated, nonselective, inner mitochondrial membrane (IMM) mega-channel important in ...

Detta protokoll ger ett nytt sätt att undersöka den låga konduktansöppningen hos mitokondriell permeabilitetsövergångsporen. Den största fördelen med denna teknik är att den ger ett enkelt sätt att mäta porens öppna sannolikhet som en funktion av mitokondriell membranpotential. Denna teknik kan lätt tillämpas på mitokondrier isolerade från alla organsystem och arter.Börja med kalibreringen av syreelektroden genom att placera en droppe 50% kaliumkloridelektrolytlösning ovanpå elektrodskivans kupol. Placera en liten bit av två kvadratcentimeter cigarettpappersdistans täckt med en något större bit polytetrafluoretylenmembran över elektrolytdroppen. Använd sedan applikatorverktyget för att trycka den lilla elektrodskivans O-ring över elektrodens kupol.Fyll sedan på behållaren väl med elektrolytlösningen. Placera den större O-ringen i urtaget runt elektrodskivan väl. Installera sedan skivan i elektrodkammaren och anslut den till styrenheten.Tillsätt två milliliter luftmättat avjoniserat vatten och den polytetrafluoretylenbelagda magneten till reaktionskammaren. När du är klar ansluter du kammaren till baksidan av styrenheten. Ställ in temperaturen på 37 grader Celsius och omrörningshastigheten till 100.Låt systemtemperaturen balanseras i 10 minuter före kalibrering. När du har säkerställt rätt temperatur, omrörningshastighet och tryck väljer du alternativet Vätskefaskalibrering under fliken Kalibrering för att utföra vätskefaskalibrering. Tryck sedan på OK och vänta tills signalen blir platå.När platån har nåtts trycker du på OK. Tillsätt sedan cirka 20 milligram natriumditionit för att fastställa noll syre i kammaren. Återigen, tryck på OK och vänta tills signalen platå innan du klickar på Save för att acceptera kalibreringen. För att bereda tetrafenylfosfoniumet, eller TPP-selektiv elektrodmontering, fyll den TPP-selektiva elektrodspetsen med en 10 millimolär TPP-lösning med en spruta och en flexibel nål.Undvik luftbubblor när du fyller elektrodspetsen. Lossa elektrodhållarens lock för att sätta in den inre referenselektroden i TPP-spetsen. När du är klar monterar du den TPP-selektiva elektrodapparaten, inklusive referenselektroden och elektrodhållaren.Dra åt locket för att säkra spetsen. Anslut sedan kabeln till hjälpporten på kontrollboxen och TPP-elektrodhållaren. Sätt in de TPP-selektiva elektroderna och referenselektroderna i den anpassade kolvenheten för jonselektiva elektroder.Anslut referenselektroden till referensporten på kontrollboxen. Därefter, för att förbereda reaktionskammaren, tillsätt en milliliter av reaktionsblandningen till reaktionskammaren utan att skapa luftbubblor. Stäng kammaren med den anpassade kolvenheten med de TPP-selektiva elektroderna och referenselektroderna på plats.När kammaren är stängd, inför ytterligare reagenser direkt i reaktionskammaren med hjälp av separata mikrosprutor modifierade med plaströr. När installationen är klar väljer du Gå för att starta inspelningen. När en stabil spänningssignal har erhållits kalibrerar du den TPP-selektiva elektroden genom att tillsätta en mikromolär steg av en 0,1 millimolär TPP-lösning för att uppnå en slutlig koncentration av tre mikromolar.Observera den logaritmiska nedgången i TPP-spänningssignalen med varje tillägg. Efter stabilisering av syre- och TPP-spår, tillsätt 100 mikrogram nyberedda kardiomyocytmitokondrier till reaktionskammaren via reagenstillsatsporten i kolvenheten till en slutlig koncentration av 0,1 milligram per milliliter. Observera minskningen av syrenivåerna i kammaren när mitokondrierna blir energiska och förbrukar syre.Se också den plötsliga ökningen av TPP-spänningssignalen eftersom mitokondrierna genererar en membranpotential och tar upp TPP från lösningen. Tillsätt sedan 2,5 mikrogram per milliliter oligomycin för att inducera tillstånd 4 andning. För att bedöma den öppna sannolikheten för mitokondriell permeabilitetsövergångspor, eller mPTP, observera nedgången i membranpotentialen över tiden under läckageandning.När den önskade membranpotentialen har uppnåtts, tillsätt en mikromolär cyklosporin A som en mPTP-hämmare till reaktionskammaren för att bedöma den öppna sannolikheten för mPTP vid den specifika membranpotentialen. Mät sedan effekten av cyklosporin A på syreförbrukning och membranpotential före och efter cyklosporin A-tillsats. I de representativa kurvorna för samtidig syreförbrukning och membranpotential sattes hög membranpotential till noll, intermediär vid fem och låg vid 10 millivolt i förhållande till den två mikromolära TPP-kalibreringsnivån.Mitokondrierna vid noll millivolt uppvisade 100% mPTP sluten sannolikhet och vid 10 millivolt uppvisade 100% öppen sannolikhet. Efter oligomycintillsats observerades inte en signifikant skillnad i syreförbrukning, vilket tyder på att adenosintrifosfat eller ATP-syntas bidrar minimalt till tillstånd 2-andning. Vidare jämfördes syreförbrukningshastigheten och membranpotentialen före och efter cyklosporin Ett tillägg.En minskning av syreförbrukningshastigheten och en ökning av stabiliseringen av membranpotentialen indikerade stängningen av en öppen mPTP. När mPTP är stängd var det ingen minskning av syreförbrukningshastigheten och membranpotentialen fortsatte att falla. Resultaten visade liknande slutna och öppna mPTP-sannolikheter vid höga och låga membranpotentialer i FVB-kontrollen och Fmr1 knockout-hjärtmitokondrier.Vid den mellanliggande membranpotentialen visade Fmr1 knockout hjärtmitokondrier ökad sluten mPTP-sannolikhet jämfört med FVB-kontrollerna. Inga luftbubblor får införas i kammaren, eftersom detta kommer att leda till instabila syreförbrukningsavläsningar och göra tolkningen svår. Efter denna procedur kan kalciumbelastningskapaciteten mätas.Denna metod bedömer porens höga konduktansöppning och kompletterar resultaten av vår teknik.

Research

JoVE Journal

Biology

The Structure of Skilled Forelimb Reaching in the Rat: A Movement Rating Scale

Struktur av utbildad Forelimb Nå i Rat: förflyttning Rating Scale

Skilled reaching for food is an evolutionary ancient act and is displayed by many animal species, including those in the sister clades of rodents and ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

Användning av Rotorod som en metod för kvalitativ analys av Walking i Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Transplantation av celler direkt in i njuren för vuxna Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Flera parametrar Mätning av permeabiliteten Transition poröppning i isolerade mus hjärta mitokondrier

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging analys för bedömning av roller Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Och sfingomyelinas i Reparation av por-bildande Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

I Intakta Skeletal Muscle Fibers Bedömning av Kalcium Sparks

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

Den<em&gt; Xenopus</em&gt; Äggcellen Cut-öppen vaselin Gap spänning-clamp teknik med fluorometri

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

Kvantifiera Single microvessel permeabilitet i Isolerad Blod-perfusion Rat Lung Förberedelse

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Mätning av det osmotiska Vatten permeabilitetskoefficienten (P<sub&gt; F</sub&gt;) Av Sfäriska Celler: isolerade växtprotoplaster som exempel

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...