Name: genome-wide profiling of transcription factor-dna binding interactions in candida albicans: a comprehensive cut&amp;run method and data analysis workflow
Uploaded: 2022-04-01T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow at JoVE.

نشكر جميع الأعضاء السابقين والحاليين في مختبري نوبيل وهيرنداي على تعليقاتهم على المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (NIGMS) التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NIGMS) رقم R35GM124594 ومن قبل عائلة Kamangar في شكل كرسي موهوب ل C.J.N. تم دعم هذا العمل أيضا من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (NIAID) رقم الجائزة R15AI137975 إلى A.D.H.C.L.E. بدعم من المعهد الوطني لبحوث الأسنان والوجه والمعاهد الوطنية للصحة (NIDCR) رقم الزمالة F31DE028488. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل وجهات نظر الممولين. ولم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة؛ في جمع البيانات أو تحليلها أو تفسيرها؛ في كتابة المخطوطة ؛ أو في قرار نشر النتائج.

1. وضع علامات على سلالات C. albicans 
<ol><li>قم بتحميل الجين محل الاهتمام ، إلى جانب تسلسلاته المحيطة بالمنبع والمصب التي تبلغ 1 كيلوبايت ، من قاعدة بيانات Candida Genome إلى أداة تصميم التمهيدي (انظر جدول المواد). صمم دليلا للحمض النووي الريبي (gRNA) من خلال تمييز 50 نقطة أساس في ?...

<ol>
	<li>Gulati, M., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms:+development,+regulation,+and+molecular+mechanisms.">Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms.</a> Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).</li><li>Lohse, M. B., Gulati, M., Johnson, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regulation+of+single-and+multi-species+Candida+albicans+biofilms.">Development and regulation of single-and multi-species Candida albicans biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 19-31 (2018).</li><li>Nobile, C. J., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms+and+human+disease.">Candida albicans biofilms and human disease.</a> Annual Review of Microbiology. 69 (1), 71-92 (2015).</li><li>Nobile, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recently+evolved+transcriptional+network+controls+biofilm+development+in+Candida+albicans.">A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans.</a> Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).</li><li>Iracane, E., Vega-Est&#233;vez, S., Buscaino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+and+off:+epigenetic+regulation+of+C.+albicans+morphological+switches.">On and off: epigenetic regulation of C. albicans morphological switches.</a> Pathogens. 10 (11), 1463 (2021).</li><li>Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Hernday, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+chromatin+accessibility+in+regulating+the+Candida+albicans+white-opaque+phenotypic+switch.">The roles of chromatin accessibility in regulating the Candida albicans white-opaque phenotypic switch.</a> Journal of Fungi. 7 (1), 37 (2021).</li><li>Mancera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+complex+transcription+network+controlling+biofilm+formation+in+candida+species.">Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in candida species.</a> eLife. 10, 64682 (2021).</li><li>Lohse, M. B., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+Wor4,+a+new+transcriptional+regulator+of+white-opaque+switching.">Identification and characterization of Wor4, a new transcriptional regulator of white-opaque switching.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (3), 721-729 (2016).</li><li>Hernday, A. D., Noble, S. M., Mitrovich, Q. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+molecular+biology+in+Candida+albicans.">Genetics and molecular biology in Candida albicans.</a> Methods in Enzymology. 470, 737-758 (2010).</li><li>Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+and+microarray-based+analysis+of+protein+location.">Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location.</a> Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).</li><li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733 (2015).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIC+and+ChEC:+Genomic+mapping+of+chromatin+proteins.">ChIC and ChEC: Genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856 (2017).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+in+situ+genome-wide+profiling+with+high+efficiency+for+low+cell+numbers.">Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers.</a> Nature Protocols. 13 (5), 1006-1019 (2018).</li><li>Nguyen, N., Quail, M. M. F., Hernday, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient,+rapid,+and+recyclable+system+for+CRISPR-mediated+genome+editing+in+Candida+albicans.">An efficient, rapid, and recyclable system for CRISPR-mediated genome editing in Candida albicans.</a> American Society For Microbiology. 2 (2), 00149 (2017).</li><li>Ennis, C. L., Hernday, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+markerless+CRISPR-mediated+system+for+genome+editing+in+Candida+auris+reveals+a+conserved+role+for+Cas5+in+the+caspofungin+response.">A markerless CRISPR-mediated system for genome editing in Candida auris reveals a conserved role for Cas5 in the caspofungin response.</a> Microbiology Spectrum. 9 (3), 0182021 (2021).</li><li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+CUT&amp;RUN+chromatin+profiling+tools.">Improved CUT&amp;RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314 (2019).</li><li>Skrzypek, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Candida+Genome+Database+(CGD):+Incorporation+of+Assembly+22,+systematic+identifiers+and+visualization+of+high+throughput+sequencing+data.">The Candida Genome Database (CGD): Incorporation of Assembly 22, systematic identifiers and visualization of high throughput sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 45, 592-596 (2017).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li><li>Boyd, J., Rodriguez, P., Schjerven, H., Frietze, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ssvQC:+an+integrated+CUT&amp;RUN+quality+control+workflow+for+histone+modifications+and+transcription+factors.">ssvQC: an integrated CUT&amp;RUN quality control workflow for histone modifications and transcription factors.</a> BMC Research Notes. 14 (1), 366 (2021).</li><li>Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BigWig+and+BigBed:+enabling+browsing+of+large+distributed+datasets.">BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets.</a> Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).</li><li>Homann, O. R., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MochiView:+Versatile+software+for+genome+browsing+and+DNA+motif+analysis.">MochiView: Versatile software for genome browsing and DNA motif analysis.</a> BMC Biology. 8, 49 (2010).</li><li>Hainer, S. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+chromatin+profiling+using+CUT&amp;RUN.">High-resolution chromatin profiling using CUT&amp;RUN.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Rodriguez, D. L., Quail, M. M., Hernday, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+circuits+regulating+developmental+processes+in+Candida+albicans.">Transcriptional circuits regulating developmental processes in Candida albicans.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 605711 (2020).</li><li>Zhu, Q., Liu, N., Orkin, S. H., Yuan, G. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;amp;RUNTools:+a+flexible+pipeline+for+CUT&amp;amp;RUN+processing+and+footprint+analysis.">CUT&amp;amp;RUNTools: a flexible pipeline for CUT&amp;amp;RUN processing and footprint analysis.</a> Genome Biology. 20 (1), 192 (2019).</li><li>Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+expressed+loci+are+vulnerable+to+misleading+ChIP+localization+of+multiple+unrelated+proteins.">Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18602-18607 (2013).</li></ol>

يقدم هذا البروتوكول خط أنابيب تجريبي وحسابي شامل لتوطين TFs التنظيمية على نطاق الجينوم في C. albicans. وهي مصممة لتكون في متناول أي شخص لديه تدريب قياسي في علم الأحياء الدقيقة والبيولوجيا الجزيئية. من خلال الاستفادة من النطاق الديناميكي العالي ومتطلبات إدخال العينات المنخفضة لفحص CUT & RUN وت?...

المبيضات البيضاء هي مسببات أمراض فطرية بشرية متعددة الأشكال ذات صلة سريريا موجودة في مجموعة متنوعة من أنماط النمو المختلفة ، مثل وضع نمو العوالق (العائمة الحرة) وكمجتمعات من الخلايا الملتصقة بإحكام محمية بمصفوفة خارج الخلية ، والمعروفة باسم وضع الأغشية الحيوية للنمو1،2،3. على غرار العمليات التنموية والخلوية الأخرى ، يعد تطوير الأغشية الحيوية سمة ضراوة C. albicans المهمة التي من المعروف أنه يتم التحكم فيها على مستوى النسخ بواسطة عوامل النسخ التنظيمية (TFs) التي ترتبط بالحمض النووي بطريقة محددة التسلسل4. في الآونة الأخيرة ، ظهرت منظمات الكروماتين ومعدلات الهيستون أيضا كمنظمين مهمين لتشكيل الأغشية الحيوية C. albicans 5 و morphogenesis6 عن طريق التوسط في الوصول إلى الحمض النووي. لفهم البيولوجيا المعقدة لهذا العامل الممرض الفطري المهم ، فإن الطرق الفعالة لتحديد التوطين على نطاق الجينوم ل TFs محددة خلال العمليات التنموية والخلوية المتميزة أمر قيم.
الترسيب المناعي للكروماتين متبوعا بالتسلسل (ChIP-seq) هو طريقة تستخدم على نطاق واسع للتحقيق في تفاعلات البروتين والحمض النووي في C. albicans 5,6 وقد حلت إلى حد كبير محل الترسيب المناعي الأكثر كلاسيكية للكروماتين متبوعا بطريقة microarray (ChIP-chip)9. ومع ذلك ، تتطلب كل من طرق ChIP-seq و ChIP-chip عددا كبيرا من خلايا الإدخال10 ، والتي يمكن أن تكون عاملا معقدا عند التحقيق في TFs في سياق عينات وطرق نمو محددة ، مثل الأغشية الحيوية التي تم جمعها من المرضى أو النماذج الحيوانية للعدوى. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما ينتج عن اختبار الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) كمية كبيرة من إشارة الخلفية في جميع أنحاء الجينوم ، مما يتطلب مستوى عاليا من التخصيب للهدف محل الاهتمام لفصل الإشارة بشكل كاف عن الضوضاء. في حين أن فحص رقاقة ChIP-chip قديم إلى حد كبير اليوم ، فإن أعماق التسلسل اللازمة ل ChIP-seq تجعل هذا الفحص مكلفا للغاية بالنسبة للعديد من الباحثين ، وخاصة أولئك الذين يدرسون العديد من TFs و / أو البروتينات المرتبطة بالكروماتين.

الانقسام تحت الأهداف والإطلاق باستخدام النوكليز (CUT & RUN) هو بديل جذاب ل ChIP-seq. تم تطويره من قبل مختبر Henikoff في عام 2017 للتحايل على قيود الانقسام الداخلي ChIP-seq والكروماتين متبوعا بتسلسل ChEC-seq11,12 ، وهي طريقة أخرى لتحديد تفاعلات البروتين والحمض النووي على مستوى الجينوم ، مع توفير خرائط عالية الدقة على مستوى الجينوم ل TFs والبروتينات المرتبطة بالكروماتين13 . يعتمد CUT & RUN على الهضم المستهدف للكروماتين داخل النوى المتخلل باستخدام نوكلياز المكورات الدقيقة المربوطة ، يليه تسلسل شظايا الحمض النووي المهضومة 9,10. نظرا لأن شظايا الحمض النووي يتم إنشاؤها على وجه التحديد في المواقع المرتبطة ببروتين ذي أهمية ، بدلا من توليدها في جميع أنحاء الجينوم عن طريق التجزئة العشوائية كما هو الحال في اختبارات ChIP ، فإن نهج CUT & RUN يؤدي إلى انخفاض كبير في إشارات الخلفية ، وبالتالي ، يتطلب 1/10عشر من عمق التسلسل مقارنة ب ChIP-seq11,13 ، 14. وتؤدي هذه التحسينات في نهاية المطاف إلى تخفيضات كبيرة في تكاليف التسلسل وتخفيضات في العدد الإجمالي لخلايا المدخلات اللازمة كمواد أولية لكل عينة.
هنا ، يتم وصف بروتوكول CUT & RUN قوي تم تكييفه وتحسينه لتحديد توطين TFs على مستوى الجينوم في خلايا C. albicans المعزولة عن الأغشية الحيوية وثقافات العوالق. كما يتم تقديم خط أنابيب شامل لتحليل البيانات ، والذي يمكن من معالجة وتحليل بيانات التسلسل الناتجة ويتطلب من المستخدمين أن يكون لديهم الحد الأدنى من الخبرة في الترميز أو المعلوماتية الحيوية. باختصار ، يصف هذا البروتوكول وضع علامات على جينات ترميز TF ، وحصاد الخلايا البيوفيلمية والعوالق ، وعزل النوى المتخلل السليمة ، والحضانة بالأجسام المضادة الأولية ضد البروتين المحدد أو البروتين الموسوم بالظهارة ذات الأهمية ، وربط بروتينات الاندماج الخيمرية A / G-micrococcal nuclease (pAG-MNase) بالأجسام المضادة الأولية ، واستعادة الحمض النووي الجينومي بعد هضم الكروماتين ، وإعداد مكتبات الحمض النووي الجينومية للتسلسل.
يتبع بروتوكول CUT & RUN التجريبي خط أنابيب لتحليل البيانات مصمم لهذا الغرض ، والذي يأخذ قراءات تسلسل الحمض النووي الخام بتنسيق FASTQ وينفذ جميع خطوات المعالجة المطلوبة لتوفير قائمة كاملة بالمواقع المخصبة بشكل كبير المرتبطة ب TF ذات الأهمية (التي يستهدفها الجسم المضاد الأساسي). لاحظ أن خطوات متعددة من بروتوكول إعداد المكتبة الموصوف قد تم تكييفها وتحسينها خصيصا لتحليل CUT & RUN ل TFs (على عكس النيوكليوسومات). في حين تم إنشاء البيانات المقدمة في هذه المخطوطة باستخدام تعديلات خاصة ب TF لمجموعة CUT & RUN تجارية ، فقد تم التحقق من صحة هذه البروتوكولات أيضا باستخدام مكونات من مصادر فردية (أي إنزيم pAG-MNase وخرز تنقية الحمض النووي المغناطيسي) والمخازن المؤقتة المعدة داخليا ، والتي يمكن أن تقلل بشكل كبير من التكلفة التجريبية. يتم وصف بروتوكولات التجارب الشاملة وتحليل البيانات بالتفصيل أدناه في شكل خطوة بخطوة. يتم سرد جميع الكواشف والمعدات الحيوية ، وكذلك وصفات التخزين المؤقت والوسائط ، في جدول المواد والملف التكميلي 1 ، على التوالي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGPM33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.65 mL low-adhesion tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490003-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-152-341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M PIPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ61224AK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well untreated cell culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Digitonin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CHR103MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x phusion HF buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as &#34;DNA polymerase buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP magnetic beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;capillary electrophoresis instrument&#34;; user-dependepent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89133-910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchling primer design tool</td>
			<td>Benchling</td>
			<td></td>
			<td>https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as &#34;the primer design tool&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ77507AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor white stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida Genome Database</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.candidagenome.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>&#160;86057-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conda software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curl tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ 
			chromosomes.fasta.gz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUTANA ChIC/CUT&#38;RUN kit</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>14-1048</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;the CUT&#38;RUN kit&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco D-mannitol</td>
			<td>&#160;BD Biosciences</td>
			<td>217020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Loading Dye (6x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq green DNA polymerase</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>EP0713</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;cPCR DNA polymerase&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq green DNA polymerase buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>EP0713</td>
			<td>Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as &#34;cPCR DNA polymerase buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli spike-in DNA</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>18-1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELMI Microplate incubator</td>
			<td>ELMI</td>
			<td>TRMS-04</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;microplate incubator&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End Prep Enzyme Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End Prep Reaction Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest MssI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FD1344</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;restriction enzyme&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest MssI Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FD1344</td>
			<td>Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as &#34;restriction enzyme buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP525-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler low range DNA ladder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FERSM1192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GitBash workflow</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://gitforwindows.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GitHub source code</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-KOH pH 7.5</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BBH-75-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PX1830-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52846-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Enhancer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate dihydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>215525683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody</td>
			<td>Takara</td>
			<td>632592</td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://pypi.org/project/MACS2/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>10-0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate and cuvette spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>EPOCH2TC</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;spectrophotometer&#34;; user-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MochiView</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCBI GEO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Adaptor for Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as &#34;Adapter&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Index X Primer for Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as &#34;Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;library prep kit&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Universal PCR Primer for Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as &#34;Universal Forward Library Amplification Primer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin sulfate (NAT)</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>N-500-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex TBE Gels, 10%, 15 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>EC62755BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient broth</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C6471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH110</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90982</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90982&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH119</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90985</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90985&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH137</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90986</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90986&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH139</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90987</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90987&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH140</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90988</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90988&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG-MNase</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>15-1016 or 15-1116</td>
			<td>50 rxn or 250 rxn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCE1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>174434</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 174434&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes with clear lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion high fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;DNA polymerase&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 3350</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10791-816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x dsDNA HS assay kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;fluorometer&#34;; user-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG negative control antibody</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>13-0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109169001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M12820004</td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile inoculating loops</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30002-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO 13 nucleic acid stain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S7575</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;nucleic acid gel stain&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252859-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra II Ligation Master Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as &#34;Ligation Master Mix&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra II Q5 Master Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as &#34;High Fidelity DNA Polymerase Master Mix &#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure salmon sperm DNA solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER Enzyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as &#34;Uracil Excision Enzyme&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wget tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ 
			chromosomes.fasta.gz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C7341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0439194</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide profiling of transcription factor-dna binding interactions in candida albicans: a comprehensive cut&amp;run method and data analysis workflow

تتحكم عوامل النسخ التنظيمية في العديد من العمليات البيولوجية المهمة ، بما في ذلك التمايز الخلوي ، والاستجابات للاضطرابات والضغوط البيئية ، والتفاعلات بين المضيف والممرض. يعد تحديد الارتباط على نطاق الجينوم لعوامل النسخ التنظيمية بالحمض النووي أمرا ضروريا لفهم وظيفة عوامل النسخ في هذه العمليات البيولوجية المعقدة في كثير من الأحيان. الانقسام تحت الأهداف والإطلاق باستخدام النوكليز (CUT & RUN) هو طريقة حديثة لرسم الخرائط على نطاق الجينوم للتفاعلات المرتبطة بالبروتين والحمض النووي في الجسم الحي والتي تعد بديلا جذابا لترسيب المناعة التقليدي والمستخدم على نطاق واسع للكروماتين متبوعا بطريقة التسلسل (ChIP-seq). CUT & RUN قابل للإعداد التجريبي عالي الإنتاجية ولديه نطاق ديناميكي أعلى بكثير مع تكاليف تسلسل أقل لكل عينة من ChIP-seq. هنا ، يتم وصف بروتوكول CUT & RUN الشامل وسير عمل تحليل البيانات المصاحب المصمم خصيصا للتحليل على مستوى الجينوم لتفاعلات ربط عامل النسخ والحمض النووي في مسببات الأمراض الفطرية البشرية المبيضات البيضاء . ويشمل هذا البروتوكول المفصل جميع الإجراءات التجريبية اللازمة، بدءا من وضع علامات على جينات ترميز عامل النسخ إلى إعداد المكتبة للتسلسل؛ بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يتضمن سير عمل حسابي مخصص لتحليل بيانات CUT & RUN.

تم تكييف بروتوكول CUT & RUN القوي هذا وتحسينه للتحقيق في توطين على مستوى الجينوم ل TFs محددة في الأغشية الحيوية C. albicans وثقافات العوالق (انظر الشكل 2 للحصول على نظرة عامة على النهج التجريبي). كما يتم تضمين خط أنابيب شامل لتحليل البيانات لتسهيل تحليل بيانات تسلسل CUT & RUN الناتجة...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow at JoVE.

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow

يصف هذا البروتوكول طريقة تجريبية وسير عمل تحليل البيانات للانقسام تحت الأهداف والإطلاق باستخدام nuclease (CUT & RUN) في مسببات الأمراض الفطرية البشرية المبيضات البيضاء.

التنميط على نطاق الجينوم لتفاعلات ربط عامل النسخ والحمض النووي في المبيضات البيضاء: طريقة CUT &amp; RUN شاملة وسير عمل تحليل البيانات

Regulatory transcription factors control many important biological processes, including cellular differentiation, responses to environmental perturbations ...

يفصل هذا البروتوكول جميع الإجراءات التجريبية ، من وضع علامات على جينات ترميز عامل النسخ من خلال تحليل البيانات الحسابية ، لإجراء التنميط على مستوى الجينوم لتفاعلات ربط عامل النسخ والحمض النووي في المبيضات البيضاء عبر CUT & RUN. هذه تقنية أكثر سهولة وأسرع وأكثر حساسية وأقل تكلفة ، وتوفر بيانات عالية الجودة من النهج التقليدية لرقاقة ChIP و ChIP-seq. على الرغم من أن بروتوكولنا تم تطويره لخلايا المبيضات البيضاء المعزولة من الأغشية الحيوية أو ثقافات العوالق ، إلا أنه يجب أن يكون من العملي تكييفه مع أي شكل جيد من خلايا المبيضات البيضاء.بعد احتضان تعليق الخلية ، انقل أليكوت خمسة ميكرولتر إلى أنبوب PCR جديد. إلى خمسة ميكرولترات من النوى المعزولة وخمسة ميكرولتر من الخلايا السليمة المخزنة سابقا عند أربع درجات مئوية ، أضف ميكرولتر واحد لكل من Calcofluor-white و SYTO 13. تحضن عند 30 درجة مئوية في الظلام لمدة 30 دقيقة.فحص بصري لسلامة ونقاء النوى المعزولة باستخدام المجهر الفلوري. ابحث عن النوى المعزولة التي تظهر تلطيخا بارزا ل SYTO 13 وتأكد من عدم تلطيخ جدار الخلية بواسطة صبغة الكالكوفلور البيضاء. كرر الفحص باستخدام خلايا سليمة كعنصر تحكم في تلطيخ جدار الخلية بصبغة كالكوفلور البيضاء.ضع الأنابيب على رف مغناطيسي وانتظر حتى يصبح الملاط واضحا تماما. تخلص من السوبرناتانت باستخدام ماصة. أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للأجسام المضادة واخلطها بلطف عن طريق السحب.أضف ثلاثة ميكرولترات من الجسم المضاد متعدد النسيلة المضاد ل GFP إلى الأنابيب واحتضن الأنابيب على خلاط مغذي عند 4 درجات مئوية لمدة ساعتين. قم بطرد الأنابيب لفترة وجيزة عند 100 مرة جم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس ثوان وضع الأنابيب على رف مغناطيسي. بمجرد أن يصبح الملاط صافيا ، تخلص من supernatant باستخدام ماصة.في حين أن الأنابيب مع الخرز لا تزال على الرف المغناطيسي ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنفاذية الخلايا الباردة مباشرة على الخرز. تخلص من السوبرناتانت باستخدام ماصة. كرر غسلتين باستخدام المخزن المؤقت لنفاذية الخلايا الباردة الثلجية.أضف 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت لنفاذية الخلايا الباردة إلى كل أنبوب واخلطها بلطف عن طريق السحب. أضف 2.5 ميكرولتر من بروتين AG-MNase إلى كل عينة واخلطها عن طريق السحب. ضع العينات على خلاط المغذيات عند 4 درجات مئوية واحتضن العينات لمدة ساعة واحدة.قم بطرد الأنابيب الشريطية لفترة وجيزة عند 100 مرة جم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس ثوان ، ثم ضع الأنابيب على رف مغناطيسي. بمجرد أن يصبح الملاط صافيا ، تخلص من supernatant باستخدام ماصة. في حين أن الأنابيب مع الخرز لا تزال على الرف المغناطيسي ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنفاذية الخلايا الباردة مباشرة على الخرز.تخلص من السوبرناتانت باستخدام ماصة. كرر غسلتين باستخدام المخزن المؤقت لنفاذية الخلايا الباردة الثلجية. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنفاذية الخلايا الباردة إلى العينات وقم بسحبها بلطف لأعلى ولأسفل خمس مرات.قم بإزالة الجل المصبوب من صندوق الجل وافتح قالب الجل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بإزالة الجل بلطف من قالب الجل وضعه داخل صينية تحمل الجل تحتوي على 100 ملليلتر من TBE أحادي القوة. أضف 10 ميكرولترات من بقعة هلام الحمض النووي إلى الدرج وقم بالتدوير بلطف.يغطى بورق القصدير للحماية من الضوء ويحضن بشكل ثابت في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم شطف الجل مرتين مع 100 ملليلتر من ماء الصنبور منزوع الأيونات. صور الجل تحت إضاءة الضوء الأزرق باستخدام غطاء مرشح كهرماني.لكل مكتبة، اقطع الجل أعلى قليلا من شريط المحول البارز المكون من 125 زوجا أساسيا تقريبا وأسفل علامة سلم الزوج الأساسي 400. ثقب الجزء السفلي من أنبوب 0.65 ملليلتر باستخدام إبرة قياس 22 ووضع الأنبوب المثقوب داخل أنبوب ميكروفوجي معقم سعة مليلترين. انقل شريحة الجل إلى الأنبوب المثقوب داخل أنبوب microfuge سعة مليلترين.قم بطرد مركزي لأنبوب الطرد الدقيق سعة مليلتر الذي يحتوي على الأنبوب المثقوب بسعة 0.65 ملليلتر والعينة عند 10000 مرة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين لجمع ملاط الجل داخل أنبوب الطرد الدقيق سعة مليلترين. أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للجل البارد المثلج إلى ملاط الجل. اخلطي المزيج على المغذيات في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن ثلاث ساعات أو طوال الليل.انقل جميع الملاط السائل والهلام إلى عمود مرشح 0.22 ميكرومتر وأجهزة طرد مركزي عند 10000 مرة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. قم بتنزيل الشفرة المصدرية لتحليل CUT & RUN من صفحة GitHub بالنقر فوق الزر "التعليمات البرمجية الخضراء" ، متبوعا بخيار تنزيل ZIP. قم بفك ضغط المجلد إلى موقع ذي صلة على الجهاز المحلي.قم بتثبيت بيئة Conda وتشغيلها مرة واحدة فقط. بمجرد تثبيت Conda ، قم بإنشاء بيئة افتراضية مزودة بالأمر ذي الصلة. قم بتنشيط البيئة الظاهرية في كل مرة يتم فيها تنفيذ سير العمل هذا.تم تقييم هضم جدار الخلية والسلامة النووية من خلال تصور كل من الخلايا السليمة الضابطة والنوى المعزولة الملطخة بجدار الخلية الفلورسنت وبقع الحمض النووي. على النقيض من النوى السليمة المعزولة حيث لا يلاحظ تلطيخ جدار الخلية ، يتم تصنيف كل من النوى وجدران الخلايا بشكل فلوري في خلايا التحكم السليمة. يوضح الشكل مكتبات CUT & RUN TF التي تم تحليلها باستخدام أداة الرحلان الكهربائي الشعري.يتم إثراء مكتبات CUT & RUN TF الناجحة لشظايا قصيرة أصغر من 200 زوج أساسي. تظهر مكتبات CUT & RUN TF دون المستوى الأمثل إثراء لشظايا الحمض النووي الكبيرة. يوضح الشكل الوارد هنا أن زخارف ربط الحمض النووي Ndt80 يتم إثراؤها عبر جميع المواقع المرتبطة ب Ndt80 التي حددتها CUT & RUN ، مما يشير إلى أن القمم الإضافية التي حددتها هذه المنهجية من المحتمل أن تكون مواقع مرتبطة ب Ndt80.أشار التحليل المقارن إلى أن بروتوكول CUT & RUN حدد معظم أحداث الربط المعروفة سابقا ل Ndt80 و Efg1 أثناء تكوين الأغشية الحيوية. بشكل عام ، يتداخل كل من Ndt80 و Efg1 المرتبطين بالموقع مع بيانات ChIP لهطول الأمطار المناعية للكروماتين المنشورة سابقا ويتم تحديدها فقط باستخدام CUT & RUN. إنها تمكننا من زيادة نطاق ووتيرة أبحاثنا التي تركز على الشبكات التنظيمية النسخية والمبيضات البيضاء بشكل كبير.

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&amp;RUN Method and Data Analysis Workflow

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

الجينوم على نطاق تحليل المستويات (شحن) من الحمض الريبي النووي النقال باستخدام Aminoacylation ميكروأرس]

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

الجينوم على نطاق التحليل باستخدام رقاقة لتحديد أهداف محددة الجينات شكل الإسوي

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

تحليل كمي لياقة سير العمل

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

رواية النظرية الافتراضية تغيير نقطة حسابي لتحليل الجينوم-اسعة من أنواع البيانات المتنوعة ChIPseq

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

Polysome تجزئة وتحليل الثدييات Translatomes على مقياس الجينوم على نطاق

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

على صعيد رسم الخرائط الجينوم من المخدرات-DNA التفاعلات في الخلايا مع COSMIC (يشابك من الجزيئات الصغيرة لعزل لونين)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID وما يليها: رسم خرائط الجينوم على نطاق التفاعلات البروتين DNA بواسطة إنتاجية عالية تسلسل شظايا الحمض النووي ميثليته الأدينين

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

سير العمل كاملا لتحليل هيستون التعديلات بعد متعدية عن طريق أسفل إلى أعلى الطيف الكتلي: من هيستون استخراج لتحليل البيانات

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

سير عمل شامل للتعرف على نطاق الجينوم والتحليل التلوي التعبير الأسرة الجينات ATL E3 Ubiquitin ليجاسى في الكرمة

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...