Name: genome-wide profiling of transcription factor-dna binding interactions in candida albicans: a comprehensive cut&amp;run method and data analysis workflow
Uploaded: 2022-04-01T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow at JoVE.

Nous remercions tous les membres passés et présents des laboratoires Nobile et Hernday pour leurs commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par le national institutes of health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) numéro de prix R35GM124594 et par la famille Kamangar sous la forme d’une chaire dotée à C.J.N. Ce travail a également été soutenu par le NIH National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) numéro de bourse R15AI137975 à A.D.H.C.L.E. a été soutenu par le NIH National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) numéro de bourse F31DE028488. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas les points de vue des bailleurs de fonds. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude; dans la collecte, l’analyse ou l’interprétation des données; dans la rédaction du manuscrit; ou dans la décision de publier les résultats.

1. Marquage épitopique des souches de C. albicans 
<ol><li>Téléchargez le gène d’intérêt, ainsi que ses séquences d’accompagnement de 1 kb en amont et en aval, de la base de données du génome de Candida à l’outil de conception de l’amorce (voir le tableau des matériaux). Concevez un ARN guide (ARNg) en mettant en évidence 50 pb en amont et en aval du codon d’arrêt, puis cliquez sur l’outil de sélection de l’ARNg à droite. ...

<ol>
	<li>Gulati, M., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms:+development,+regulation,+and+molecular+mechanisms.">Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms.</a> Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).</li><li>Lohse, M. B., Gulati, M., Johnson, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regulation+of+single-and+multi-species+Candida+albicans+biofilms.">Development and regulation of single-and multi-species Candida albicans biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 19-31 (2018).</li><li>Nobile, C. J., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms+and+human+disease.">Candida albicans biofilms and human disease.</a> Annual Review of Microbiology. 69 (1), 71-92 (2015).</li><li>Nobile, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recently+evolved+transcriptional+network+controls+biofilm+development+in+Candida+albicans.">A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans.</a> Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).</li><li>Iracane, E., Vega-Est&#233;vez, S., Buscaino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+and+off:+epigenetic+regulation+of+C.+albicans+morphological+switches.">On and off: epigenetic regulation of C. albicans morphological switches.</a> Pathogens. 10 (11), 1463 (2021).</li><li>Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Hernday, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+chromatin+accessibility+in+regulating+the+Candida+albicans+white-opaque+phenotypic+switch.">The roles of chromatin accessibility in regulating the Candida albicans white-opaque phenotypic switch.</a> Journal of Fungi. 7 (1), 37 (2021).</li><li>Mancera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+complex+transcription+network+controlling+biofilm+formation+in+candida+species.">Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in candida species.</a> eLife. 10, 64682 (2021).</li><li>Lohse, M. B., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+Wor4,+a+new+transcriptional+regulator+of+white-opaque+switching.">Identification and characterization of Wor4, a new transcriptional regulator of white-opaque switching.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (3), 721-729 (2016).</li><li>Hernday, A. D., Noble, S. M., Mitrovich, Q. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+molecular+biology+in+Candida+albicans.">Genetics and molecular biology in Candida albicans.</a> Methods in Enzymology. 470, 737-758 (2010).</li><li>Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+and+microarray-based+analysis+of+protein+location.">Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location.</a> Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).</li><li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733 (2015).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIC+and+ChEC:+Genomic+mapping+of+chromatin+proteins.">ChIC and ChEC: Genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856 (2017).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+in+situ+genome-wide+profiling+with+high+efficiency+for+low+cell+numbers.">Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers.</a> Nature Protocols. 13 (5), 1006-1019 (2018).</li><li>Nguyen, N., Quail, M. M. F., Hernday, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient,+rapid,+and+recyclable+system+for+CRISPR-mediated+genome+editing+in+Candida+albicans.">An efficient, rapid, and recyclable system for CRISPR-mediated genome editing in Candida albicans.</a> American Society For Microbiology. 2 (2), 00149 (2017).</li><li>Ennis, C. L., Hernday, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+markerless+CRISPR-mediated+system+for+genome+editing+in+Candida+auris+reveals+a+conserved+role+for+Cas5+in+the+caspofungin+response.">A markerless CRISPR-mediated system for genome editing in Candida auris reveals a conserved role for Cas5 in the caspofungin response.</a> Microbiology Spectrum. 9 (3), 0182021 (2021).</li><li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+CUT&amp;RUN+chromatin+profiling+tools.">Improved CUT&amp;RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314 (2019).</li><li>Skrzypek, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Candida+Genome+Database+(CGD):+Incorporation+of+Assembly+22,+systematic+identifiers+and+visualization+of+high+throughput+sequencing+data.">The Candida Genome Database (CGD): Incorporation of Assembly 22, systematic identifiers and visualization of high throughput sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 45, 592-596 (2017).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li><li>Boyd, J., Rodriguez, P., Schjerven, H., Frietze, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ssvQC:+an+integrated+CUT&amp;RUN+quality+control+workflow+for+histone+modifications+and+transcription+factors.">ssvQC: an integrated CUT&amp;RUN quality control workflow for histone modifications and transcription factors.</a> BMC Research Notes. 14 (1), 366 (2021).</li><li>Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BigWig+and+BigBed:+enabling+browsing+of+large+distributed+datasets.">BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets.</a> Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).</li><li>Homann, O. R., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MochiView:+Versatile+software+for+genome+browsing+and+DNA+motif+analysis.">MochiView: Versatile software for genome browsing and DNA motif analysis.</a> BMC Biology. 8, 49 (2010).</li><li>Hainer, S. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+chromatin+profiling+using+CUT&amp;RUN.">High-resolution chromatin profiling using CUT&amp;RUN.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Rodriguez, D. L., Quail, M. M., Hernday, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+circuits+regulating+developmental+processes+in+Candida+albicans.">Transcriptional circuits regulating developmental processes in Candida albicans.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 605711 (2020).</li><li>Zhu, Q., Liu, N., Orkin, S. H., Yuan, G. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;amp;RUNTools:+a+flexible+pipeline+for+CUT&amp;amp;RUN+processing+and+footprint+analysis.">CUT&amp;amp;RUNTools: a flexible pipeline for CUT&amp;amp;RUN processing and footprint analysis.</a> Genome Biology. 20 (1), 192 (2019).</li><li>Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+expressed+loci+are+vulnerable+to+misleading+ChIP+localization+of+multiple+unrelated+proteins.">Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18602-18607 (2013).</li></ol>

Ce protocole présente un pipeline expérimental et informatique complet pour la localisation à l’échelle du génome des TF régulateurs chez C. albicans. Il est conçu pour être hautement accessible à toute personne ayant une formation standard en microbiologie et en biologie moléculaire. En tirant parti de la plage dynamique élevée et des faibles exigences d’entrée d’échantillon du test CUT&RUN et en incluant des optimisations pour la localisation des interactions de liaison TF-ADN dans le biofi...

Candida albicans est un agent pathogène fongique humain polymorphe cliniquement pertinent qui existe dans une variété de modes de croissance différents, tels que le mode de croissance planctonique (flottant librement) et sous forme de communautés de cellules étroitement adhérentes protégées par une matrice extracellulaire, connue sous le nom de mode de croissance du biofilm 1,2,3. Semblable à d’autres processus développementaux et cellulaires, le développement du biofilm est un trait de virulence important de C. albicans qui est connu pour être contrôlé au niveau transcriptionnel par des facteurs de transcription régulateurs (TF) qui se lient à l’ADN d’une manière spécifique à la séquence4. Récemment, les régulateurs de chromatine et les modificateurs d’histones sont également apparus comme des régulateurs importants de la formation de biofilm5 de C. albicans et de la morphogenèse6 en médiant l’accessibilité de l’ADN. Pour comprendre la biologie complexe de cet important agent pathogène fongique, des méthodes efficaces pour déterminer la localisation à l’échelle du génome de TF spécifiques au cours de processus développementaux et cellulaires distincts sont précieuses.
L’immunoprécipitation de la chromatine suivie d’un séquençage (ChIP-seq) est une méthode largement utilisée pour étudier les interactions protéine-ADN chez C. albicans 5,6 et a largement remplacé l’immunoprécipitation plus classique de la chromatine suivie de la méthode du microréseau (puce ChIP)9. Cependant, les méthodes ChIP-seq et ChIP-chip nécessitent un grand nombre de cellules d’entrée10, ce qui peut être un facteur de complication lors de l’étude des TF dans le contexte d’échantillons et de modes de croissance spécifiques, tels que des biofilms prélevés sur des patients ou des modèles animaux d’infection. En outre, le test d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) produit souvent une quantité importante de signal de fond dans tout le génome, nécessitant un niveau élevé d’enrichissement pour que la cible d’intérêt sépare suffisamment le signal du bruit. Bien que le test de la puce ChIP soit largement obsolète aujourd’hui, les profondeurs de séquençage nécessaires pour ChIP-seq rendent ce test prohibitif pour de nombreux chercheurs, en particulier ceux qui étudient plusieurs TF et / ou protéines associées à la chromatine.

Le clivage sous les cibles et la libération à l’aide de nucléases (CUT&RUN) est une alternative attrayante au ChIP-seq. Il a été développé par le laboratoire Henikoff en 2017 pour contourner les limites du clivage endogène ChIP-seq et chromatine suivi du séquençage ChEC-seq11,12, une autre méthode permettant d’identifier les interactions protéine-ADN à l’échelle du génome, tout en fournissant une cartographie à haute résolution et à l’échelle du génome des TF et des protéines associées à la chromatine13 . CUT&RUN s’appuie sur la digestion ciblée de la chromatine dans les noyaux perméabilisés à l’aide de nucléases micrococciques attachées, suivie du séquençage des fragments d’ADN digérés 9,10. Comme les fragments d’ADN sont spécifiquement générés aux loci qui sont liés par une protéine d’intérêt, plutôt que d’être générés dans tout le génome par fragmentation aléatoire comme dans les tests ChIP, l’approche CUT&RUN entraîne une réduction considérable des signaux de fond et, par conséquent, nécessite 1/10ème de la profondeur de séquençage par rapport à ChIP-seq11,13, 14. Ces améliorations conduisent finalement à des réductions significatives des coûts de séquençage et à des réductions du nombre total de cellules d’entrée nécessaires comme matériau de départ pour chaque échantillon.
Ici, un protocole CUT&RUN robuste est décrit qui a été adapté et optimisé pour déterminer la localisation à l’échelle du génome des TF dans les cellules de C. albicans isolées à partir de biofilms et de cultures planctoniques. Un pipeline d’analyse de données approfondi est également présenté, ce qui permet le traitement et l’analyse des données de séquence résultantes et nécessite que les utilisateurs aient une expertise minimale en codage ou en bioinformatique. En bref, ce protocole décrit le marquage épitope des gènes codant pour TF, la récolte de biofilms et de cellules planctoniques, l’isolement de noyaux perméabilisés intacts, l’incubation avec des anticorps primaires contre la protéine spécifique ou la protéine marquée par épitope d’intérêt, l’attache des protéines de fusion chimériques A/G-micrococciques (pAG-MNase) aux anticorps primaires, la récupération de l’ADN génomique après la digestion de la chromatine et la préparation de bibliothèques d’ADN génomique pour le séquençage.
Le protocole expérimental CUT&RUN est suivi d’un pipeline d’analyse de données spécialement conçu, qui prend des lectures de séquençage de l’ADN brut au format FASTQ et met en œuvre toutes les étapes de traitement requises pour fournir une liste complète des loci significativement enrichis liés par le TF d’intérêt (ciblé par l’anticorps primaire). Notez que plusieurs étapes du protocole de préparation de bibliothèque décrit ont été spécifiquement adaptées et optimisées pour l’analyse CUT&RUN des TF (par opposition aux nucléosomes). Bien que les données présentées dans ce manuscrit aient été générées à l’aide d’adaptations spécifiques à TF d’un kit CUT&RUN commercial, ces protocoles ont également été validés à l’aide de composants provenant de sources individuelles (c.-à-d. l’enzyme pAG-MNase et les billes de purification magnétique de l’ADN) et de tampons préparés en interne, ce qui peut réduire considérablement les coûts expérimentaux. Les protocoles expérimentaux et d’analyse de données complets sont décrits en détail ci-dessous dans un format étape par étape. Tous les réactifs et l’équipement essentiel, ainsi que les recettes de tampons et de supports, sont énumérés dans le tableau des matériaux et le dossier supplémentaire 1, respectivement.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGPM33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.65 mL low-adhesion tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490003-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-152-341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M PIPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ61224AK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well untreated cell culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Digitonin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CHR103MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x phusion HF buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as &#34;DNA polymerase buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP magnetic beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;capillary electrophoresis instrument&#34;; user-dependepent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89133-910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchling primer design tool</td>
			<td>Benchling</td>
			<td></td>
			<td>https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as &#34;the primer design tool&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ77507AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor white stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida Genome Database</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.candidagenome.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>&#160;86057-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conda software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curl tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ 
			chromosomes.fasta.gz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUTANA ChIC/CUT&#38;RUN kit</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>14-1048</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;the CUT&#38;RUN kit&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco D-mannitol</td>
			<td>&#160;BD Biosciences</td>
			<td>217020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Loading Dye (6x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq green DNA polymerase</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>EP0713</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;cPCR DNA polymerase&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq green DNA polymerase buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>EP0713</td>
			<td>Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as &#34;cPCR DNA polymerase buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli spike-in DNA</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>18-1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELMI Microplate incubator</td>
			<td>ELMI</td>
			<td>TRMS-04</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;microplate incubator&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End Prep Enzyme Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End Prep Reaction Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest MssI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FD1344</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;restriction enzyme&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest MssI Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FD1344</td>
			<td>Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as &#34;restriction enzyme buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP525-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler low range DNA ladder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FERSM1192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GitBash workflow</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://gitforwindows.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GitHub source code</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-KOH pH 7.5</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BBH-75-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PX1830-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52846-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Enhancer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate dihydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>215525683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody</td>
			<td>Takara</td>
			<td>632592</td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://pypi.org/project/MACS2/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>10-0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate and cuvette spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>EPOCH2TC</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;spectrophotometer&#34;; user-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MochiView</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCBI GEO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Adaptor for Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as &#34;Adapter&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Index X Primer for Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as &#34;Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;library prep kit&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Universal PCR Primer for Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as &#34;Universal Forward Library Amplification Primer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin sulfate (NAT)</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>N-500-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex TBE Gels, 10%, 15 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>EC62755BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient broth</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C6471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH110</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90982</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90982&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH119</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90985</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90985&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH137</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90986</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90986&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH139</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90987</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90987&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH140</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90988</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90988&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG-MNase</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>15-1016 or 15-1116</td>
			<td>50 rxn or 250 rxn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCE1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>174434</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 174434&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes with clear lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion high fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;DNA polymerase&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 3350</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10791-816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x dsDNA HS assay kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;fluorometer&#34;; user-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG negative control antibody</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>13-0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109169001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M12820004</td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile inoculating loops</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30002-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO 13 nucleic acid stain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S7575</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;nucleic acid gel stain&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252859-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra II Ligation Master Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as &#34;Ligation Master Mix&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra II Q5 Master Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as &#34;High Fidelity DNA Polymerase Master Mix &#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure salmon sperm DNA solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER Enzyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as &#34;Uracil Excision Enzyme&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wget tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ 
			chromosomes.fasta.gz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C7341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0439194</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide profiling of transcription factor-dna binding interactions in candida albicans: a comprehensive cut&amp;run method and data analysis workflow

Les facteurs de transcription régulateurs contrôlent de nombreux processus biologiques importants, y compris la différenciation cellulaire, les réponses aux perturbations et aux stress environnementaux et les interactions hôte-pathogène. Déterminer la liaison à l’échelle du génome des facteurs de transcription régulateurs à l’ADN est essentiel pour comprendre la fonction des facteurs de transcription dans ces processus biologiques souvent complexes. Le clivage sous les cibles et la libération à l’aide de la nucléase (CUT&RUN) est une méthode moderne de cartographie à l’échelle du génome des interactions in vivo de liaison protéine-ADN qui constitue une alternative attrayante à la méthode traditionnelle et largement utilisée d’immunoprécipitation de la chromatine suivie du séquençage (ChIP-seq). CUT&RUN se prête à une configuration expérimentale à haut débit et a une plage dynamique nettement plus élevée avec des coûts de séquençage par échantillon inférieurs à ceux de ChIP-seq. Ici, un protocole CUT&RUN complet et un flux de travail d’analyse de données d’accompagnement adapté à l’analyse à l’échelle du génome des interactions de liaison facteur de transcription-ADN chez l’agent pathogène fongique humain Candida albicans sont décrits . Ce protocole détaillé comprend toutes les procédures expérimentales nécessaires, du marquage épitope des gènes codant pour le facteur de transcription à la préparation de la bibliothèque pour le séquençage; en outre, il comprend un flux de travail de calcul personnalisé pour l’analyse des données CUT&RUN.

Ce protocole CUT&RUN robuste a été adapté et optimisé pour étudier la localisation à l’échelle du génome de TF spécifiques dans les biofilms et les cultures planctoniques de C. albicans (voir la figure 2 pour un aperçu de l’approche expérimentale). Un pipeline d’analyse de données approfondi est également inclus pour faciliter l’analyse des données de séquençage CUT&RUN résultantes et exige que les utilisateurs aient une expertise minimale en codage ou en bi...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow at JoVE.

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow

Ce protocole décrit une méthode expérimentale et un flux de travail d’analyse des données pour le clivage sous les cibles et la libération à l’aide de nucléase (CUT&RUN) dans l’agent pathogène fongique humain Candida albicans.

Profilage à l’échelle du génome des interactions de liaison facteur de transcription-ADN chez Candida albicans: une méthode CUT&amp;RUN complète et un flux de travail d’analyse des données

Regulatory transcription factors control many important biological processes, including cellular differentiation, responses to environmental perturbations ...

Ce protocole détaille toutes les procédures expérimentales, du marquage épitope des gènes codant pour le facteur de transcription à l’analyse des données informatiques, pour effectuer un profilage à l’échelle du génome des interactions de liaison facteur de transcription-ADN chez Candida albicans via CUT&RUN. Il s’agit d’une technique plus accessible, plus rapide, plus sensible et moins coûteuse, qui fournit des données de meilleure qualité que les approches traditionnelles chIP-chip et ChIP-seq. Bien que notre protocole soit développé pour les cellules de Candida albicans isolées à partir de biofilms ou de cultures planctoniques, il devrait être pratique de l’adapter à pratiquement toute bonne forme de cellules de Candida albicans.Après avoir incubé la suspension cellulaire, transférer une aliquote de cinq microlitres dans un nouveau tube PCR. À cinq microlitres de noyaux isolés et à une aliquote de cinq microlitres de cellules intactes précédemment stockées à quatre degrés Celsius, ajoutez un microlitre de blanc calcofluor et de SYTO 13. Incuber à 30 degrés Celsius dans l’obscurité pendant 30 minutes.Inspectez visuellement l’intégrité et la pureté des noyaux isolés à l’aide d’un microscope à fluorescence. Recherchez des noyaux isolés présentant une coloration SYTO 13 proéminente et assurez-vous qu’il n’y a pas de coloration de la paroi cellulaire par le colorant blanc calcofluor. Répétez l’inspection avec des cellules intactes comme contrôle de la coloration de la paroi cellulaire avec un colorant blanc calcofluor.Placez les tubes sur une grille magnétique et attendez que la boue soit complètement dégagée. Jetez le surnageant à l’aide d’une pipette. Ajouter 50 microlitres du tampon d’anticorps et mélanger doucement par pipetage.Ajouter trois microlitres de l’anticorps polyclonal anti-GFP aux tubes et incuber les tubes sur un mélangeur à noisette à 4 degrés Celsius pendant deux heures. Centrifugez brièvement les tubes à 100 fois g à température ambiante pendant cinq secondes et placez les tubes sur un rack magnétique. Une fois que la boue est claire, jetez le surnageant à l’aide d’une pipette.Pendant que les tubes avec les perles sont toujours sur le rack magnétique, ajoutez 200 microlitres de tampon de perméabilisation des cellules glacées directement sur les perles. Jetez le surnageant à l’aide d’une pipette. Répétez deux lavages avec le tampon de perméabilisation cellulaire glacé.Ajouter 50 microlitres de tampon de perméabilisation cellulaire glacée à chaque tube et mélanger doucement par pipetage. Ajouter 2,5 microlitres de la protéine AG-MNase à chaque échantillon et mélanger par pipetage. Placez les échantillons sur un mélangeur à noisette à 4 degrés Celsius et incubez les échantillons pendant une heure.Centrifugez brièvement les tubes à bande à 100 fois g à température ambiante pendant cinq secondes, puis placez les tubes sur un rack magnétique. Une fois que la boue est claire, jetez le surnageant à l’aide d’une pipette. Pendant que les tubes avec les perles sont toujours sur le rack magnétique, ajoutez 200 microlitres de tampon de perméabilisation des cellules glacées directement sur les perles.Jetez le surnageant à l’aide d’une pipette. Répétez deux lavages avec le tampon de perméabilisation cellulaire glacé. Ajouter 100 microlitres du tampon de perméabilisation des cellules glacées aux échantillons et pipeter doucement de haut en bas cinq fois.Retirez le gel coulé de la boîte de gel et ouvrez le gel moulé selon les instructions du fabricant. Retirez doucement le gel du gel coulé et placez-le dans un plateau contenant 100 millilitres de TBE à force unique. Ajouter 10 microlitres de la tache de gel d’acide nucléique sur le plateau et faire tourbillonner doucement.Couvrir avec du papier d’aluminium pour protéger de la lumière et incuber statiquement à température ambiante pendant 10 minutes. Rincez ensuite le gel deux fois avec 100 millilitres d’eau du robinet désionisée. Imagez le gel sous éclairage à la lumière bleue à l’aide d’un couvercle filtrant orange.Pour chaque bibliothèque, coupez le gel légèrement au-dessus de la bande dimère d’adaptateur proéminente d’environ 125 paires de bases et en dessous de la marque d’échelle de 400 paires de bases. Perforez le fond d’un tube de 0,65 millilitre à l’aide d’une aiguille de calibre 22 et placez le tube perforé à l’intérieur d’un tube de microfuge stérile de deux millilitres. Transférer la tranche de gel dans le tube perforé à l’intérieur du tube de microfuge de deux millilitres.Centrifuger le tube de microfuge de deux millilitres contenant le tube perforé de 0,65 millilitre et échantillonner à 10 000 fois g à température ambiante pendant deux minutes pour recueillir la boue de gel à l’intérieur du tube de microfuge de deux millilitres. Ajouter 300 microlitres de tampon d’élution de gel glacé à la boue de gel. Mélanger sur un nutateur à température ambiante pendant au moins trois heures ou toute la nuit.Transférer toute la boue liquide et gel dans une colonne filtrante de 0,22 micromètre et centrifuger à 10 000 g à température ambiante pendant une minute. Téléchargez le code source de l’analyse CUT&RUN à partir de la page GitHub en cliquant sur le bouton vert Code, suivi de l’option Télécharger ZIP. Décompressez le dossier à un emplacement approprié sur l’ordinateur local.Installez Conda Environment et exécutez-le une seule fois. Une fois Conda installé, créez un environnement virtuel doté de la commande appropriée. Activez l’environnement virtuel chaque fois que ce flux de travail est exécuté.La digestion de la paroi cellulaire et l’intégrité nucléaire ont été évaluées en visualisant à la fois des cellules intactes témoins et des noyaux isolés colorés avec des taches de paroi cellulaire fluorescente et d’acide nucléique. Contrairement aux noyaux intacts isolés où la coloration de la paroi cellulaire n’est pas observée, les noyaux et les parois cellulaires sont marqués par fluorescence dans les cellules témoins intactes. La figure montre les bibliothèques CUT&RUN TF analysées à l’aide d’un instrument d’électrophorèse capillaire.Les bibliothèques CUT&RUN TF réussies sont enrichies pour les fragments courts de moins de 200 paires de bases. Les bibliothèques CUT&RUN TF sous-optimales montrent l’enrichissement des gros fragments d’ADN. La figure ci-dessous montre que les motifs de liaison à l’ADN Ndt80 sont enrichis dans tous les loci liés à Ndt80 identifiés par CUT&RUN, ce qui indique que les pics supplémentaires identifiés par cette méthodologie sont probablement des sites liés à Ndt80 de bonne foi.L’analyse comparative a indiqué que le protocole CUT&RUN a identifié la plupart des événements de liaison précédemment connus pour Ndt80 et Efg1 lors de la formation du biofilm. Dans l’ensemble, Ndt80 et Efg1 liés aux loci chevauchent les données ChIP de précipitation immunitaire de la chromatine publiées précédemment et ne sont identifiés qu’à l’aide du CUT&RUN. Cela nous permet d’augmenter considérablement la portée et le rythme de nos recherches axées sur les réseaux de régulation transcriptionnelle et Candida albicans.

Research

JoVE Journal

Biology

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