Name: genome-wide profiling of transcription factor-dna binding interactions in candida albicans: a comprehensive cut&amp;run method and data analysis workflow
Uploaded: 2022-04-01T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow at JoVE.

אנו מודים לכל חברי מעבדות נובל והרנדאי בעבר ובהווה על המשוב על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (NIGMS) מספר R35GM124594 ועל ידי משפחת קמנגר בצורה של כיסא ניחן ל- C.J.N. עבודה זו נתמכה גם על ידי פרס המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של NIH (NIAID) מספר R15AI137975 ל- A.D.H.C.L.E. נתמך על ידי מלגת המכון הלאומי למחקר דנטלי וקרניופציאלי של NIH (NIDCR) מספר מלגת F31DE028488. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של הכותבים ואינו מייצג את דעותיהם של המממנים. למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר; באיסוף, ניתוח או פרשנות של נתונים; בכתיבת כתב היד; או בהחלטה לפרסם את התוצאות.

1. תיוג אפיטופי של זנים C. albicans 
<ol><li>העלה את הגן המעניין, יחד עם רצפי האגף שלו באורך 1 קילו במעלה הזרם ובמורד הזרם, ממסד הנתונים של הגנום של קנדידה לכלי עיצוב הפריימר (ראה טבלת החומרים). תכננו רנ"א מנחה (gRNA) על ידי הדגשת 50 bp במעלה הזרם ובמורד הזרם מקודון העצירה, ולחצו ...

<ol>
	<li>Gulati, M., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms:+development,+regulation,+and+molecular+mechanisms.">Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms.</a> Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).</li><li>Lohse, M. B., Gulati, M., Johnson, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regulation+of+single-and+multi-species+Candida+albicans+biofilms.">Development and regulation of single-and multi-species Candida albicans biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 19-31 (2018).</li><li>Nobile, C. J., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms+and+human+disease.">Candida albicans biofilms and human disease.</a> Annual Review of Microbiology. 69 (1), 71-92 (2015).</li><li>Nobile, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recently+evolved+transcriptional+network+controls+biofilm+development+in+Candida+albicans.">A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans.</a> Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).</li><li>Iracane, E., Vega-Est&#233;vez, S., Buscaino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+and+off:+epigenetic+regulation+of+C.+albicans+morphological+switches.">On and off: epigenetic regulation of C. albicans morphological switches.</a> Pathogens. 10 (11), 1463 (2021).</li><li>Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Hernday, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+chromatin+accessibility+in+regulating+the+Candida+albicans+white-opaque+phenotypic+switch.">The roles of chromatin accessibility in regulating the Candida albicans white-opaque phenotypic switch.</a> Journal of Fungi. 7 (1), 37 (2021).</li><li>Mancera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+complex+transcription+network+controlling+biofilm+formation+in+candida+species.">Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in candida species.</a> eLife. 10, 64682 (2021).</li><li>Lohse, M. B., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+Wor4,+a+new+transcriptional+regulator+of+white-opaque+switching.">Identification and characterization of Wor4, a new transcriptional regulator of white-opaque switching.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (3), 721-729 (2016).</li><li>Hernday, A. D., Noble, S. M., Mitrovich, Q. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+molecular+biology+in+Candida+albicans.">Genetics and molecular biology in Candida albicans.</a> Methods in Enzymology. 470, 737-758 (2010).</li><li>Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+and+microarray-based+analysis+of+protein+location.">Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location.</a> Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).</li><li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733 (2015).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIC+and+ChEC:+Genomic+mapping+of+chromatin+proteins.">ChIC and ChEC: Genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856 (2017).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+in+situ+genome-wide+profiling+with+high+efficiency+for+low+cell+numbers.">Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers.</a> Nature Protocols. 13 (5), 1006-1019 (2018).</li><li>Nguyen, N., Quail, M. M. F., Hernday, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient,+rapid,+and+recyclable+system+for+CRISPR-mediated+genome+editing+in+Candida+albicans.">An efficient, rapid, and recyclable system for CRISPR-mediated genome editing in Candida albicans.</a> American Society For Microbiology. 2 (2), 00149 (2017).</li><li>Ennis, C. L., Hernday, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+markerless+CRISPR-mediated+system+for+genome+editing+in+Candida+auris+reveals+a+conserved+role+for+Cas5+in+the+caspofungin+response.">A markerless CRISPR-mediated system for genome editing in Candida auris reveals a conserved role for Cas5 in the caspofungin response.</a> Microbiology Spectrum. 9 (3), 0182021 (2021).</li><li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+CUT&amp;RUN+chromatin+profiling+tools.">Improved CUT&amp;RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314 (2019).</li><li>Skrzypek, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Candida+Genome+Database+(CGD):+Incorporation+of+Assembly+22,+systematic+identifiers+and+visualization+of+high+throughput+sequencing+data.">The Candida Genome Database (CGD): Incorporation of Assembly 22, systematic identifiers and visualization of high throughput sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 45, 592-596 (2017).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li><li>Boyd, J., Rodriguez, P., Schjerven, H., Frietze, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ssvQC:+an+integrated+CUT&amp;RUN+quality+control+workflow+for+histone+modifications+and+transcription+factors.">ssvQC: an integrated CUT&amp;RUN quality control workflow for histone modifications and transcription factors.</a> BMC Research Notes. 14 (1), 366 (2021).</li><li>Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BigWig+and+BigBed:+enabling+browsing+of+large+distributed+datasets.">BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets.</a> Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).</li><li>Homann, O. R., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MochiView:+Versatile+software+for+genome+browsing+and+DNA+motif+analysis.">MochiView: Versatile software for genome browsing and DNA motif analysis.</a> BMC Biology. 8, 49 (2010).</li><li>Hainer, S. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+chromatin+profiling+using+CUT&amp;RUN.">High-resolution chromatin profiling using CUT&amp;RUN.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Rodriguez, D. L., Quail, M. M., Hernday, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+circuits+regulating+developmental+processes+in+Candida+albicans.">Transcriptional circuits regulating developmental processes in Candida albicans.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 605711 (2020).</li><li>Zhu, Q., Liu, N., Orkin, S. H., Yuan, G. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;amp;RUNTools:+a+flexible+pipeline+for+CUT&amp;amp;RUN+processing+and+footprint+analysis.">CUT&amp;amp;RUNTools: a flexible pipeline for CUT&amp;amp;RUN processing and footprint analysis.</a> Genome Biology. 20 (1), 192 (2019).</li><li>Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+expressed+loci+are+vulnerable+to+misleading+ChIP+localization+of+multiple+unrelated+proteins.">Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18602-18607 (2013).</li></ol>

פרוטוקול זה מציג צינור ניסיוני וחישובי מקיף ללוקליזציה כלל-גנומית של TFs רגולטוריים ב- C. albicans. הוא מתוכנן להיות נגיש מאוד לכל מי שיש לו הכשרה סטנדרטית במיקרוביולוגיה וביולוגיה מולקולרית. על ידי מינוף הטווח הדינמי הגבוה ודרישות קלט הדגימה הנמוכות של מבחן CUT&RUN וכולל אופטימיזציות ללוקלי?...

קנדידה אלביקנס היא פתוגן פטרייתי אנושי פולימורפי רלוונטי מבחינה קלינית, שקיים במגוון מצבי גדילה שונים, כגון מצב הצמיחה הפלנקטוני (צף חופשי) וכקהילות של תאים דבוקים היטב המוגנים על ידי מטריצה חוץ-תאית, המכונה מצב הביופילם של צמיחה 1,2,3. בדומה לתהליכים התפתחותיים ותאיים אחרים, פיתוח ביופילם הוא תכונת אלימות חשובה של C. albicans, הידועה כמבוקרת ברמת השעתוק על ידי גורמי שעתוק רגולטוריים (TFs) הנקשרים לדנ"א באופן ספציפי לרצף4. לאחרונה, רגולטורים של כרומטין ומשני היסטון התגלו גם כרגולטורים חשובים של היווצרות ביופילם C. albicans 5 ומורפוגנזה6 על ידי תיווך נגישות DNA. כדי להבין את הביולוגיה המורכבת של הפתוגן הפטרייתי החשוב הזה, שיטות יעילות לקביעת לוקליזציה כלל-גנומית של TFs ספציפיים במהלך תהליכים התפתחותיים ותאיים שונים הן בעלות ערך.
קדם חיסוני של כרומטין ואחריו ריצוף (ChIP-seq) היא שיטה נפוצה לחקר אינטראקציות חלבון-דנ"א ב- C. albicans 5,6 והחליפה במידה רבה את מערכת החיסון הקלאסית יותר של כרומטין ואחריה את שיטת המיקרו-מערך (ChIP-chip)9. עם זאת, הן שיטות ChIP-seq והן ChIP-chip דורשות מספר רב של תאי קלט10, מה שיכול להיות גורם מסבך כאשר חוקרים TFs בהקשר של דגימות ספציפיות ודרכי גדילה, כגון ביופילמים שנאספו מחולים או מודלים של זיהום בעלי חיים. בנוסף, בדיקת הכרומטין החיסונית (ChIP) מניבה לעתים קרובות כמות משמעותית של אות רקע לאורך הגנום, הדורשת רמה גבוהה של העשרה עבור המטרה המעניינת כדי להפריד מספיק את האות מהרעש. בעוד שהבדיקה של ChIP-chip מיושנת במידה רבה כיום, עומקי הריצוף הדרושים ל-ChIP-seq הופכים את הבדיקה הזו ליקרה מאוד עבור חוקרים רבים, במיוחד אלה שחוקרים מספר TFs ו/או חלבונים הקשורים לכרומטין.

מחשוף תחת מטרות ושחרור באמצעות נוקלאז (CUT&RUN) הוא חלופה אטרקטיבית ל- ChIP-seq. הוא פותח על ידי מעבדת Henikoff בשנת 2017 כדי לעקוף את המגבלות של ChIP-seq ו chromatin endogenous cleavage ואחריו רצף ChEC-seq11,12, שיטה נוספת לזיהוי אינטראקציות חלבון-DNA ברמה כלל-גנומית, תוך מתן מיפוי רחב גנום ברזולוציה גבוהה של TFs וחלבונים הקשורים לכרומטין13 . CUT&RUN מסתמך על עיכול ממוקד של כרומטין בתוך גרעינים חודרים באמצעות נוקלאזות מיקרו-קוקליות קשורות, ולאחר מכן ריצוף של מקטעי הדנ"א המעוכלים 9,10. מכיוון שמקטעי דנ"א נוצרים באופן ספציפי במוקדים הקשורים לחלבון בעל עניין, במקום להיווצר לאורך כל הגנום באמצעות פיצול אקראי כמו במבחני ChIP, גישת CUT&RUN מביאה להפחתהמשמעותית של אותות רקע, ולכן דורשת 1/10 מעומק הריצוף בהשוואה ל-ChIP-seq11,13, 14. שיפורים אלה מובילים בסופו של דבר להפחתה משמעותית בעלויות הריצוף ולהפחתה במספר הכולל של תאי הקלט הדרושים כחומר התחלתי עבור כל דגימה.
כאן מתואר פרוטוקול CUT&RUN חזק שהותאם והותאם ומוטב לקביעת לוקליזציה כלל-גנומית של TFs בתאי C. albicans שבודדו מביופילמים ותרביות פלנקטוניות. כמו כן מוצג צינור ניתוח נתונים יסודי, המאפשר עיבוד וניתוח של נתוני הרצף המתקבלים ודורש מהמשתמשים מומחיות מינימלית בקידוד או בביואינפורמטיקה. בקצרה, פרוטוקול זה מתאר תיוג אפיטופים של גנים המקודדים TF, קצירת תאים ביופילם ופלנקטוניים, בידוד של גרעינים חודרים שלמים, דגירה עם נוגדנים ראשוניים כנגד החלבון הספציפי או החלבון המתויג באפיטופ, קשירת חלבוני ההיתוך הכימריים A/G-micrococcal Nuclease (pAG-MNase) לנוגדנים העיקריים, התאוששות DNA גנומית לאחר עיכול כרומטין, והכנת ספריות DNA גנומיות לריצוף.
פרוטוקול CUT&RUN הניסיוני מלווה בצנרת ניתוח נתונים ייעודית, שלוקחת קריאות ריצוף DNA גולמיות בפורמט FASTQ ומיישמת את כל שלבי העיבוד הנדרשים כדי לספק רשימה מלאה של מוקדים מועשרים באופן משמעותי הקשורים ל- TF של עניין (ממוקד על ידי הנוגדן העיקרי). שים לב ששלבים מרובים של פרוטוקול הכנת הספרייה המתואר הותאמו והותאמו במיוחד לניתוח CUT&RUN של TFs (בניגוד לנוקלאוזומים). בעוד שהנתונים המוצגים בכתב יד זה נוצרו באמצעות התאמות ספציפיות ל-TF של ערכת CUT&RUN מסחרית, פרוטוקולים אלה אומתו גם באמצעות רכיבים שמקורם בנפרד (כלומר, אנזים pAG-MNase וחרוזי טיהור DNA מגנטיים) ובמאגרים מוכנים בתוך הבית, מה שיכול להפחית באופן משמעותי את עלות הניסוי. פרוטוקולי הניסוי וניתוח הנתונים המקיפים מתוארים בפירוט להלן בפורמט שלב אחר שלב. כל הריאגנטים והציוד הקריטי, כמו גם מתכוני המאגר והמדיה, מפורטים בטבלת החומרים ובקובץ המשלים 1, בהתאמה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGPM33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.65 mL low-adhesion tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490003-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-152-341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M PIPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ61224AK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well untreated cell culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Digitonin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CHR103MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x phusion HF buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as &#34;DNA polymerase buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP magnetic beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;capillary electrophoresis instrument&#34;; user-dependepent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89133-910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchling primer design tool</td>
			<td>Benchling</td>
			<td></td>
			<td>https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as &#34;the primer design tool&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ77507AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor white stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida Genome Database</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.candidagenome.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>&#160;86057-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conda software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curl tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ 
			chromosomes.fasta.gz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUTANA ChIC/CUT&#38;RUN kit</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>14-1048</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;the CUT&#38;RUN kit&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco D-mannitol</td>
			<td>&#160;BD Biosciences</td>
			<td>217020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Loading Dye (6x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq green DNA polymerase</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>EP0713</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;cPCR DNA polymerase&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq green DNA polymerase buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>EP0713</td>
			<td>Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as &#34;cPCR DNA polymerase buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli spike-in DNA</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>18-1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELMI Microplate incubator</td>
			<td>ELMI</td>
			<td>TRMS-04</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;microplate incubator&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End Prep Enzyme Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End Prep Reaction Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest MssI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FD1344</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;restriction enzyme&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest MssI Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FD1344</td>
			<td>Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as &#34;restriction enzyme buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP525-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler low range DNA ladder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FERSM1192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GitBash workflow</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://gitforwindows.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GitHub source code</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-KOH pH 7.5</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BBH-75-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PX1830-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52846-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Enhancer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate dihydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>215525683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody</td>
			<td>Takara</td>
			<td>632592</td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://pypi.org/project/MACS2/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>10-0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate and cuvette spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>EPOCH2TC</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;spectrophotometer&#34;; user-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MochiView</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCBI GEO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Adaptor for Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as &#34;Adapter&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Index X Primer for Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as &#34;Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;library prep kit&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Universal PCR Primer for Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as &#34;Universal Forward Library Amplification Primer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin sulfate (NAT)</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>N-500-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex TBE Gels, 10%, 15 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>EC62755BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient broth</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C6471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH110</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90982</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90982&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH119</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90985</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90985&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH137</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90986</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90986&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH139</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90987</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90987&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH140</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90988</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90988&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG-MNase</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>15-1016 or 15-1116</td>
			<td>50 rxn or 250 rxn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCE1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>174434</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 174434&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes with clear lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion high fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;DNA polymerase&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 3350</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10791-816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x dsDNA HS assay kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;fluorometer&#34;; user-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG negative control antibody</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>13-0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109169001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M12820004</td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile inoculating loops</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30002-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO 13 nucleic acid stain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S7575</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;nucleic acid gel stain&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252859-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra II Ligation Master Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as &#34;Ligation Master Mix&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra II Q5 Master Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as &#34;High Fidelity DNA Polymerase Master Mix &#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure salmon sperm DNA solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER Enzyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as &#34;Uracil Excision Enzyme&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wget tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ 
			chromosomes.fasta.gz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C7341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0439194</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide profiling of transcription factor-dna binding interactions in candida albicans: a comprehensive cut&amp;run method and data analysis workflow

גורמי שעתוק רגולטוריים שולטים בתהליכים ביולוגיים חשובים רבים, כולל התמיינות תאית, תגובות להפרעות ולחצים סביבתיים, ואינטראקציות בין פונדקאי לפתוגן. קביעת הקשירה הכלל-גנומית של גורמי שעתוק רגולטוריים לדנ"א חיונית להבנת תפקידם של גורמי שעתוק בתהליכים ביולוגיים מורכבים אלה. ביקוע תחת מטרות ושחרור באמצעות נוקלאז (CUT&RUN) היא שיטה מודרנית למיפוי כלל-גנומי של אינטראקציות קושרות חלבון-דנ"א in vivo המהווה חלופה אטרקטיבית לתפיסת החיסון המסורתית והנפוצה של כרומטין ואחריה לריצוף (ChIP-seq). CUT&RUN מקובל על מערך ניסיוני בעל תפוקה גבוהה יותר ויש לו טווח דינמי גבוה משמעותית עם עלויות ריצוף נמוכות יותר לכל מדגם מאשר ChIP-seq. כאן מתוארים פרוטוקול CUT&RUN מקיף וזרימת עבודה נלווית של ניתוח נתונים המותאמים לניתוח כלל-גנומי של אינטראקציות קושרות גורמי שעתוק-DNA בפתוגן הפטרייתי האנושי קנדידה אלביקנס . פרוטוקול מפורט זה כולל את כל ההליכים הניסוייים הדרושים, החל מתיוג אפיטופים של גנים המקודדים גורמי שעתוק וכלה בהכנת ספרייה לריצוף; בנוסף, הוא כולל זרימת עבודה חישובית מותאמת אישית לניתוח נתונים CUT&RUN.

פרוטוקול CUT&RUN חזק זה הותאם והותאם לחקר לוקליזציה כלל-גנומית של TFs ספציפיים בביופילמים של C. albicans ובתרביות פלנקטוניות (ראו איור 2 לסקירה כללית של הגישה הניסויית). צינור ניתוח נתונים יסודי נכלל גם כדי להקל על ניתוח נתוני הריצוף של CUT&RUN שהתקבלו, ודורש מהמשתמשים מומחיות מיני...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow at JoVE.

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow

פרוטוקול זה מתאר שיטה ניסיונית וזרימת עבודה של ניתוח נתונים עבור ביקוע תחת מטרות ושחרור באמצעות נוקלאז (CUT&RUN) בפתוגן הפטרייתי האנושי קנדידה אלביקנס.

פרופיל כלל-גנומי של אינטראקציות קשירה בין גורמי שעתוק לדנ"א בקנדידה אלביקנס: שיטת CUT&amp;RUN מקיפה וזרימת עבודה של ניתוח נתונים

Regulatory transcription factors control many important biological processes, including cellular differentiation, responses to environmental perturbations ...

פרוטוקול זה מפרט את כל ההליכים הניסוייים, החל מתיוג אפיטופים של גנים המקודדים גורמי שעתוק באמצעות ניתוח נתונים חישוביים, וכלה בביצוע פרופילים כלל-גנומיים של אינטראקציות קישור פקטור שעתוק-DNA בקנדידה אלביקנס באמצעות CUT&RUN. זוהי טכניקה נגישה יותר, מהירה יותר, רגישה יותר, יקרה פחות, והיא מספקת נתונים באיכות גבוהה יותר מגישות ChIP-chip ו-ChIP-seq מסורתיות. למרות שהפרוטוקול שלנו פותח עבור תאי קנדידה אלביקנס המבודדים מביופילמים או מתרביות פלנקטוניות, זה צריך להיות מעשי להתאים אותו כמעט לכל צורה טובה של תאי קנדידה אלביקנס.לאחר דגירה של תרחיף התא, העבירו אליקווט בעל חמישה מיקרוליטרים לצינור PCR חדש. לחמישה מיקרוליטרים של גרעינים מבודדים ואליקווט של חמישה מיקרוליטרים של תאים שלמים שאוחסנו בעבר בארבע מעלות צלזיוס, הוסיפו מיקרוליטר אחד כל אחד של קלקופלואור-לבן ו-SYTO 13. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס בחושך במשך 30 דקות.בדקו באופן חזותי את שלמותם וטוהרם של הגרעינים המבודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חפשו גרעינים מבודדים המציגים צביעה בולטת של SYTO 13 וודאו שאין צביעה על דופן התא על-ידי הצבע הלבן-עגל. חזור על הבדיקה עם תאים שלמים כבקרה להכתמת דופן התא בצבע לבן-עגל.הניחו את הצינורות על מתלה מגנטי והמתינו עד שהסלרי יהיה ברור לחלוטין. השליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של מאגר הנוגדנים ומערבבים בעדינות על ידי צנרת.מוסיפים שלושה מיקרוליטרים של הנוגדן הפוליקלונלי נגד GFP לצינורות ומדגדגים את הצינורות על מערבל אגוזים ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. צנטריפוגה קצרה של הצינורות ב-100 פעמים גרם בטמפרטורת החדר למשך חמש שניות והניחו את הצינורות על מדף מגנטי. ברגע שהסלורי ברור, השליכו את הסופרנטנט באמצעות פיפטה.בזמן שהצינורות עם החרוזים עדיין נמצאים על המדף המגנטי, הוסיפו 200 מיקרוליטרים של חיץ חדירה של תאים קרים כקרח ישירות על החרוזים. השליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה. חזרו על שתי שטיפות עם מאגר חדירת התאים הקרים כקרח.מוסיפים 50 מיקרוליטרים של חיץ חדירה של תאים קרים כקרח לכל צינור ומערבבים בעדינות על ידי צנרת. הוסיפו 2.5 מיקרוליטרים של החלבון AG-MNase לכל דגימה וערבבו על ידי צנרת. מניחים את הדגימות על מיקסר אגוזים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ומדגרים את הדגימות למשך שעה אחת.צנטריפוגה קצרה בצינורות הרצועה ב-100 פעמים גרם בטמפרטורת החדר למשך חמש שניות, ואז הניחו את הצינורות על מתלה מגנטי. ברגע שהסלורי ברור, השליכו את הסופרנטנט באמצעות פיפטה. בזמן שהצינורות עם החרוזים עדיין נמצאים על המדף המגנטי, הוסיפו 200 מיקרוליטרים של חיץ חדירה של תאים קרים כקרח ישירות על החרוזים.השליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה. חזרו על שתי שטיפות עם מאגר חדירת התאים הקרים כקרח. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של מאגר החדירה של התאים הקרים כקרח לדגימות ופיפט בעדינות למעלה ולמטה חמש פעמים.מוציאים את יציקת הג'ל מקופסת הג'ל ופותחים את יציקת הג'ל בהתאם להוראות היצרן. מוציאים בעדינות את הג'ל מיציקת הג'ל ומניחים אותו בתוך מגש מחזיק ג'ל המכיל 100 מיליליטר של TBE חד-חוזק. מוסיפים 10 מיקרוליטרים של כתם הג'ל של חומצת הגרעין למגש ומסתחררים בעדינות.יש לכסות בנייר כסף כדי להגן מפני אור ולדגום באופן סטטי בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן יש לשטוף את הג'ל פעמיים עם 100 מיליליטר של מי ברז שעברו דה-יוניזציה. דמיינו את הג'ל תחת תאורת אור כחול באמצעות כיסוי מסנן ענבר.עבור כל ספרייה, חתכו את הג'ל מעט מעל רצועת הדימר הבולטת של זוג הבסיסים בערך 125 הבסיסים ומתחת לסימן הסולם של 400 זוגות הבסיסים. נקבו את החלק התחתון של צינור 0.65 מיליליטר באמצעות מחט בעלת 22 מדים והניחו את הצינור המנוקב בתוך צינור מיקרופוג' סטרילי דו-מיליליטר סטרילי. מעבירים את פרוסת הג'ל לצינור המנוקב בתוך צינור המיקרופוג' הדו-מיליליטר.צנטריפוגה צינור מיקרופוגה דו-מיליליטר המכיל את הצינור המנוקב 0.65-מיליליטר ודגימה בטמפרטורה של 10, 000 פעמים גרם בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות כדי לאסוף את סלרי הג'ל בתוך צינור המיקרופוגה של שני מיליליטר. הוסיפו 300 מיקרוליטרים של חיץ אלוטיון ג'ל קר כקרח לג'ל. יש לערבב על מאגוז בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות לפחות או למשך הלילה.מעבירים את כל הנוזלים והג'לים לעמוד מסנן של 0.22 מיקרומטר וצנטריפוגה ב-10, 000 גרם פעמים בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. הורד את קוד המקור לניתוח CUT&RUN מהדף GitHub על ידי לחיצה על כפתור הקוד הירוק, ואחריו אפשרות הורדת ZIP. פתח את התיקיה למיקום רלוונטי במחשב המקומי.התקן את סביבת Conda והפעל רק פעם אחת. לאחר התקנת Conda, צור סביבה וירטואלית המסופקת עם הפקודה הרלוונטית. הפעל את הסביבה הווירטואלית בכל פעם שזרימת עבודה זו מופעלת.עיכול דופן התא והשלמות הגרעינית הוערכו על ידי הדמיה הן של תאי בקרה שלמים והן של גרעינים מבודדים המוכתמים בדופן התא הפלואורסצנטי ובכתמי חומצות גרעין. בניגוד לגרעינים השלמים המבודדים שבהם לא נצפה צביעה על דופן התא, הן הגרעינים והן דפנות התא מסומנים באופן פלואורסצנטי בתאי הבקרה השלמים. האיור מראה ספריות CUT&RUN TF שנותחו באמצעות מכשיר אלקטרופורזה נימי.ספריות TF מוצלחות של CUT&RUN מועשרות עבור שברים קצרים הקטנים מ-200 זוגות בסיסים. ספריות TF לא אופטימליות של CUT&RUN מראות העשרה עבור שברי דנ"א גדולים. האיור כאן מראה כי מוטיבים קושרי דנ"א Ndt80 מועשרים בכל הלוקוסים הקשורים ל-Ndt80 שזוהו על ידי CUT&RUN, מה שמצביע על כך שהפסגות הנוספות שזוהו על ידי מתודולוגיה זו הן ככל הנראה אתרים הקשורים ל-Ndt80.ניתוח השוואתי הצביע על כך שפרוטוקול CUT&RUN זיהה את רוב אירועי הקישור הידועים בעבר עבור Ndt80 ו- Efg1 במהלך היווצרות ביופילם. באופן כללי, גם Ndt80 וגם Efg1 קשורים לחפיפה עם נתוני ChIP של משקעים חיסוניים של כרומטין שפורסמו בעבר ומזוהים רק באמצעות CUT&RUN. זה מאפשר לנו להגדיל באופן משמעותי את ההיקף והקצב של המחקר שלנו המתמקד ברשתות רגולטוריות שעתוק ובלקנדידה אלביקנים.

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&amp;RUN Method and Data Analysis Workflow

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

הגנום כולו ניתוח (טעינה) רמות Aminoacylation של tRNA שימוש microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

הגנום כולו ניתוח באמצעות שבב זיהוי איזופורם ספציפי מטרות ג&#39;ין

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

כושר ניתוח כמותי של זרימת עבודה

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

אלגוריתם רומן ייס שינוי נקודות לניתוח הגנום רחב, של סוגי נתוני ChIPseq מגוונים

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

Polysome היפוך חלוק וניתוח של יונקי Translatomes בקנה מידת הגנום

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

מיפוי הגנום של תרופות-DNA בתאי אינטראקציות עם COSMIC (Crosslinking של מולקולות קטנות לבודד הכרומטין)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID-seq: מיפוי הגנום של אינטראקציות החלבון-DNA על ידי תפוקה גבוהה רצף של קטעי DNA-מפוגל אדנין

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Workflow השלם עבור ניתוח שלאחר translational שינויים היסטון שימוש מלמטה למעלה ספקטרומטריית מסה: מתוך הפקת היסטון כדי ניתוח נתונים

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

זרימת עבודה מקיפה עבור הביטוי מטא אנליזה ATL E3 אוביקוויטין ליגאז ג'ין משפחת גפן וזיהוי הגנום כולו

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...