Name: genome-wide profiling of transcription factor-dna binding interactions in candida albicans: a comprehensive cut&amp;run method and data analysis workflow
Uploaded: 2022-04-01T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow at JoVE.

Wir danken allen ehemaligen und gegenwärtigen Mitgliedern der Laboratorien Nobile und Hernday für ihr Feedback zum Manuskript. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Award Nummer R35GM124594 und von der Familie Kamangar in Form eines Stiftungslehrstuhls für C.J.N. Diese Arbeit wurde auch durch den NIH National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) Award Nummer R15AI137975 an A.D.H unterstützt.C.L.E. wurde vom NIH National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) Fellowship Nummer F31DE028488 unterstützt. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht die Ansichten der Geldgeber dar. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Gestaltung der Studie; bei der Erhebung, Analyse oder Interpretation von Daten; beim Schreiben des Manuskripts; oder bei der Entscheidung, die Ergebnisse zu veröffentlichen.

1. Epitop-Markierung von C. albicans-Stämmen 
<ol><li>Laden Sie das interessierende Gen zusammen mit seinen 1 kb vor- und nachgeschalteten flankierenden Sequenzen aus der Candida-Genomdatenbank in das Primer-Design-Tool hoch (siehe Materialtabelle). Entwerfen Sie eine Leit-RNA (gRNA), indem Sie 50 bp vor und nach dem Stopp-Codon markieren und rechts auf das gRNA-Auswahlwerkzeug klicken. Wählen Sie Hilfslinien entwerfen und analysieren</stron...

<ol>
	<li>Gulati, M., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms:+development,+regulation,+and+molecular+mechanisms.">Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms.</a> Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).</li><li>Lohse, M. B., Gulati, M., Johnson, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regulation+of+single-and+multi-species+Candida+albicans+biofilms.">Development and regulation of single-and multi-species Candida albicans biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 19-31 (2018).</li><li>Nobile, C. J., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms+and+human+disease.">Candida albicans biofilms and human disease.</a> Annual Review of Microbiology. 69 (1), 71-92 (2015).</li><li>Nobile, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recently+evolved+transcriptional+network+controls+biofilm+development+in+Candida+albicans.">A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans.</a> Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).</li><li>Iracane, E., Vega-Est&#233;vez, S., Buscaino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+and+off:+epigenetic+regulation+of+C.+albicans+morphological+switches.">On and off: epigenetic regulation of C. albicans morphological switches.</a> Pathogens. 10 (11), 1463 (2021).</li><li>Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Hernday, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+chromatin+accessibility+in+regulating+the+Candida+albicans+white-opaque+phenotypic+switch.">The roles of chromatin accessibility in regulating the Candida albicans white-opaque phenotypic switch.</a> Journal of Fungi. 7 (1), 37 (2021).</li><li>Mancera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+complex+transcription+network+controlling+biofilm+formation+in+candida+species.">Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in candida species.</a> eLife. 10, 64682 (2021).</li><li>Lohse, M. B., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+Wor4,+a+new+transcriptional+regulator+of+white-opaque+switching.">Identification and characterization of Wor4, a new transcriptional regulator of white-opaque switching.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (3), 721-729 (2016).</li><li>Hernday, A. D., Noble, S. M., Mitrovich, Q. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+molecular+biology+in+Candida+albicans.">Genetics and molecular biology in Candida albicans.</a> Methods in Enzymology. 470, 737-758 (2010).</li><li>Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+and+microarray-based+analysis+of+protein+location.">Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location.</a> Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).</li><li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733 (2015).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIC+and+ChEC:+Genomic+mapping+of+chromatin+proteins.">ChIC and ChEC: Genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856 (2017).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+in+situ+genome-wide+profiling+with+high+efficiency+for+low+cell+numbers.">Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers.</a> Nature Protocols. 13 (5), 1006-1019 (2018).</li><li>Nguyen, N., Quail, M. M. F., Hernday, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient,+rapid,+and+recyclable+system+for+CRISPR-mediated+genome+editing+in+Candida+albicans.">An efficient, rapid, and recyclable system for CRISPR-mediated genome editing in Candida albicans.</a> American Society For Microbiology. 2 (2), 00149 (2017).</li><li>Ennis, C. L., Hernday, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+markerless+CRISPR-mediated+system+for+genome+editing+in+Candida+auris+reveals+a+conserved+role+for+Cas5+in+the+caspofungin+response.">A markerless CRISPR-mediated system for genome editing in Candida auris reveals a conserved role for Cas5 in the caspofungin response.</a> Microbiology Spectrum. 9 (3), 0182021 (2021).</li><li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+CUT&amp;RUN+chromatin+profiling+tools.">Improved CUT&amp;RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314 (2019).</li><li>Skrzypek, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Candida+Genome+Database+(CGD):+Incorporation+of+Assembly+22,+systematic+identifiers+and+visualization+of+high+throughput+sequencing+data.">The Candida Genome Database (CGD): Incorporation of Assembly 22, systematic identifiers and visualization of high throughput sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 45, 592-596 (2017).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li><li>Boyd, J., Rodriguez, P., Schjerven, H., Frietze, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ssvQC:+an+integrated+CUT&amp;RUN+quality+control+workflow+for+histone+modifications+and+transcription+factors.">ssvQC: an integrated CUT&amp;RUN quality control workflow for histone modifications and transcription factors.</a> BMC Research Notes. 14 (1), 366 (2021).</li><li>Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BigWig+and+BigBed:+enabling+browsing+of+large+distributed+datasets.">BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets.</a> Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).</li><li>Homann, O. R., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MochiView:+Versatile+software+for+genome+browsing+and+DNA+motif+analysis.">MochiView: Versatile software for genome browsing and DNA motif analysis.</a> BMC Biology. 8, 49 (2010).</li><li>Hainer, S. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+chromatin+profiling+using+CUT&amp;RUN.">High-resolution chromatin profiling using CUT&amp;RUN.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Rodriguez, D. L., Quail, M. M., Hernday, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+circuits+regulating+developmental+processes+in+Candida+albicans.">Transcriptional circuits regulating developmental processes in Candida albicans.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 605711 (2020).</li><li>Zhu, Q., Liu, N., Orkin, S. H., Yuan, G. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;amp;RUNTools:+a+flexible+pipeline+for+CUT&amp;amp;RUN+processing+and+footprint+analysis.">CUT&amp;amp;RUNTools: a flexible pipeline for CUT&amp;amp;RUN processing and footprint analysis.</a> Genome Biology. 20 (1), 192 (2019).</li><li>Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+expressed+loci+are+vulnerable+to+misleading+ChIP+localization+of+multiple+unrelated+proteins.">Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18602-18607 (2013).</li></ol>

Dieses Protokoll stellt eine umfassende experimentelle und rechnerische Pipeline für die genomweite Lokalisierung regulatorischer TFs in C. albicans dar. Es wurde entwickelt, um für jeden mit Standard-Mikrobiologie- und Molekularbiologie-Ausbildung sehr zugänglich zu sein. Durch die Nutzung des hohen Dynamikbereichs und der geringen Anforderungen an den Probeneingang des CUT&RUN-Assays und die Einbeziehung von Optimierungen für die Lokalisierung von TF-DNA-Bindungsinteraktionen in C. albicans-Biofilm</em...

Candida albicans ist ein klinisch relevanter, polymorpher humaner Pilzpathogen, der in einer Vielzahl von verschiedenen Wachstumsmodi vorkommt, wie der planktonischen (frei schwebenden) Wachstumsweise und als Gemeinschaften eng haftender Zellen, die durch eine extrazelluläre Matrix geschützt sind, die als Biofilm-Wachstumsmodus 1,2,3 bekannt ist. Ähnlich wie bei anderen Entwicklungs- und zellulären Prozessen ist die Biofilmentwicklung ein wichtiges Virulenzmerkmal von C. albicans, von dem bekannt ist, dass es auf transkriptioneller Ebene durch regulatorische Transkriptionsfaktoren (TFs) gesteuert wird, die sequenzspezifisch an DNA binden4. In jüngster Zeit haben sich auch Chromatinregulatoren und Histonmodifikatoren als wichtige Regulatoren der Biofilmbildung5 von C. albicans und der Morphogenese6 herausgestellt, indem sie die DNA-Zugänglichkeit vermitteln. Um die komplexe Biologie dieses wichtigen Pilzpathogens zu verstehen, sind effektive Methoden zur Bestimmung der genomweiten Lokalisation spezifischer TFs während verschiedener Entwicklungs- und zellulärer Prozesse wertvoll.
Die Chromatin-Immunpräzipitation mit anschließender Sequenzierung (ChIP-seq) ist eine weit verbreitete Methode zur Untersuchung von Protein-DNA-Interaktionen in C. albicans5,6 und hat die klassischere Chromatin-Immunpräzipitation, gefolgt von der Microarray-Methode (ChIP-Chip)9, weitgehend ersetzt. Sowohl die ChIP-seq- als auch die ChIP-Chip-Methode erfordern jedoch eine große Anzahl von Inputzellen10, was bei der Untersuchung von TFs im Zusammenhang mit bestimmten Proben und Wachstumsweisen, wie Biofilmen von Patienten oder Tiermodellen der Infektion, ein komplizierender Faktor sein kann. Darüber hinaus liefert der Chromatin-Immunpräzipitations-Assay (ChIP) oft eine signifikante Menge an Hintergrundsignal im gesamten Genom, was ein hohes Maß an Anreicherung für das Ziel von Interesse erfordert, um Signal und Rauschen ausreichend zu trennen. Während der ChIP-Chip-Assay heute weitgehend veraltet ist, machen die für ChIP-seq erforderlichen Sequenzierungstiefen diesen Assay für viele Forscher unerschwinglich teuer, insbesondere für diejenigen, die mehrere TFs und / oder Chromatin-assoziierte Proteine untersuchen.

Spaltung unter Targets und Freisetzung mittels Nuklease (CUT&RUN) ist eine attraktive Alternative zu ChIP-seq. Es wurde 2017 vom Henikoff-Labor entwickelt, um die Einschränkungen der endogenen Spaltung von ChIP-seq und Chromatin zu umgehen, gefolgt von der Sequenzierung von ChEC-seq 11,12, einer weiteren Methode zur Identifizierung von Protein-DNA-Interaktionen auf genomweiter Ebene, während gleichzeitig eine hochauflösende, genomweite Kartierung von TFs und Chromatin-assoziierten Proteinen bereitgestelltwird 13 . CUT&RUN beruht auf der gezielten Verdauung von Chromatin in permeabilisierten Kernen unter Verwendung von angebundenen Mikrokokken-Nukleasen, gefolgt von der Sequenzierung der verdauten DNA-Fragmente 9,10. Da DNA-Fragmente spezifisch an den Loci erzeugt werden, die an ein interessantes Protein gebunden sind, anstatt wie bei ChIP-Assays im gesamten Genom durch zufällige Fragmentierung erzeugt zu werden, führt der CUT&RUN-Ansatz zu stark reduzierten Hintergrundsignalen und erfordert daher 1/10der Sequenzierungstiefe im Vergleich zu ChIP-seq11,13. 14. Diese Verbesserungen führen letztendlich zu einer deutlichen Reduzierung der Sequenzierungskosten und zu einer Verringerung der Gesamtzahl der Eingangszellen, die als Ausgangsmaterial für jede Probe benötigt werden.
Hier wird ein robustes CUT&RUN-Protokoll beschrieben, das für die Bestimmung der genomweiten Lokalisation von TFs in C. albicans-Zellen , die aus Biofilmen und planktonischen Kulturen isoliert wurden, angepasst und optimiert wurde. Darüber hinaus wird eine gründliche Datenanalyse-Pipeline vorgestellt, die die Verarbeitung und Analyse der resultierenden Sequenzdaten ermöglicht und den Benutzern nur minimale Kenntnisse in der Kodierung oder Bioinformatik erfordert. Kurz gesagt, beschreibt dieses Protokoll die Epitopmarkierung von TF-kodierenden Genen, die Ernte von Biofilm- und Planktonzellen, die Isolierung intakter permeabilisierter Kerne, die Inkubation mit primären Antikörpern gegen das spezifische Protein oder epitopmarkierte Protein von Interesse, die Anbindeglied der chimären A/G-Mikrokokken-Nuklease (pAG-MNase) Fusionsproteine an die primären Antikörper, die genomische DNA-Erholung nach der Chromatinverdauung und die Vorbereitung genomischer DNA-Bibliotheken für die Sequenzierung.
Auf das experimentelle CUT&RUN-Protokoll folgt eine speziell entwickelte Datenanalyse-Pipeline, die Roh-DNA-Sequenzierungslesevorgänge im FASTQ-Format durchführt und alle erforderlichen Verarbeitungsschritte implementiert, um eine vollständige Liste der signifikant angereicherten Loci zu erhalten, die durch die TF von Interesse gebunden sind (gezielt durch den primären Antikörper). Beachten Sie, dass mehrere Schritte des beschriebenen Bibliotheksvorbereitungsprotokolls speziell für die CUT&RUN-Analyse von TFs (im Gegensatz zu Nukleosomen) angepasst und optimiert wurden. Während die in diesem Manuskript präsentierten Daten mit TF-spezifischen Anpassungen eines kommerziellen CUT&RUN-Kits generiert wurden, wurden diese Protokolle auch mit einzeln beschafften Komponenten (d. H. pAG-MNase-Enzym und magnetischen DNA-Aufreinigungsperlen) und intern hergestellten Puffern validiert, was die experimentellen Kosten erheblich senken kann. Die umfassenden Experimental- und Datenanalyseprotokolle werden im Folgenden in einem Schritt-für-Schritt-Format detailliert beschrieben. Alle Reagenzien und kritischen Geräte sowie Puffer- und Medienrezepte sind in der Materialtabelle bzw. in der Ergänzungsdatei 1 aufgeführt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGPM33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.65 mL low-adhesion tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490003-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-152-341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M PIPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ61224AK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well untreated cell culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Digitonin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CHR103MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x phusion HF buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as &#34;DNA polymerase buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP magnetic beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;capillary electrophoresis instrument&#34;; user-dependepent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89133-910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchling primer design tool</td>
			<td>Benchling</td>
			<td></td>
			<td>https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as &#34;the primer design tool&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ77507AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor white stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida Genome Database</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.candidagenome.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>&#160;86057-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conda software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curl tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ 
			chromosomes.fasta.gz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUTANA ChIC/CUT&#38;RUN kit</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>14-1048</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;the CUT&#38;RUN kit&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco D-mannitol</td>
			<td>&#160;BD Biosciences</td>
			<td>217020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Loading Dye (6x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq green DNA polymerase</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>EP0713</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;cPCR DNA polymerase&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq green DNA polymerase buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>EP0713</td>
			<td>Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as &#34;cPCR DNA polymerase buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli spike-in DNA</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>18-1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELMI Microplate incubator</td>
			<td>ELMI</td>
			<td>TRMS-04</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;microplate incubator&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End Prep Enzyme Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End Prep Reaction Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest MssI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FD1344</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;restriction enzyme&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest MssI Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FD1344</td>
			<td>Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as &#34;restriction enzyme buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP525-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler low range DNA ladder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FERSM1192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GitBash workflow</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://gitforwindows.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GitHub source code</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-KOH pH 7.5</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BBH-75-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PX1830-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52846-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Enhancer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate dihydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>215525683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody</td>
			<td>Takara</td>
			<td>632592</td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://pypi.org/project/MACS2/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>10-0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate and cuvette spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>EPOCH2TC</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;spectrophotometer&#34;; user-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MochiView</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCBI GEO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Adaptor for Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as &#34;Adapter&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Index X Primer for Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as &#34;Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;library prep kit&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Universal PCR Primer for Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as &#34;Universal Forward Library Amplification Primer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin sulfate (NAT)</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>N-500-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex TBE Gels, 10%, 15 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>EC62755BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient broth</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C6471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH110</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90982</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90982&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH119</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90985</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90985&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH137</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90986</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90986&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH139</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90987</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90987&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH140</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90988</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90988&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG-MNase</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>15-1016 or 15-1116</td>
			<td>50 rxn or 250 rxn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCE1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>174434</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 174434&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes with clear lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion high fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;DNA polymerase&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 3350</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10791-816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x dsDNA HS assay kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;fluorometer&#34;; user-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG negative control antibody</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>13-0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109169001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M12820004</td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile inoculating loops</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30002-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO 13 nucleic acid stain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S7575</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;nucleic acid gel stain&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252859-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra II Ligation Master Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as &#34;Ligation Master Mix&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra II Q5 Master Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as &#34;High Fidelity DNA Polymerase Master Mix &#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure salmon sperm DNA solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER Enzyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as &#34;Uracil Excision Enzyme&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wget tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ 
			chromosomes.fasta.gz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C7341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0439194</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide profiling of transcription factor-dna binding interactions in candida albicans: a comprehensive cut&amp;run method and data analysis workflow

Regulatorische Transkriptionsfaktoren steuern viele wichtige biologische Prozesse, einschließlich der zellulären Differenzierung, der Reaktionen auf Umweltstörungen und -belastungen sowie der Wechselwirkungen zwischen Wirt und Krankheitserreger. Die Bestimmung der genomweiten Bindung von regulatorischen Transkriptionsfaktoren an die DNA ist essentiell, um die Funktion von Transkriptionsfaktoren in diesen oft komplexen biologischen Prozessen zu verstehen. Spaltung unter Targets und Freisetzung mittels Nuklease (CUT&RUN) ist eine moderne Methode zur genomweiten Kartierung von In-vivo-Protein-DNA-Bindungsinteraktionen, die eine attraktive Alternative zur traditionellen und weit verbreiteten Chromatin-Immunpräzipitationsmethode mit anschließender Sequenzierung (ChIP-seq) darstellt. CUT&RUN ist für einen experimentellen Aufbau mit höherem Durchsatz geeignet und hat einen wesentlich höheren Dynamikbereich mit niedrigeren Sequenzierungskosten pro Probe als ChIP-seq. Hier werden ein umfassendes CUT&RUN-Protokoll und ein begleitender Datenanalyse-Workflow beschrieben, der auf die genomweite Analyse von Transkriptionsfaktor-DNA-Bindungsinteraktionen im menschlichen Pilzpathogen Candida albicans zugeschnitten ist. Dieses detaillierte Protokoll umfasst alle notwendigen experimentellen Verfahren, vom Epitop-Tagging von Transkriptionsfaktor-kodierenden Genen bis zur Bibliotheksvorbereitung für die Sequenzierung; Darüber hinaus enthält es einen angepassten Berechnungsworkflow für die CUT&RUN-Datenanalyse.

Dieses robuste CUT&RUN-Protokoll wurde angepasst und optimiert, um die genomweite Lokalisierung spezifischer TFs in C. albicans-Biofilmen und planktonischen Kulturen zu untersuchen (siehe Abbildung 2 für einen Überblick über den experimentellen Ansatz). Eine gründliche Datenanalyse-Pipeline ist ebenfalls enthalten, um die Analyse der resultierenden CUT&RUN-Sequenzierungsdaten zu erleichtern, und erfordert von den Benutzern minimale Kenntnisse in der Kodierung oder Bioinformatik ...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow at JoVE.

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow

Dieses Protokoll beschreibt eine experimentelle Methode und einen Datenanalyse-Workflow für die Spaltung unter Targets und die Freisetzung mittels Nuklease (CUT&RUN) im humanen Pilzpathogen Candida albicans.

Genomweite Profilierung von Transkriptionsfaktor-DNA-Bindungsinteraktionen in Candida albicans: Eine umfassende CUT&amp;RUN-Methode und Datenanalyse-Workflow

Regulatory transcription factors control many important biological processes, including cellular differentiation, responses to environmental perturbations ...

Dieses Protokoll beschreibt alle experimentellen Verfahren, vom Epitop-Tagging von Transkriptionsfaktor-kodierenden Genen über die computergestützte Datenanalyse bis hin zur genomweiten Profilierung von Transkriptionsfaktor-DNA-Bindungsinteraktionen in Candida albicans über CUT&RUN. Dies ist eine zugänglichere, schnellere, empfindlichere, kostengünstigere Technik und liefert qualitativ hochwertigere Daten als herkömmliche ChIP-Chip- und ChIP-seq-Ansätze. Obwohl unser Protokoll für Candida albicans-Zellen entwickelt wurde, die aus Biofilmen oder Planktonkulturen isoliert wurden, sollte es praktisch sein, es an praktisch jede gute Form von Candida albicans-Zellen anzupassen.Nach der Inkubation der Zellsuspension ein Fünf-Mikroliter-Aliquot in ein neues PCR-Röhrchen überführen. Zu fünf Mikrolitern isolierter Kerne und einem Fünf-Mikroliter-Aliquot intakter Zellen, die zuvor bei vier Grad Celsius gelagert wurden, fügen Sie je einen Mikroliter Calcofluor-White und SYTO 13 hinzu. 30 Minuten bei 30 Grad Celsius im Dunkeln inkubieren.Untersuchen Sie die Integrität und Reinheit der isolierten Kerne visuell mit einem Fluoreszenzmikroskop. Suchen Sie nach isolierten Kernen, die eine prominente SYTO 13-Färbung aufweisen, und stellen Sie sicher, dass keine Zellwandfärbung durch den kalcofluorweißen Farbstoff erfolgt. Wiederholen Sie die Inspektion mit intakten Zellen als Kontrolle für die Zellwandfärbung mit kalcofluorweißem Farbstoff.Legen Sie die Rohre auf ein Magnetgestell und warten Sie, bis die Aufschlämmung vollständig klar ist. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette. Fügen Sie 50 Mikroliter des Antikörperpuffers hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren.Fügen Sie drei Mikroliter des polyklonalen Anti-GFP-Antikörpers zu den Röhrchen hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen auf einem Nutmischer bei 4 Grad Celsius für zwei Stunden. Zentrieren Sie die Röhrchen kurz bei 100 mal g bei Raumtemperatur für fünf Sekunden und legen Sie die Röhrchen auf ein Magnetgestell. Sobald die Gülle klar ist, entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette.Während sich die Röhrchen mit den Perlen noch auf dem Magnetgestell befinden, fügen Sie 200 Mikroliter eiskalten Zellpermeabilisierungspuffer direkt auf die Perlen hinzu. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette. Wiederholen Sie zwei Wäschen mit dem eiskalten Zellpermeabilisierungspuffer.Fügen Sie 50 Mikroliter eiskalten Zellpermeabilisierungspuffer zu jedem Röhrchen hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren. 2,5 Mikroliter des Proteins AG-MNase zu jeder Probe geben und durch Pipettieren mischen. Legen Sie die Proben bei 4 Grad Celsius auf einen Nutenmischer und inkubieren Sie die Proben für eine Stunde.Die Bandröhrchen bei Raumtemperatur fünf Sekunden lang kurz mit 100 mal g zentrifugieren und dann auf ein Magnetgestell legen. Sobald die Gülle klar ist, entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette. Während sich die Röhrchen mit den Perlen noch auf dem Magnetgestell befinden, fügen Sie 200 Mikroliter eiskalten Zellpermeabilisierungspuffer direkt auf die Perlen hinzu.Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette. Wiederholen Sie zwei Wäschen mit dem eiskalten Zellpermeabilisierungspuffer. Fügen Sie 100 Mikroliter des eiskalten Zellpermeabilisierungspuffers zu den Proben hinzu und pipettieren Sie fünfmal vorsichtig auf und ab.Entfernen Sie den Gelguss aus der Gelbox und öffnen Sie den Gelguss gemäß den Anweisungen des Herstellers. Entfernen Sie das Gel vorsichtig aus dem Gelguss und legen Sie es in eine gelhaltende Schale mit 100 Millilitern einstärkendem FSME. 10 Mikroliter des Nukleinsäuregel-Flecks in die Schale geben und vorsichtig schwenken.Zum Schutz vor Licht mit Folie abdecken und bei Raumtemperatur 10 Minuten lang statisch inkubieren. Dann spülen Sie das Gel zweimal mit 100 Milliliter deionisiertem Leitungswasser ab. Stellen Sie das Gel unter blauer Lichtbeleuchtung mit einer gelben Filterabdeckung dar.Für jede Bibliothek schneiden Sie das Gel leicht über das etwa 125 Basenpaar prominente Adapterdimerband und unterhalb der 400 Basenpaarleitermarke. Durchstechen Sie den Boden eines 0,65-Milliliter-Röhrchens mit einer 22-Gauge-Nadel und legen Sie das punktierte Rohr in ein steriles Zwei-Milliliter-Mikrofugenröhrchen. Übertragen Sie die Gelscheibe auf das punktierte Röhrchen im Zwei-Milliliter-Mikrofugenröhrchen.Zentrifugieren Sie das Zwei-Milliliter-Mikrofugenröhrchen, das das 0,65-Milliliter-Punktionsröhrchen enthält, und entnehmen Sie zwei Minuten lang bei Raumtemperatur 10.000 g die Probe, um die Gelaufschlämmung im Zwei-Milliliter-Mikrofugenröhrchen zu sammeln. 300 Mikroliter eiskalten Gel-Elutionspuffer in die Gel-Aufschlämmung geben. Mischen Sie auf einem Nutator bei Raumtemperatur für mindestens drei Stunden oder über Nacht.Gesamte Flüssigkeits- und Gelaufschlämmung in eine 0,22 Mikrometer große Filtersäule und Zentrifuge bei 10.000 mal g bei Raumtemperatur für eine Minute geben. Laden Sie den Quellcode für die CUT&RUN-Analyse von der GitHub-Seite herunter, indem Sie auf die grüne Schaltfläche Code klicken, gefolgt von der Option ZIP herunterladen. Entpacken Sie den Ordner an einen relevanten Speicherort auf dem lokalen Computer.Installieren Sie Conda Environment und führen Sie es nur einmal aus. Sobald Conda installiert ist, erstellen Sie eine virtuelle Umgebung, die mit dem entsprechenden Befehl bereitgestellt wird. Aktivieren Sie die virtuelle Umgebung jedes Mal, wenn dieser Workflow ausgeführt wird.Der Zellwandaufschluss und die nukleare Integrität wurden bewertet, indem sowohl intakte Zellen als auch isolierte Kerne sichtbar gemacht wurden, die mit fluoreszierenden Zellwand- und Nukleinsäurefärbungen angefärbt waren. Im Gegensatz zu den isolierten intakten Kernen, bei denen keine Zellwandfärbung beobachtet wird, sind sowohl die Kerne als auch die Zellwände in den intakten Kontrollzellen fluoreszierend markiert. Die Abbildung zeigt CUT&RUN TF-Bibliotheken, die mit einem Kapillarelektrophorese-Instrument analysiert wurden.Erfolgreiche CUT&RUN TF-Bibliotheken sind für kurze Fragmente kleiner als 200 Basenpaare angereichert. Suboptimale CUT&RUN TF-Bibliotheken zeigen eine Anreicherung für große DNA-Fragmente. Die Abbildung hierin zeigt, dass Ndt80-DNA-bindende Motive über alle von CUT&RUN identifizierten Ndt80-gebundenen Loci angereichert sind, was darauf hindeutet, dass die zusätzlichen Peaks, die mit dieser Methodik identifiziert wurden, wahrscheinlich bonafide Ndt80-gebundene Sites sind.Vergleichende Analysen zeigten, dass das CUT&RUN-Protokoll die meisten der bisher bekannten Bindungsereignisse für Ndt80 und Efg1 während der Biofilmbildung identifizierte. Insgesamt überschneiden sich sowohl Ndt80 als auch Efg1, die an Loci gebunden sind, mit zuvor veröffentlichten ChIP-Daten zur Chromatin-Immunpräzipitation und werden nur mithilfe von CUT&RUN identifiziert. Es ermöglicht uns, den Umfang und das Tempo unserer Forschung, die sich auf transkriptionelle regulatorische Netzwerke und Candida albicans konzentriert, deutlich zu erhöhen.

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&amp;RUN Method and Data Analysis Workflow

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

Genomweite Analyse der Aminoacylierung (Charging) Ebenen der tRNA mittels Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Forschung

Biologie

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Genomweite Analyse mittels ChIP zu Isoform-spezifische Gene-Targets zu identifizieren

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

A Quantitative Analysis Fitness-Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

A Novel Bayesian Change-Punkt Algorithmus für genomweite Analyse Diverse ChIPseq Datentypen

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

Polysomprofile Fraktionierung und Analyse von Säuger Translatomes auf einer Genom-weite Skala

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Genomweite Kartierung der Drug-DNA-Wechselwirkungen in Zellen mit COSMIC (Vernetzung von kleinen Molekülen, um Chromatin isolieren)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DAMiD-seq: Genomweite Mapping von Protein-DNA-Wechselwirkungen von Hochdurchsatz-Sequenzierung von Adenin-methylierten DNA-Fragmenten

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Komplette Workflow zur Analyse von Histon-post-translationale Modifikationen Mit Bottom-up-Massenspektrometrie: Von Histone Extraktion in Datenanalyse

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

Umfassenden Workflow zur genomweiten Identifizierung und Ausdruck Meta-Analyse von der ATL E3 Ubiquitin Ligase Genfamilie in Grapevine

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...