Höghastighets ultraviolett fotoakustisk mikroskopi för histologisk avbildning med virtuell färgning assisterad av djupinlärning

Intraoperativ kirurgisk monitoranalys är fortfarande en stor utmaning vid tumörresektionsoperationer eftersom det kräver ett diagnostiskt verktyg för att bekräfta den komplexa excisionen av cancervävnad exakt och snabbt. Det är då möjligt att undvika upprepade operationer på grund av en positiv kirurgisk marginal. Vår höghastighets öppna ultraviolett fotoakustiska mikroskopi kan ge märkta histologiska bilder av vävnadsprover inom 18 minuter med ett bildområde på fem till fem millimeter kvadrater, vilket visar stor potential för intraoperativ kirurgisk marginalanalys.

Demonstrerar proceduren kommer att vara Xiufeng Li, en doktorand från sista året från mitt laboratorium. Börja med att ställa in den optiska belysningen för det mikroskopiska systemet genom att använda en Q-switch-diodpumpad solid state-laser med en våglängd på 266 nanometer som excitationskälla. Installera två konvexa linser för att expandera laserstrålen och placera ett nålhål nära brännpunkten för den första konvexa linsen för rumslig filtrering.

Använd en 1D-galvanometerspegel för att reflektera laserstrålen uppåt. Med hjälp av objektivlinsen fokuserar du laserstrålen på ett prov. Fäst den ringformade fokuserade UT med det aktiva området uppåt i en laboratorietillverkad vattentank med ett optiskt transparent fönster i botten täckt av en tunn kvartsöverdragslip och fäst sedan vattentanken i ett tvåaxligt manuellt steg i mikroskopet för att styra UT: s laterala position. När du är klar, slå på UV-lasern och justera UT: s position så att laserstrålen kan passera genom mitten av UT, stäng sedan av UV-lasern och fyll vattentanken med avjoniserat vatten för att helt fördjupa UT. Anslut utgången från UT till två förstärkare för att få en total förstärkning på 56 decibel och anslut sedan utgången från den andra förstärkaren till ett datainsamlingskort, eller DAQ, installerat i datorn.

Fäst sedan en provhållare i ett manuellt steg på z-axeln anslutet till xy-motoriserade steg följt av att placera fyra stycken dubbelsidig tejp som omger provhållarens tomma hål. Senare fortsätter du att justera systemet genom att fästa svart tejp på en glasskiva och sedan placera glasskivan för att täcka provhållarens hål med den svarta tejpen nedåt. Efter att ha tryckt på glasskivan på provhållaren, sänk ner provhållaren för att fördjupa glasrutschbanan i vattnet.

Koppla bort den ringformade UT och förstärkarna, anslut sedan UT till pulsern/mottagaren och pulsörens/mottagarens utgång till ett oscilloskop. Använd pulsern/mottagaren i pulsekoläget med pulsamplituden på sex och förstärkningen på 20 decibel. När parametrarna är inställda, justera provhållarens z-position, definiera positionen för det akustiska fokalplanet där ultraljudssignalerna är maximala.

Ändra pulsen/mottagaren till överföringsläget innan du ställer in förstärkningen på 60 decibel, aktivera sedan laserutgången och justera objektivlinsens z-position för att maximera de fotoakustiska signalerna eller PA-signalerna som mäts av oscilloskopet. För att göra den genererade PA-signalen symmetrisk och maximal, justera sidoläget för den ringformade UT och justera sedan provhållarens z-position för att maximera PA-signalerna. Upprepa justeringarna för objektivlinsens z-position och provhållaren för att optimera PA-signalernas symmetri och amplitud.

När PA-signalerna är optimerade, registrera tidsfördröjningen eller den tid det tar för PA-vågorna att nå UT på oscilloskopet. Flytta provhållaren för att avbilda olika positioner på den svarta tejpen. Justera provhållarnas planhet så att PA-signalerna som genereras från varje position i den svarta tejpen har samma tidsfördröjning som den som mättes tidigare.

När systeminriktningen är klar stänger du av lasern och ansluter UT till de två förstärkarna. För att förbereda en formalin-fixerad och paraffininbäddad mushjärnskiva, fixade den skördade hjärnan i 10% neutralt buffrat formalin. Efter 24 timmar, bearbeta den fasta hjärnan genom uttorkning med graderad alkohol, rensa med xylen och bädda in med paraffin.

Använd en mikrotom för att få fem mikrometer tjocka skivor av den inbäddade hjärnan. Placera provskivorna på kvartsskivorna för att torka i en ugn vid 60 grader Celsius i en timme. Senare de-paraffinisera hjärnsektionerna med ett clearingmedel för att undvika höga bakgrundssignaler av paraffin.

För att förbereda en ny mushjärnskiva, tvätta den skördade mushjärnan med PBS och skär sedan en fem millimeter tjock skiva av hjärnprovet för hand följt av att tvätta hjärnskivan med PBS för att ta bort blodet på tvärsnittet. För provplaceringen, förbered en laboratorietillverkade provtank med ett UV-transparent polyetenmembran med en tjocklek av 10 mikrometer, tillsätt sedan en droppe vatten till membranet och placera det biologiska provet på provtanken för att täcka vattnet. Placera sedan provbehållaren på provhållaren så att den täcker provhållarens tomma hål.

Ställ in UV-lasern på det externa triggerläget och använd det labbbyggda labbvyprogrammet för att ställa in skanningsparametrarna enligt beskrivningen i manuskriptet. Starta provskanningen på ett litet område genom att ställa in antalet rörliga steg för x- och y-axelmotorerna och justera sedan z-axelns manuella steg för att placera provet på fokalplanet för att erhålla maximala PA-signaler. När du har flyttat både x- och y-axelmotorer till önskad startpunkt och ställt in skanningsområdet genom att ställa in xn- och yn-värdena startar du bildförvärvsprogrammet.

När bilderna krävs, stäng av lasern och ta bort provhållaren. Förvara färska biologiska vävnader i 10% neutralt buffrat formalin. Använd de insamlade PA-signalerna för att rekonstruera den maximala amplitudprojektionsbilden med hjälp av en laboratoriebyggd bildbehandlingsalgoritm.

Den representativa analysen visar UV-PAM- och H&E-bilderna av en FFPE-mushjärnskiva. I den inzoomade UV-PAM-bilden kunde de enskilda cellkärnorna lösas. Motsvarande cellkärnor hittades i de vanliga H & E-färgade bilderna, vilket visar den höga noggrannheten hos det nuvarande systemet för cellulär avbildning.

En djupinlärningsalgoritm tillämpades för att överföra UV-PAM-bilden i gråskala till en virtuell H&E-färgad bild. Det är viktigt att justera positionen för den ringformade ultraljudsgivaren så att UV-ljuset kan passera genom ett centrum under systeminriktningen. Detta säkerställer att en detekterbar fotoakustisk signal kan erhållas och optimeras ytterligare när lasern är på.

Vår klassificeringsalgoritm kan införlivas ytterligare för att klassificera tumör och normala regioner i bilderna, som fungerar som en hjälpmedelsavbildning och en diagnostisk plattform för medicinsk personal.