Name: assessment of open probability of the mitochondrial permeability transition pore in the setting of coenzyme q excess
Uploaded: 2022-06-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Open Probability of the Mitochondrial Permeability Transition Pore in the Setting of Coenzyme Q Excess at JoVE.com

Bu çalışma aşağıdaki hibelerle desteklenmektedir: NIH / NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), Columbia Üniversitesi Irving Tıp Merkezi Anesteziyoloji Bölümü'ne Fırsat Provost Hedefi Ödülü (K.K.G.), Pediatrik Anestezi Derneği Genç Araştırmacı Araştırma Ödülü (K.K.G.) ve NIH / NINDS R01NS112706 (R.J.L.)

Columbia Üniversitesi Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi açıklanan tüm yöntemler için onay alınmıştır. Bu çalışma için model sistemleri olarak kullanılan FXS (Fmr1 KO) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyr c-ch Fmr1 tm1Cgr/J) ve kontrol (FVB) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ) fareleri ticari olarak edinilmiştir (bkz. Her deney grubunda beş ila on bir hayvan kullanıldı. Doğum sonrası gün 10 (P10) fareleri, insan...

<ol>
	<li>Rasola, A., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+permeability+transition+pore+and+its+involvement+in+cell+death+and+in+disease+pathogenesis.">The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis.</a> Apoptosis. 12 (5), 815-833 (2007).</li><li>Szab&#243;, I., Zoratti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+megachannel+is+the+permeability+transition+pore.">The mitochondrial megachannel is the permeability transition pore.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 24, 111-117 (1992).</li><li>Brand, M., Ferguson, S., Nunnari, J., K&#252;hlbrandt, W., Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. 14, 767-830 (2002).</li><li>Perez, M. J., Quintanilla, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+or+disease:+duality+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">Development or disease: duality of the mitochondrial permeability transition pore.</a> Developmental Biology. 426 (1), 1-7 (2017).</li><li>Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+pathological+roles+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+in+the+heart.">Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart.</a> Cell Metabolism. 21 (2), 206-214 (2015).</li><li>Javadov, S., Kuznetsov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+permeability+transition+and+cell+death:+the+role+of+cyclophilin+d.">Mitochondrial permeability transition and cell death: the role of cyclophilin d.</a> Frontiers in Physiology. 4, 76 (2013).</li><li>Dorn, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+non-apoptotic+programmed+cell+death+in+diabetes+and+heart+failure.">Mechanisms of non-apoptotic programmed cell death in diabetes and heart failure.</a> Cell Cycle. 9 (17), 3442-3448 (2010).</li><li>Boyman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore:+Transient+and+permanent+opening+events.">Dynamics of the mitochondrial permeability transition pore: Transient and permanent opening events.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 666, 31-39 (2019).</li><li>Hom, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+transition+pore+controls+cardiac+mitochondrial+maturation+and+myocyte+differentiation.">The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte differentiation.</a> Developmental Cell. 21 (3), 469-478 (2011).</li><li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+superoxide+production+negatively+regulates+neural+progenitor+proliferation+and+cerebral+cortical+development.">Mitochondrial superoxide production negatively regulates neural progenitor proliferation and cerebral cortical development.</a> Stem Cells. 30 (11), 2535-2547 (2012).</li><li>Elrod, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophilin+D+controls+mitochondrial+pore-dependent+Ca(2+)+exchange,+metabolic+flexibility,+and+propensity+for+heart+failure+in+mice.">Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca(2+) exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3680-3687 (2010).</li><li>Bonora, M., Giorgi, C., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+consequences+of+mitochondrial+permeability+transition.">Molecular mechanisms and consequences of mitochondrial permeability transition.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2021).</li><li>Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+mitochondrial+cyclosporin+A-sensitive+permeability+transition+pore+by+the+proton+electrochemical+gradient.+Evidence+that+the+pore+can+be+opened+by+membrane+depolarization.">Modulation of the mitochondrial cyclosporin A-sensitive permeability transition pore by the proton electrochemical gradient. Evidence that the pore can be opened by membrane depolarization.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (13), 8834-8839 (1992).</li><li>Petronilli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+voltage+sensor+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+is+tuned+by+the+oxidation-reduction+state+of+vicinal+thiols.+Increase+of+the+gating+potential+by+oxidants+and+its+reversal+by+reducing+agents.">The voltage sensor of the mitochondrial permeability transition pore is tuned by the oxidation-reduction state of vicinal thiols. Increase of the gating potential by oxidants and its reversal by reducing agents.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16638-16642 (1994).</li><li>Giorgio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+binding+to+F-ATP+synthase+beta+subunit+triggers+the+mitochondrial+permeability+transition.">Ca(2+) binding to F-ATP synthase beta subunit triggers the mitochondrial permeability transition.</a> European Molecular Biology Organization Reports. 18 (7), 1065-1076 (2017).</li><li>Halestrap, A. P., Woodfield, K. Y., Connern, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress,+thiol+reagents,+and+membrane+potential+modulate+the+mitochondrial+permeability+transition+by+affecting+nucleotide+binding+to+the+adenine+nucleotide+translocase.">Oxidative stress, thiol reagents, and membrane potential modulate the mitochondrial permeability transition by affecting nucleotide binding to the adenine nucleotide translocase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3346-3354 (1997).</li><li>Szabo, I., Bernardi, P., Zoratti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+mitochondrial+megachannel+by+divalent+cations+and+protons.">Modulation of the mitochondrial megachannel by divalent cations and protons.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (5), 2940-2946 (1992).</li><li>Karch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mitochondrial+permeability+transition+by+deletion+of+the+ANT+family+and+CypD.">Inhibition of mitochondrial permeability transition by deletion of the ANT family and CypD.</a> Science Advances. 5 (8), (2019).</li><li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+uncoupling+channel+within+the+c-subunit+ring+of+the+F1FO+ATP+synthase+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 10580-10585 (2014).</li><li>Antoniel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+histidine+in+OSCP+subunit+of+F-ATP+synthase+mediates+inhibition+of+the+permeability+transition+pore+by+acidic+pH.">The unique histidine in OSCP subunit of F-ATP synthase mediates inhibition of the permeability transition pore by acidic pH.</a> European Molecular Biology Organization Reports. 19 (2), 257-268 (2018).</li><li>Haworth, R. A., Hunter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ca2+-induced+membrane+transition+in+mitochondria.+II.+Nature+of+the+Ca2++trigger+site.">The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 195 (2), 460-467 (1979).</li><li>Halestrap, A. P., Connern, C. P., Griffiths, E. J., Kerr, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporin+A+binding+to+mitochondrial+cyclophilin+inhibits+the+permeability+transition+pore+and+protects+hearts+from+ischaemia/reperfusion+injury.">Cyclosporin A binding to mitochondrial cyclophilin inhibits the permeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusion injury.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 174 (1-2), 167-172 (1997).</li><li>Giorgio, V., Fogolari, F., Lippe, G., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OSCP+subunit+of+mitochondrial+ATP+synthase:+role+in+regulation+of+enzyme+function+and+of+its+transition+to+a+pore.">OSCP subunit of mitochondrial ATP synthase: role in regulation of enzyme function and of its transition to a pore.</a> British Journal of Pharmacology. 176 (22), 4247-4257 (2019).</li><li>Fontaine, E., Ichas, F., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ubiquinone-binding+site+regulates+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">A ubiquinone-binding site regulates the mitochondrial permeability transition pore.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (40), 25734-25740 (1998).</li><li>Griffiths, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+thermogenic+mitochondrial+respiration+due+to+futile+proton+leak+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Inefficient thermogenic mitochondrial respiration due to futile proton leak in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 34 (6), 7404-7426 (2020).</li><li>Barajas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+newborn+Fmr1+knockout+mouse:+a+novel+model+of+excess+ubiquinone+and+closed+mitochondrial+permeability+transition+pore+in+the+developing+heart.">The newborn Fmr1 knockout mouse: a novel model of excess ubiquinone and closed mitochondrial permeability transition pore in the developing heart.</a> Pediatric Research. 89 (3), 456-463 (2021).</li><li>Parks, R. J., Murphy, E., Liu, J. C., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 187-196 (2018).</li><li>Carraro, M., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+membrane+permeability+and+the+mitochondrial+permeability+transition.">Measurement of membrane permeability and the mitochondrial permeability transition.</a> Methods in Cell Biology. 155, 369-379 (2020).</li><li>Affourtit, C., Wong, H., Brand, M. D., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 157-170 (2018).</li><li>Teodoro, J. S., Palmeira, C. M., Rolo, A. P., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 109-119 (2018).</li><li>Neginskaya, M. A., Pavlov, E. V., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+properties+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pores:+Channel+diversity+and+disease+implication.">Electrophysiological properties of the mitochondrial permeability transition pores: Channel diversity and disease implication.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1862 (3), 148357 (2021).</li><li>Zoratti, M., Szabo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+permeability+transition.">The mitochondrial permeability transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1241 (2), 139-176 (1995).</li><li>Yajuan, X., Xin, L., Zhiyuan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+performance+and+application+differences+between+manual+and+automated+patch-clamp+techniques.">A comparison of the performance and application differences between manual and automated patch-clamp techniques.</a> Current Chemical Genomics. 6, 87-92 (2012).</li><li>Petronilli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+long-lasting+openings+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+can+be+monitored+directly+in+intact+cells+by+changes+in+mitochondrial+calcein+fluorescence.">Transient and long-lasting openings of the mitochondrial permeability transition pore can be monitored directly in intact cells by changes in mitochondrial calcein fluorescence.</a> Biophysical Journal. 76 (2), 725-734 (1999).</li></ol>

Bu yazıda mPTP'nin açık olasılığını değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Spesifik olarak, düşük iletkenlikli mPTP açıklığı için voltaj eşiği, CsA inhibisyonunun bir dizi ΔΨ üzerindeki proton sızıntısı üzerindeki etkisinin değerlendirilmesiyle belirlendi. Bu tekniği kullanarak, FXS fareleri ve FVB kontrolleri arasındaki mPTP'nin voltaj geçişindeki farklılıkları, dokuya özgü CoQ içeriğindeki farklılıklarıyla tutarlı olarak tanımlayabiliriz. Bu metodolojinin başa...

mPTP, geçirgenlik geçişine (PT) aracılık eder, böylece İBB aniden küçük moleküllere geçirgen hale gelir ve 1,2'yi çözündürür. Bu çarpıcı fenomen, oksidatif fosforilasyon için gerekli elektrokimyasal gradyanı belirlemek için temel olan İBB'nin karakteristik geçirimsizliğinden belirgin bir sapmadır3. PT, diğer mitokondriyal taşıma mekanizmalarının aksine, 1.5 kDa 4,5'e kadar bir molekül aralığının geçişine izin veren, yüksek iletkenlikli, spesifik olmayan ve seçici olmayan bir işlemdir. mPTP, açıklığı ΔΨ, ATP üretimi, kalsiyum homeostazı, reaktif oksijen türleri (ROS) üretimi ve hücre canlılığı4'ü değiştiren IMM içindeki voltaj kapılı bir kanaldır.
mPTP'nin patolojik aşırılıkta, kontrolsüz ve uzun süreli yüksek iletkenlikli açıklığı, elektrokimyasal gradyanın çökmesine, matris şişmesine, matriks piridin nükleotitlerinin tükenmesine, dış zar rüptürüne, membranlar arası proteinlerin salınmasına (sitokrom c dahil) ve nihayetinde hücre ölümüne yol açar 4,6. Bu patolojik mPTP açıklığı kardiyak iskemi-reperfüzyon hasarı, kalp yetmezliği, travmatik beyin hasarı, çeşitli nörodejeneratif hastalıklar ve diyabet 1,7 ile ilişkilendirilmiştir. Bununla birlikte, düşük iletkenlikli mPTP açıklığı doğada fizyolojiktir ve yüksek iletkenlikli açıklığın aksine, derin depolarizasyona veya mitokondriyal şişmeye yol açmaz4.
Gözeneklerin düşük iletkenlik açıklığı, geçirgenliği ~ 300 Da ile sınırlar, protonların ATP sentezinden bağımsız geçişine izin verir ve fizyolojik proton sızıntısı5'in potansiyel bir kaynağıdır. Fizyolojik mPTP açıklığı, ΔΨ'de kontrollü bir düşüşe neden olur, solunum taşıma zinciri boyunca elektron akışını arttırır ve kısa bir süperoksit patlaması veya parlaması ile sonuçlanır, bu da ROS sinyallemesine katkıda bulunur8. Bu tür geçici mPTP açıklığının düzenlenmesi kalsiyum homeostazı ve normal hücresel gelişim ve olgunlaşma 4,9,10,11 için önemlidir. Örneğin, gelişmekte olan nöronlarda geçici gözenek açıklığı farklılaşmayı tetiklerken, mPTP'nin kapanması olgunlaşmamış kardiyomiyositlerde olgunlaşmayı indükler 4,5.
mPTP'nin sağlık ve hastalıktaki fonksiyonel önemi iyi kurulmuş olmasına rağmen, kesin moleküler kimliği tartışılmaya devam etmektedir. mPTP'nin moleküler yapısı ve işlevi konusundaki ilerleme, başka yerlerde kapsamlı bir şekilde gözden geçirilmiştir12. Kısaca, şu anda, mPTP'nin yüksek ve düşük iletkenlik durumlarının, farklı varlıklar tarafından aracılık edildiği varsayılmıştır12. Önde gelen adaylar, sırasıyla yüksek ve düşük iletkenlik modları için F1 / F0 ATP sentaz (ATP sentaz) ve adenin nükleotid taşıyıcısıdır (ANT), 12.
mPTP'nin gözenek oluşturan bileşeninin tam kimliği konusunda fikir birliği olmamasına rağmen, bazı temel özellikler detaylandırılmıştır. mPTP'nin iyi bilinen bir özelliği, elektrokimyasal gradyan tarafından düzenlenmesidir, böylece İBB'nin depolarizasyonu gözenek açılmasına yol açar13. Önceki çalışmalar, vicinal tiol gruplarının redoks durumunun, mPTP'nin voltaj geçidini değiştirdiğini, böylece oksidasyonun gözenekleri nispeten daha yüksek ΔΨ'lerde açtığını ve tiol grubu azalmasının kapalı mPTP olasılığı14 ile sonuçlandığını göstermiştir. Bununla birlikte, proteinli voltaj sensörünün kimliği bilinmemektedir.
Gözeneklerin açık olasılığını modüle eden çeşitli küçük moleküller tanımlanmıştır. Örneğin, mPTP kalsiyum, inorganik fosfat, yağ asitleri ve ROS ile açılmaya teşvik edilebilir ve adenin nükleotidleri (özellikle ADP), magnezyum, protonlar ve CsA 5,12 tarafından inhibe edilebilir. Bu düzenleyicilerin bazılarının etki mekanizmaları açıklığa kavuşturulmuştur. Mitokondriyal kalsiyum, ATP sentaz15'in β alt birimine bağlanarak mPTP açılımını en azından kısmen tetikler. ROS, ADP'ye olan afinitesini azaltarak ve en iyi çalışılmış proteinli mPTP aktivatörü16 olan siklofilin D (CypD) için afinitesini artırarak mPTP'yi aktive edebilir. mPTP'nin inorganik fosfat ve yağ asitleri tarafından aktivasyon mekanizması daha az açıktır. Endojen inhibitörlere gelince, ADP'nin ANT veya ATP sentazına bağlanarak mPTP'yi inhibe ettiği düşünülürken, magnezyum kalsiyumu bağlanma bölgesinden 15,17,18,19 yerinden oynatarak inhibitör etkisini gösterir.
Düşük pH, ATP sentaz 12,20,21'in düzenleyici oligomisin duyarlılığı veren protein (OSCP) alt biriminin histidin112'sini protonlayarak mPTP açılmasını inhibe eder. mPTP'nin prototipik farmakolojik inhibitörü CsA, CypD'yi bağlayarak ve OSCP22,23 ile ilişkisini önleyerek etki eder. Önceki çalışmalar ayrıca çeşitli CoQ analoglarının mPTP ile etkileşime girdiğini, onu inhibe ettiğini veya24'ü aktive ettiğini göstermiştir. Son çalışmalarda, patolojik olarak açık bir mPTP, aşırı proton sızıntısı ve yenidoğan FXS fare yavrularının ön beyin mitokondrisinde CoQ eksikliğine bağlı olarak verimsiz oksidatif fosforilasyonun kanıtlarını bulduk25.
Gözeneklerin eksojen CoQ ile kapatılması patolojik proton sızıntısını bloke etti ve dendritik dikenlerin morfolojik olgunluğunu indükledi25. İlginç bir şekilde, aynı hayvanlarda, FXS kardiyomiyositleri aşırı CoQ seviyelerine sahipti ve wildtype kontrolleri26'ya kıyasla mPTP olasılığını kapattı. CoQ seviyelerindeki bu dokuya özgü farklılıkların nedeni bilinmemekle birlikte, bulgular endojen CoQ'nun muhtemelen mPTP'nin önemli bir düzenleyicisi olduğu kavramını vurgulamaktadır. Bununla birlikte, bilgimizde büyük bir boşluk vardır, çünkü mPTP'nin CoQ aracılı inhibisyon mekanizması bilinmemektedir.
mPTP'nin düzenlenmesi, hücre sinyalizasyonu ve sağkalımının kritik bir belirleyicisidir4. Bu nedenle, mitokondri içinde mPTP açıklığının saptanması, spesifik patofizyolojik mekanizmalar göz önüne alındığında anahtardır. Tipik olarak, yüksek iletkenlikli gözenek açma eşiği, geçirgenlik geçişini tetiklemek için kalsiyum kullanılarak belirlenir. Bu tür kalsiyum yüklemesi, membran potansiyelinin çökmesine, oksidatif fosforilasyonun hızlı bir şekilde ayrılmasına ve mitokondriyal şişmeye yol açar27,28. Düşük iletkenlikli mPTP açıklığını kendi başına indüklemeden in situ olarak tespit etmek için bir yöntem geliştirmeye çalıştık.
Yaklaşım, mPTP'nin proton sızıntı kanalı olarak rolünden yararlanır. Bunu yapmak için, Clark-Tipi ve TPP + iyon seçici elektrotlar, sızıntı solunumu sırasında izole mitokondride sırasıyla oksijen tüketimini ve membran potansiyelini aynı anda ölçmek için kullanıldı29. mPTP açıklığı eşiği, belirli membran potansiyellerinde proton sızıntısının CsA aracılı inhibisyonunun başlangıcı ile belirlendi. Bu yaklaşım kullanılarak, CoQ fazlalığı bağlamında mPTP'nin voltaj geçidindeki farklılıklar kesin olarak tanımlanmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1</td>
			<td>PP systems</td>
			<td>941039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-11B</td>
			<td>to modify the length of the hamilton synringe as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm</td>
			<td>World Precision Inst. LLC</td>
			<td>DRIREF-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Holder for KWIK-Tips</td>
			<td>World Precision Inst. LLC</td>
			<td>KWIK-2</td>
			<td>&#160;ion selective electrode holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid&#160; (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J</td>
			<td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td></td>
			<td>FXS mice, Fmr1 KO&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ</td>
			<td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td></td>
			<td>FVB mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07938-30</td>
			<td>microsyringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07938-02</td>
			<td>microsyringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete</td>
			<td>PP systems</td>
			<td>OXYTHERM+R</td>
			<td>oxygen electrode and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1374248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9546-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1,P5-diadenosine-5&#8242; pentaphosphate pentasodium (AP5A)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4022-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1644</td>
			<td>medium for density gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5.43841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP+ Electrode Tips (3)</td>
			<td>World Precision Inst. LLC</td>
			<td>TIPTPP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of open probability of the mitochondrial permeability transition pore in the setting of coenzyme q excess

Mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözenekleri (mPTP), sağlık ve hastalıkta önemli olan voltaj kapılı, seçici olmayan, iç mitokondriyal membran (IMM) mega kanalıdır. mPTP, düşük iletkenlikli açıklık sırasında IMM boyunca protonların sızmasına aracılık eder ve özellikle siklosporin A (CsA) tarafından inhibe edilir. Koenzim Q (CoQ), mPTP'nin bir düzenleyicisidir ve CoQ içeriğinde dokuya özgü farklılıklar ve kırılgan X sendromunun (FXS, Fmr1 nakavtı) yenidoğan bir fare modelinde ön beyin ve kalp mitokondrisinde mPTP'nin açık olasılığı bulunmuştur. Bu mutant suşta mPTP açıklığı için voltaj eşiğini belirlemek için bir teknik geliştirdik ve mPTP'nin proton sızıntı kanalı olarak rolünden yararlandık.
Bunu yapmak için, oksijen tüketimi ve membran potansiyeli (ΔΨ), polarografi ve sızıntı solunumu sırasında bir tetrafenilfosfonyum (TPP +) iyon seçici elektrot kullanılarak izole mitokondride eşzamanlı olarak ölçülmüştür. mPTP açıklığı eşiği, belirli membran potansiyellerinde proton sızıntısının CsA aracılı inhibisyonunun başlangıcı ile belirlendi. Bu yaklaşım kullanılarak, mPTP'nin voltaj geçişindeki farklılıklar, CoQ fazlalığı bağlamında kesin olarak tanımlanmıştır. Bu yeni teknik, mPTP'nin düşük iletkenlikli açılmasının fizyolojik ve patolojik düzenlemesinin anlaşılmasını arttırmak için gelecekteki araştırmalara izin verecektir.

Bu deneylerde üretilen tipikO2 tüketimi ve ΔΨ eğrileri gösterilmiştir (Şekil 1A,B). TPP + kalibrasyonu ile voltaj sinyalindeki logaritmik düşüş, her deneyin başında gösterilir. Bu logaritmik modelin yokluğu, TPP + seçici elektrot ile ilgili bir sorun olduğunu düşündürebilir. Mitokondri tipik olarak solunum tamponuna eklendikten hemen sonra ΔΨ üretir. ΔΨ, Nernst denklemine dayanan TPP + voltajındaki değişikliklerd...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Open Probability of the Mitochondrial Permeability Transition Pore in the Setting of Coenzyme Q Excess at JoVE.com

Assessment of Open Probability of the Mitochondrial Permeability Transition Pore in the Setting of Coenzyme Q Excess

Bu yöntem, mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin düşük iletkenlikli proton sızıntısına katkısından, vahşi tip kontrolüne kıyasla artmış kardiyomiyosit mitokondriyal koenzim Q içeriğine sahip yenidoğan kırılgan X sendromlu farelerde gözenek açılması için voltaj eşiğini belirlemek için kullanır.

Mitokondriyal Geçirgenlik Geçiş Gözünün Koenzim Q Fazlalığı Ortamında Açık Olasılığının Değerlendirilmesi

The mitochondrial permeability transition pore (mPTP) is a voltage-gated, nonselective, inner mitochondrial membrane (IMM) mega-channel important in ...

Bu protokol, mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin düşük iletkenlik açıklığını araştırmak için yeni bir yol sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, mitokondriyal membran potansiyelinin bir fonksiyonu olarak gözeneklerin açık olasılığını ölçmenin kolay bir yolunu sağlamasıdır. Bu teknik, herhangi bir organ sisteminden ve türünden izole edilen mitokondrilere kolayca uygulanabilir.Elektrot diskinin kubbesinin üzerine %50 damla potasyum klorür elektrolit çözeltisi yerleştirerek oksijen elektrodunun kalibrasyonu ile başlayın. Elektrolit damlasının üzerine biraz daha büyük bir politetrafloroetilen membran parçası ile kaplanmış iki santimetrekarelik sigara kağıdı ara parçasından küçük bir parça yerleştirin. Ardından, küçük elektrot diski O-ring'i elektrotun kubbesi üzerine itmek için aplikatör aletini kullanın.Daha sonra, rezervuarı elektrolit çözeltisi ile iyice doldurun. Daha büyük O-ring'i elektrot diskinin etrafındaki girintiye iyice yerleştirin. Ardından diski elektrot odasına takın ve kontrol ünitesine bağlayın.Reaksiyon odasına iki mililitre havaya doymuş deiyonize su ve politetrafloroetilen kaplı mıknatıs ekleyin. İşiniz bittiğinde, odayı kontrol ünitesinin arkasına bağlayın. Sıcaklığı 37 santigrat dereceye ve karıştırma hızını 100'e ayarlayın.Kalibrasyondan önce sistem sıcaklığının 10 dakika boyunca dengelenmesine izin verin. Doğru sıcaklığı, karıştırma hızını ve basıncı sağladıktan sonra, Kalibrasyon sekmesi altında, sıvı faz kalibrasyonu gerçekleştirmek için Sıvı Faz Kalibrasyonu seçeneğini belirleyin. Ardından Tamam'a basın ve sinyalin platoya gelmesini bekleyin.Yaylaya ulaşıldığında Tamam'a basın. Daha sonra odaya sıfır oksijen sağlamak için yaklaşık 20 miligram sodyum ditionit ekleyin. Yine, OK tuşuna basın ve kalibrasyonu kabul etmek için Kaydet düğmesine tıklamadan önce sinyalin platoya gelmesini bekleyin. Tetrafenilfosfonyum veya TPP seçici elektrot tertibatını hazırlamak için, TPP seçici elektrot ucunu bir şırınga ve esnek bir iğne kullanarak 10 milimolar TPP çözeltisi ile doldurun.Elektrot ucunu doldururken hava kabarcıklarından kaçının. Dahili referans elektrodunu TPP ucuna yerleştirmek için elektrot tutucu kapağını gevşetin. İşiniz bittiğinde, referans elektrodu ve elektrot tutucu dahil olmak üzere TPP seçici elektrot aparatını monte edin.Ucu sabitlemek için kapağı sıkın. Ardından kabloyu kontrol kutusunun yardımcı portuna ve TPP elektrot tutucusuna bağlayın. TPP seçici ve referans elektrotlarını, iyon seçici elektrotlar için uyarlanmış piston tertibatına yerleştirin.Referans elektrodunu kontrol kutusunun referans portuna bağlayın. Daha sonra, reaksiyon odasını hazırlamak için, hava kabarcıkları oluşturmadan reaksiyon odasına bir mililitre reaksiyon karışımı ekleyin. TPP seçici ve referans elektrotları yerindeyken, uyarlanmış piston tertibatını kullanarak odayı kapatın.Oda kapatıldıktan sonra, plastik borularla modifiye edilmiş ayrı mikro şırıngalar kullanarak doğrudan reaksiyon odasına ek reaktifler sürün. Kurulum hazır olduğunda, kayda başlamak için Git ' i seçin. Kararlı bir voltaj sinyali elde edildikten sonra, üç mikromolar'lık bir nihai konsantrasyon elde etmek için 0.1 milimolar TPP çözeltisinin bir mikromolar artışını ekleyerek TPP seçici elektrodu kalibre edin.Her eklemede TPP voltaj sinyalindeki logaritmik düşüşü gözlemleyin. Oksijen ve TPP izlerini stabilize ettikten sonra, piston tertibatındaki reaktif ekleme portu aracılığıyla reaksiyon odasına mililitre başına 0.1 miligramlık son konsantrasyona 100 mikrogram taze hazırlanmış kardiyomiyosit mitokondri ekleyin. Mitokondri enerjilendirildikçe ve oksijen tüketirken odadaki oksijen seviyelerindeki düşüşü gözlemleyin.Ayrıca, mitokondri bir membran potansiyeli ürettiği ve çözeltiden TPP'yi aldığı için TPP voltaj sinyalindeki ani artışa bakın. Daha sonra Devlet 4 solunumunu indüklemek için mililitre oligomisin başına 2.5 mikrogram ekleyin. Mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin veya mPTP'nin açık olasılığını değerlendirmek için, sızıntı solunumu sırasında zaman içinde membran potansiyelindeki düşüşü gözlemleyin.İstenilen membran potansiyeline ulaşıldıktan sonra, mPTP'nin bu spesifik membran potansiyelindeki açık olasılığını değerlendirmek için reaksiyon odasına bir mPTP inhibitörü olarak bir mikromolar siklosporin A ekleyin. Daha sonra siklosporin A'nın siklosporin A ilavesinden önce ve sonra oksijen tüketimi ve membran potansiyeli üzerindeki etkisini ölçün. Eşzamanlı oksijen tüketimi ve membran potansiyelinin temsili eğrilerinde, iki mikromolar TPP kalibrasyon seviyesine göre yüksek membran potansiyeli sıfır, orta beş ve düşük 10 milivolt olarak ayarlanmıştır.Sıfır milivolttaki mitokondri% 100 mPTP kapalı olasılık sergiledi ve 10 milivoltta% 100 açık olasılık sergiledi. Oligomisin ilavesinden sonra, oksijen tüketiminde önemli bir fark gözlenmemiştir, bu da adenozin trifosfatın veya ATP sentazın Devlet 2 solunumuna minimum düzeyde katkıda bulunduğunu düşündürmektedir. Ayrıca, siklosporin A ilavesinden önceki ve sonraki oksijen tüketim hızı ve membran potansiyeli karşılaştırılmıştır.Oksijen tüketim hızındaki bir azalma ve membran potansiyelinin stabilizasyonundaki bir artış, açık bir mPTP'nin kapandığını gösterdi. mPTP kapatıldığında, oksijen tüketim oranında bir azalma olmadı ve membran potansiyeli düşmeye devam etti. Sonuçlar, FVB kontrolünde ve Fmr1 nakavt kardiyak mitokondrisinde yüksek ve düşük membran potansiyellerinde benzer kapalı ve açık mPTP olasılıklarını göstermiştir.Ara membran potansiyelinde, Fmr1 nakavt kardiyak mitokondri, FVB kontrollerine kıyasla kapalı mPTP olasılığının arttığını göstermiştir. Odaya hava kabarcıkları sokulmamalıdır, çünkü bu dengesiz oksijen tüketimi okumalarına yol açacak ve yorumlamayı zorlaştıracaktır. Bu prosedürü takiben, kalsiyum yükleme kapasitesi ölçülebilir.Bu yöntem, gözeneklerin yüksek iletkenlik açıklığını değerlendirir ve tekniğimizin sonuçlarını tamamlar.

Research

JoVE Journal

Biology

The Structure of Skilled Forelimb Reaching in the Rat: A Movement Rating Scale

Sıçan ulaşmak Nitelikli ön ayakları Yapısı: Hareket Ölçeği

Skilled reaching for food is an evolutionary ancient act and is displayed by many animal species, including those in the sister clades of rodents and ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

Rotorod Rat Yürüyüş Kalitatif Analiz için bir yöntem olarak kullanımı

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Doğrudan Yetişkin Zebra balığı Böbrek Hücre Nakli

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Mitokondri İzole Fare Heart Geçirgenliği Geçiş Gözenek Açma Multi-parametre ölçümü

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Ca Rolleri değerlendirilmesi için Görüntüleme Testi Canlı<sup&gt; 2 +</supGözenek oluşturucu Toksin yaraların tamiri&gt; ve sfingomiyelinaz

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Kalsiyum değerlendirilmesi Bozulmamış İskelet kas liflerinin içinde Sparks

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

<em&gt; Xenopus</emFluorometri ile&gt; Yumurta Kes-açık Vazelin Gap Gerilim-kelepçe Tekniği

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

İzole Kan-perfüze Sıçan Akciğer Hazırlık Tek Mikrodamar Geçirgenliği miktarının

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Ozmotik Su Geçirgenliği Katsayısı (P Ölçme<sub&gt; F</sub&gt;) Küresel Hücreleri: Bir Örnek olarak İzole Bitki protoplastlan

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...