수술 내 수술 모니터 분석은 암 조직의 복잡한 절제를 정확하고 신속하게 확인하는 진단 도구가 필요하기 때문에 종양 절제 수술에서 여전히 큰 도전입니다. 그런 다음 긍정적 인 수술 마진으로 인해 반복적 인 수술을 피할 수 있습니다. 당사의 고속 개방 자외선 광음향 현미경은 다섯 밀리미터 정사각형의 이미징 영역으로 18분 이내에 조직 샘플의 조직학적 이미지를 표지할 수 있어 수술 내 수술 마진 분석에 큰 잠재력을 보여줍니다.
절차를 시연하는 것은 Xiufeng Li, 내 실험실에서 마지막 학년 박사 과정 학생이 될 것입니다. 파장 266나노미터의 Q 스위치 다이오드 펌핑 고체 레이저를 여기 소스로 사용하여 현미경 시스템의 광 조명 설정부터 시작하십시오. 두 개의 볼록 렌즈를 설치하여 레이저 빔을 확장하고 공간 필터링을 위해 첫 번째 볼록 렌즈의 초점에 핀홀을 배치합니다.
1D 갈바노미터 거울을 사용하여 레이저 빔을 위쪽으로 반사하십시오. 대물 렌즈의 도움으로 레이저 빔을 샘플에 집중시킵니다. 얇은 석영 커버 슬립으로 덮인 바닥에 광학적으로 투명한 창문이있는 실험실 제작 물 탱크에 활성 영역이 위쪽을 향하게하는 링 모양의 집중 UT를 고정 한 다음 물 탱크를 현미경의 두 축 수동 단계에 부착하여 UT의 측면 위치를 제어하십시오. 완료되면 UV 레이저를 켜고 UT의 위치를 조정하여 레이저 빔이 UT의 중심을 통과 할 수있게 한 다음 UV 레이저를 끄고 물 탱크를 탈이온수로 채워 UT를 완전히 담그십시오. UT의 출력을 두 개의 증폭기에 연결하여 총 이득 56데시벨을 얻은 다음 두 번째 증폭기의 출력을 컴퓨터에 설치된 데이터 수집 카드 또는 DAQ에 연결합니다.
그런 다음 샘플 홀더를 xy 전동 스테이지에 연결된 z축 수동 스테이지에 연결한 다음 샘플 홀더의 빈 구멍을 둘러싸는 양면 테이프 네 개를 배치합니다. 그런 다음 검은 테이프를 유리 슬라이드에 부착 한 다음 유리 슬라이드를 배치하여 검은 색 테이프가 아래쪽을 향하도록 샘플 홀더의 구멍을 덮습니다. 샘플 홀더 위의 유리 슬라이드를 누른 후 샘플 홀더를 내려 유리 슬라이드를 물에 담그십시오.
링 모양의 UT와 증폭기를 분리한 다음 UT를 펄스/수신기에 연결하고 펄스/수신기의 출력을 오실로스코프에 연결합니다. 펄스 진폭이 여섯 개이고 이득이 20데시벨인 펄스 에코 모드로 펄스 / 수신기를 작동시킵니다. 파라미터가 설정되면 샘플 홀더의 z-위치를 조정하고 초음파 신호가 최대인 음향 초점면의 위치를 정의합니다.
게인을 60데시벨로 설정하기 전에 펄스/수신기를 전송 모드로 변경한 다음 레이저 출력을 활성화하고 대물 렌즈의 z-위치를 조정하여 오실로스코프에서 측정된 광음향 또는 PA 신호를 최대화합니다. 생성된 PA 신호를 대칭 및 최대로 만들려면 링 모양의 UT의 횡 위치를 조정한 다음 샘플 홀더의 z-위치를 조정하여 PA 신호를 최대화합니다. 대물 렌즈의 z-위치 및 샘플 홀더에 대한 조정을 반복하여 PA 신호의 대칭과 진폭을 최적화합니다.
PA 신호가 최적화되면 PA 파동이 오실로스코프의 UT에 도달하는 데 걸리는 시간 지연 또는 시간을 기록하십시오. 샘플 홀더를 이동하여 검은색 테이프의 다른 위치를 이미지화합니다. 검정 테이프의 각 위치에서 생성된 PA 신호가 이전에 측정된 것과 동일한 시간 지연을 갖도록 샘플 홀더 평탄도를 조정합니다.
시스템 정렬이 완료되면 레이저를 끄고 UT를 두 증폭기에 연결합니다. 포르말린 고정 및 파라핀 포매된 마우스 뇌 조각을 제조하기 위해, 수확된 뇌를 10% 중성 완충 포르말린에 고정시켰다. 24 시간 후, 등급이 매겨진 알코올로 탈수하고, 자일렌으로 클리어링하고, 파라핀으로 임베딩하여 고정 된 뇌를 처리하십시오.
마이크로톰을 사용하여 임베디드 뇌의 다섯 마이크로미터 두께의 조각을 얻으십시오. 샘플 조각을 석영 슬라이드에 올려 놓고 섭씨 60도의 오븐에서 한 시간 동안 건조시킵니다. 나중에, 파라핀의 높은 배경 신호를 피하기 위해 클리어링제로 뇌 섹션을 파라핀화하십시오.
신선한 마우스 뇌 조각을 제조하기 위해, 수확된 마우스 뇌를 PBS로 세척한 다음, 뇌 샘플의 다섯 밀리미터 두께 조각을 손으로 절단한 다음, 뇌 조각을 PBS로 세척하여 단면상의 혈액을 제거하였다. 샘플 배치를 위해, 두께 10 마이크로미터의 UV 투명 폴리에틸렌 멤브레인으로 실험실 제작 샘플 탱크를 준비한 다음, 멤브레인에 물 한 방울을 첨가하고 생물학적 샘플을 샘플 탱크에 올려 놓고 물을 덮는다. 다음으로, 샘플 홀더의 빈 구멍을 덮을 수 있도록 샘플 홀더 위에 샘플 포함 탱크를 놓습니다.
UV 레이저를 외부 트리거 모드로 설정하고 실험실에서 제작한 실험실 뷰 프로그램을 사용하여 원고에 설명된 대로 스캔 파라미터를 설정합니다. x축 및 y축 모터의 이동 단계 수를 설정하여 작은 영역에서 시험 스캔을 시작한 다음 z축 수동 단계를 조정하여 최대 PA 신호를 얻기 위해 샘플을 초점면에 배치합니다. x 축 및 y 축 모터를 원하는 시작 지점으로 이동하고 xn 및 yn 값을 설정하여 스캔 영역을 설정 한 후 이미지 수집 프로그램을 시작하십시오.
이미지가 필요한 경우 레이저를 끄고 샘플 홀더를 제거하십시오. 신선한 생물학적 조직을 10% 중성 완충 포르말린에 보관하십시오. 수집된 PA 신호를 사용하여 실험실에서 제작한 이미지 처리 알고리즘을 사용하여 최대 진폭 프로젝션 이미지를 재구성합니다.
대표적인 분석은 FFPE 마우스 뇌 조각의 UV-PAM 및 H & E 이미지를 보여줍니다. 확대된 UV-PAM 이미지에서, 개별 세포 핵은 해결될 수 있었다. 해당 세포 핵은 표준 H & E 염색 이미지에서 발견되어 세포 이미징을위한 현재 시스템의 높은 정확도를 보여줍니다.
그레이스케일 UV-PAM 이미지를 가상 H&E 염색 이미지로 전송하기 위해 딥 러닝 알고리즘이 적용되었습니다. 시스템 정렬 중에 UV광이 중심을 통과 할 수 있도록 링 모양의 초음파 변환기의 위치를 조정하는 것이 중요합니다. 이를 통해 감지 가능한 광음향 신호를 얻을 수 있으며 레이저가 켜져있을 때 더욱 최적화 할 수 있습니다.
우리의 분류 알고리즘은 이미지의 종양과 정상 영역을 분류하기 위해 추가로 통합 될 수 있으며, 의료 전문가를위한 보조 이미징 및 진단 플랫폼 역할을합니다.
