Name: genome-wide profiling of transcription factor-dna binding interactions in candida albicans: a comprehensive cut&amp;run method and data analysis workflow
Uploaded: 2022-04-01T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow at JoVE.

हम पांडुलिपि पर प्रतिक्रिया के लिए नोबिल और हर्नडे प्रयोगशालाओं के सभी पिछले और वर्तमान सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज (एनआईजीएमएस) पुरस्कार संख्या R35GM124594 और कामंगर परिवार द्वारा सीजेएन के लिए एक संपन्न कुर्सी के रूप में समर्थित किया गया था। इस काम को एनआईएच नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एलर्जी एंड इंफेक्शियस डिजीज (NIAID) पुरस्कार संख्या R15AI137975 द्वारा A.D.H.C.L.E. द्वारा भी समर्थित किया गया था, जिसे NIH नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डेंटल एंड क्रैनियोफेशियल रिसर्च (NIDCR) फेलोशिप नंबर F31DE028488 द्वारा समर्थित किया गया था। सामग्री लेखकों की एकमात्र जिम्मेदारी है और फंडर्स के विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करती है। अध्ययन के डिजाइन में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी; डेटा के संग्रह, विश्लेषण, या व्याख्या में; पांडुलिपि के लेखन में; या परिणामों को प्रकाशित करने के निर्णय में।

1. सी albicans उपभेदों के एपिटोप टैगिंग
<ol><li>कैंडिडा जीनोम डेटाबेस से प्राइमर डिजाइन टूल तक अपने 1 केबी अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम फ्लैंकिंग अनुक्रमों के साथ ब्याज के जीन को अपलोड करें (सामग्री ...

<ol>
	<li>Gulati, M., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms:+development,+regulation,+and+molecular+mechanisms.">Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms.</a> Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).</li><li>Lohse, M. B., Gulati, M., Johnson, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regulation+of+single-and+multi-species+Candida+albicans+biofilms.">Development and regulation of single-and multi-species Candida albicans biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 19-31 (2018).</li><li>Nobile, C. J., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms+and+human+disease.">Candida albicans biofilms and human disease.</a> Annual Review of Microbiology. 69 (1), 71-92 (2015).</li><li>Nobile, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recently+evolved+transcriptional+network+controls+biofilm+development+in+Candida+albicans.">A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans.</a> Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).</li><li>Iracane, E., Vega-Est&#233;vez, S., Buscaino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+and+off:+epigenetic+regulation+of+C.+albicans+morphological+switches.">On and off: epigenetic regulation of C. albicans morphological switches.</a> Pathogens. 10 (11), 1463 (2021).</li><li>Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Hernday, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+chromatin+accessibility+in+regulating+the+Candida+albicans+white-opaque+phenotypic+switch.">The roles of chromatin accessibility in regulating the Candida albicans white-opaque phenotypic switch.</a> Journal of Fungi. 7 (1), 37 (2021).</li><li>Mancera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+complex+transcription+network+controlling+biofilm+formation+in+candida+species.">Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in candida species.</a> eLife. 10, 64682 (2021).</li><li>Lohse, M. B., Johnson, A. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIC+and+ChEC:+Genomic+mapping+of+chromatin+proteins.">ChIC and ChEC: Genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856 (2017).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+in+situ+genome-wide+profiling+with+high+efficiency+for+low+cell+numbers.">Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers.</a> Nature Protocols. 13 (5), 1006-1019 (2018).</li><li>Nguyen, N., Quail, M. M. F., Hernday, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient,+rapid,+and+recyclable+system+for+CRISPR-mediated+genome+editing+in+Candida+albicans.">An efficient, rapid, and recyclable system for CRISPR-mediated genome editing in Candida albicans.</a> American Society For Microbiology. 2 (2), 00149 (2017).</li><li>Ennis, C. L., Hernday, A. D., Nobile, C. 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S., Karolchik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BigWig+and+BigBed:+enabling+browsing+of+large+distributed+datasets.">BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets.</a> Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).</li><li>Homann, O. R., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MochiView:+Versatile+software+for+genome+browsing+and+DNA+motif+analysis.">MochiView: Versatile software for genome browsing and DNA motif analysis.</a> BMC Biology. 8, 49 (2010).</li><li>Hainer, S. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+chromatin+profiling+using+CUT&amp;RUN.">High-resolution chromatin profiling using CUT&amp;RUN.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Rodriguez, D. L., Quail, M. M., Hernday, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+circuits+regulating+developmental+processes+in+Candida+albicans.">Transcriptional circuits regulating developmental processes in Candida albicans.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 605711 (2020).</li><li>Zhu, Q., Liu, N., Orkin, S. H., Yuan, G. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;amp;RUNTools:+a+flexible+pipeline+for+CUT&amp;amp;RUN+processing+and+footprint+analysis.">CUT&amp;amp;RUNTools: a flexible pipeline for CUT&amp;amp;RUN processing and footprint analysis.</a> Genome Biology. 20 (1), 192 (2019).</li><li>Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+expressed+loci+are+vulnerable+to+misleading+ChIP+localization+of+multiple+unrelated+proteins.">Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18602-18607 (2013).</li></ol>

यह प्रोटोकॉल सी अल्बिकन्स में नियामक टीएफ के जीनोम-वाइड स्थानीयकरण के लिए एक व्यापक प्रयोगात्मक और कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन प्रस्तुत करता है। यह मानक माइक्रोबायोलॉजी और आणविक जीव विज्ञान प्रशिक्?...

Candida albicans एक चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक, बहुरूपी मानव कवक रोगज़नक़ है जो विकास के विभिन्न तरीकों की एक किस्म में मौजूद है, जैसे कि विकास के प्लवक (मुक्त-फ्लोटिंग) मोड और एक बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स द्वारा संरक्षित कसकर पालन की गई कोशिकाओं के समुदायों के रूप में, जिसे विकास के बायोफिल्म मोड के रूप में जाना जाताहै 1,2,3। अन्य विकासात्मक और सेलुलर प्रक्रियाओं के समान, बायोफिल्म विकास एक महत्वपूर्ण सी एल्बिकन्स वायरस विशेषता है जिसे नियामक प्रतिलेखन कारकों (टीएफ) द्वारा ट्रांसक्रिप्शनल स्तर पर नियंत्रित करने के लिए जाना जाता है जो डीएनए को अनुक्रम-विशिष्ट तरीके सेबांधते हैं। हाल ही में, क्रोमैटिन नियामकों और हिस्टोन संशोधक भी डीएनए पहुंच की मध्यस्थता करके सी अल्बिकन्स बायोफिल्म गठन5 और मॉर्फोजेनेसिस6 के महत्वपूर्ण नियामकों के रूप में उभरे हैं। इस महत्वपूर्ण कवक रोगज़नक़ के जटिल जीव विज्ञान को समझने के लिए, अलग-अलग विकासात्मक और सेलुलर प्रक्रियाओं के दौरान विशिष्ट टीएफ के जीनोम-वाइड स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए प्रभावी तरीके मूल्यवान हैं।
क्रोमैटिन immunoprecipitation अनुक्रमण (CHIP-seq) के बाद सी एल्बिकन्स 5,6 में प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन की जांच करने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है और काफी हद तक माइक्रोएरे (CHIP-chip) 9 विधि के बाद अधिक शास्त्रीय क्रोमैटिन immunoprecipitation को बदल दिया है। हालांकि, CHIP-seq और CHIP-chip विधियों दोनों को बड़ी संख्या में इनपुट कोशिकाओं10 की आवश्यकता होती है, जो विशिष्ट नमूनों और विकास के तरीकों के संदर्भ में TFs की जांच करते समय एक जटिल कारक हो सकता है, जैसे कि रोगियों या संक्रमण के पशु मॉडल से एकत्र किए गए बायोफिल्म्स। इसके अलावा, क्रोमैटिन immunoprecipitation (CHIP) परख अक्सर जीनोम भर में पृष्ठभूमि संकेत की एक महत्वपूर्ण राशि उपज, ब्याज के लक्ष्य के लिए संवर्धन के एक उच्च स्तर की आवश्यकता के लिए पर्याप्त रूप से शोर से संकेत अलग करने के लिए. जबकि CHIP-चिप परख काफी हद तक आज पुरानी है, CHIP-seq के लिए आवश्यक अनुक्रमण गहराई इस परख कई शोधकर्ताओं के लिए निषेधात्मक रूप से महंगा बनाते हैं, विशेष रूप से कई TFs और / या क्रोमैटिन से जुड़े प्रोटीन का अध्ययन करने वाले।

लक्ष्य के तहत दरार और न्यूक्लिएज (CUT&RUN) का उपयोग करके रिलीज CHIP-seq के लिए एक आकर्षक विकल्प है। इसे 2017 में हेनिकॉफ लैब द्वारा CHIP-seq और क्रोमैटिन अंतर्जात दरार की सीमाओं को दरकिनार करने के लिए विकसित किया गया था, जिसके बाद ChEC-seq11,12 अनुक्रमण किया गया था, जीनोम-वाइड स्तर पर प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन की पहचान करने का एक और तरीका, जबकि टीएफ और क्रोमैटिन से जुड़े प्रोटीन13 के उच्च-रिज़ॉल्यूशन, जीनोम-वाइड मैपिंग प्रदान करते हुए . CUT&RUN टेदर किए गए माइक्रोकोकल न्यूक्लिएज का उपयोग करके परमेबिलाइज्ड नाभिक के भीतर क्रोमेटिन के लक्षित पाचन पर निर्भर करता है, जिसके बाद पचे हुए डीएनए टुकड़े 9,10 का अनुक्रमण होता है। जैसा कि डीएनए टुकड़े विशेष रूप से लोकी पर उत्पन्न होते हैं जो ब्याज के प्रोटीन से बंधे होते हैं, बजाय इसके कि CHIP assays के रूप में यादृच्छिक विखंडन के माध्यम से पूरे जीनोम में उत्पन्न होने के बजाय, CUT & RUN दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप पृष्ठभूमि संकेतों में बहुत कम हो जाता है और इस प्रकार, CHIP-seq 11,13 की तुलना में अनुक्रमण गहराई के1/10 वें भाग की आवश्यकता होती है, १४ । ये सुधार अंततः अनुक्रमण लागत में महत्वपूर्ण कटौती और प्रत्येक नमूने के लिए प्रारंभिक सामग्री के रूप में आवश्यक इनपुट कोशिकाओं की कुल संख्या में कटौती का कारण बनते हैं।
यहां, एक मजबूत कट एंड रन प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है जिसे बायोफिल्म्स और प्लवक संस्कृतियों से अलग सी अल्बिकन्स कोशिकाओं में टीएफ के जीनोम-वाइड स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए अनुकूलित और अनुकूलित किया गया है। एक संपूर्ण डेटा विश्लेषण पाइपलाइन भी प्रस्तुत की जाती है, जो परिणामी अनुक्रम डेटा के प्रसंस्करण और विश्लेषण को सक्षम बनाती है और उपयोगकर्ताओं को कोडिंग या जैव सूचना विज्ञान में न्यूनतम विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल टीएफ-कोडिंग जीन की एपिटोप टैगिंग, बायोफिल्म और प्लवक कोशिकाओं की कटाई, बरकरार परमेबिलाइज्ड नाभिक के अलगाव, विशिष्ट प्रोटीन या एपिटोप-टैग किए गए प्रोटीन के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन, प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए चिमेरिक ए / जी-माइक्रोकोकल न्यूक्लिएज (पीएजी-एमएनेज) संलयन प्रोटीन के टेदरिंग, क्रोमैटिन पाचन के बाद जीनोमिक डीएनए वसूली, और अनुक्रमण के लिए जीनोमिक डीएनए पुस्तकालयों की तैयारी का वर्णन करता है।
प्रयोगात्मक CUT &RUN प्रोटोकॉल का पालन एक उद्देश्य-निर्मित डेटा विश्लेषण पाइपलाइन द्वारा किया जाता है, जो FASTQ प्रारूप में कच्चे डीएनए अनुक्रमण पढ़ता है और ब्याज के टीएफ (प्राथमिक एंटीबॉडी द्वारा लक्षित) द्वारा बाध्य काफी समृद्ध लोकी की पूरी सूची प्रदान करने के लिए सभी आवश्यक प्रसंस्करण चरणों को लागू करता है। ध्यान दें कि वर्णित लाइब्रेरी तैयारी प्रोटोकॉल के कई चरणों को विशेष रूप से अनुकूलित किया गया है और टीएफ के कट एंड रन विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया गया है (जैसा कि न्यूक्लियोसोम के विपरीत)। जबकि इस पांडुलिपि में प्रस्तुत डेटा एक वाणिज्यिक CUT & RUN किट के TF-विशिष्ट अनुकूलन का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था, इन प्रोटोकॉल को व्यक्तिगत रूप से सोर्स किए गए घटकों (यानी, pAG-MNase एंजाइम और चुंबकीय डीएनए शुद्धिकरण मोती) और इन-हाउस-तैयार बफर का उपयोग करके भी मान्य किया गया है, जो प्रयोगात्मक लागत को काफी कम कर सकते हैं। व्यापक प्रयोगात्मक और डेटा विश्लेषण प्रोटोकॉल को चरण-दर-चरण प्रारूप में नीचे विस्तार से वर्णित किया गया है। सभी अभिकर्मकों और महत्वपूर्ण उपकरणों, साथ ही बफर और मीडिया व्यंजनों, क्रमशः सामग्री और पूरक फ़ाइल 1 की तालिका में सूचीबद्ध हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGPM33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.65 mL low-adhesion tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490003-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-152-341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M PIPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ61224AK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well untreated cell culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Digitonin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CHR103MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x phusion HF buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as &#34;DNA polymerase buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP magnetic beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;capillary electrophoresis instrument&#34;; user-dependepent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89133-910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchling primer design tool</td>
			<td>Benchling</td>
			<td></td>
			<td>https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as &#34;the primer design tool&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ77507AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor white stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida Genome Database</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.candidagenome.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>&#160;86057-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conda software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curl tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ 
			chromosomes.fasta.gz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUTANA ChIC/CUT&#38;RUN kit</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>14-1048</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;the CUT&#38;RUN kit&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco D-mannitol</td>
			<td>&#160;BD Biosciences</td>
			<td>217020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Loading Dye (6x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq green DNA polymerase</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>EP0713</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;cPCR DNA polymerase&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq green DNA polymerase buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>EP0713</td>
			<td>Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as &#34;cPCR DNA polymerase buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli spike-in DNA</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>18-1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELMI Microplate incubator</td>
			<td>ELMI</td>
			<td>TRMS-04</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;microplate incubator&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End Prep Enzyme Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End Prep Reaction Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest MssI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FD1344</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;restriction enzyme&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest MssI Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FD1344</td>
			<td>Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as &#34;restriction enzyme buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP525-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler low range DNA ladder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FERSM1192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GitBash workflow</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://gitforwindows.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GitHub source code</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-KOH pH 7.5</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BBH-75-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PX1830-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52846-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Enhancer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate dihydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>215525683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody</td>
			<td>Takara</td>
			<td>632592</td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://pypi.org/project/MACS2/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>10-0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate and cuvette spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>EPOCH2TC</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;spectrophotometer&#34;; user-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MochiView</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCBI GEO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Adaptor for Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as &#34;Adapter&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Index X Primer for Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as &#34;Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;library prep kit&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Universal PCR Primer for Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as &#34;Universal Forward Library Amplification Primer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin sulfate (NAT)</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>N-500-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex TBE Gels, 10%, 15 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>EC62755BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient broth</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C6471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH110</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90982</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90982&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH119</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90985</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90985&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH137</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90986</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90986&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH139</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90987</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90987&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH140</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90988</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90988&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG-MNase</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>15-1016 or 15-1116</td>
			<td>50 rxn or 250 rxn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCE1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>174434</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 174434&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes with clear lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion high fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;DNA polymerase&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 3350</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10791-816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x dsDNA HS assay kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;fluorometer&#34;; user-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG negative control antibody</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>13-0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109169001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M12820004</td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile inoculating loops</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30002-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO 13 nucleic acid stain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S7575</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;nucleic acid gel stain&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252859-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra II Ligation Master Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as &#34;Ligation Master Mix&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra II Q5 Master Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as &#34;High Fidelity DNA Polymerase Master Mix &#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure salmon sperm DNA solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER Enzyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as &#34;Uracil Excision Enzyme&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wget tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ 
			chromosomes.fasta.gz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C7341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0439194</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide profiling of transcription factor-dna binding interactions in candida albicans: a comprehensive cut&amp;run method and data analysis workflow

नियामक प्रतिलेखन कारक कई महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करते हैं, जिनमें सेलुलर भेदभाव, पर्यावरणीय गड़बड़ी और तनावों की प्रतिक्रियाएं, और मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन शामिल हैं। डीएनए के लिए नियामक प्रतिलेखन कारकों के जीनोम-वाइड बाइंडिंग का निर्धारण इन अक्सर जटिल जैविक प्रक्रियाओं में प्रतिलेखन कारकों के कार्य को समझने के लिए आवश्यक है। लक्ष्य के तहत दरार और न्यूक्लिएज (CUT&RUN) का उपयोग करके रिलीज विवो प्रोटीन-डीएनए बाइंडिंग इंटरैक्शन के जीनोम-वाइड मैपिंग के लिए एक आधुनिक विधि है जो पारंपरिक और व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले क्रोमैटिन इम्यूनोप्रिसिपिटेशन के लिए एक आकर्षक विकल्प है, जिसके बाद अनुक्रमण (CHIP-seq) विधि है। CUT&RUN एक उच्च-थ्रूपुट प्रयोगात्मक सेटअप के लिए उपयुक्त है और इसमें CHIP-seq की तुलना में कम प्रति-नमूना अनुक्रमण लागत के साथ काफी अधिक गतिशील सीमा है। यहां, मानव कवक रोगज़नक़ कैंडिडा अल्बिकन्स में प्रतिलेखन कारक-डीएनए बाध्यकारी इंटरैक्शन के जीनोम-वाइड विश्लेषण के लिए एक व्यापक CUT &RUN प्रोटोकॉल और साथ डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो का वर्णन किया गया है। इस विस्तृत प्रोटोकॉल में सभी आवश्यक प्रयोगात्मक प्रक्रियाएं शामिल हैं, प्रतिलेखन कारक-कोडिंग जीन के एपिटोप टैगिंग से लेकर अनुक्रमण के लिए पुस्तकालय की तैयारी तक; इसके अतिरिक्त, इसमें CUT&RUN डेटा विश्लेषण के लिए एक अनुकूलित कम्प्यूटेशनल वर्कफ़्लो शामिल है.

इस मजबूत CUT & RUN प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया था और C. albicans biofilms और प्लवक संस्कृतियों में विशिष्ट TFs के जीनोम-वाइड स्थानीयकरण की जांच के लिए अनुकूलित किया गया था (प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के अवलोकन के लिए <strong ...

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Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow

यह प्रोटोकॉल लक्ष्य के तहत दरार के लिए एक प्रयोगात्मक विधि और डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो का वर्णन करता है और मानव कवक रोगज़नक़ कैंडिडा अल्बिकन्स में न्यूक्लिएज (CUT &RUN) का उपयोग करके जारी करता है।

Candida albicans में प्रतिलेखन कारक-डीएनए बाइंडिंग इंटरैक्शन की जीनोम-वाइड प्रोफाइलिंग: एक व्यापक CUT&amp;RUN विधि और डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो

Regulatory transcription factors control many important biological processes, including cellular differentiation, responses to environmental perturbations ...

यह प्रोटोकॉल सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का विवरण देता है, कम्प्यूटेशनल डेटा विश्लेषण के माध्यम से प्रतिलेखन कारक कोडिंग जीन के एपिटोप टैगिंग से, कट एंड रन के माध्यम से कैंडिडा अल्बिकन्स में प्रतिलेखन कारक-डीएनए बाध्यकारी इंटरैक्शन के जीनोम-वाइड प्रोफाइलिंग करने के लिए। यह एक अधिक सुलभ, तेज, अधिक संवेदनशील, कम महंगी तकनीक है, और पारंपरिक CHIP-चिप और CHIP-seq दृष्टिकोण की तुलना में उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्रदान करता है। यद्यपि हमारा प्रोटोकॉल बायोफिल्म्स या प्लवक संस्कृतियों से अलग कैंडिडा अल्बिकन्स कोशिकाओं के लिए विकसित किया गया है, लेकिन इसे कैंडिडा अल्बिकन्स कोशिकाओं के लगभग किसी भी अच्छे रूप में अनुकूलित करना व्यावहारिक होना चाहिए।सेल निलंबन को इनक्यूबेट करने के बाद, एक नए पीसीआर ट्यूब में एक पांच-माइक्रोलीटर एलीकोट स्थानांतरित करें। अलग-थलग नाभिक के पांच माइक्रोलीटर और अक्षुण्ण कोशिकाओं के पांच-माइक्रोलीटर एलीकोट को पहले चार डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने के लिए, कैलकोफ्लोर-व्हाइट और एसवाईटीओ 13 में से प्रत्येक में एक माइक्रोलीटर जोड़ें। 30 मिनट के लिए अंधेरे में 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।नेत्रहीन एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके पृथक नाभिक की अखंडता और शुद्धता का निरीक्षण करें। प्रमुख SYTO 13 धुंधला दिखाने वाले पृथक नाभिक की तलाश करें और यह सुनिश्चित करें कि कैलकोफ्लोर-सफेद डाई द्वारा कोई सेल दीवार धुंधला न हो। कैल्कोफ्लोर-सफेद डाई के साथ सेल दीवार दाग के लिए एक नियंत्रण के रूप में बरकरार कोशिकाओं के साथ निरीक्षण को दोहराएं।एक चुंबकीय रैक पर ट्यूबों जगह और जब तक घोल पूरी तरह से स्पष्ट है प्रतीक्षा करें. एक पिपेट का उपयोग करके supernatant को छोड़ दें। एंटीबॉडी बफर के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें और धीरे से pipetting द्वारा मिश्रण.ट्यूबों के लिए विरोधी GFP polyclonal एंटीबॉडी के तीन microliters जोड़ें और दो घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक nutating मिक्सर पर ट्यूबों को इनक्यूबेट। संक्षेप में पांच सेकंड के लिए कमरे के तापमान पर 100 बार जी पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें और ट्यूबों को चुंबकीय रैक पर रखें। एक बार घोल स्पष्ट होने के बाद, एक पिपेट का उपयोग करके supernatant को छोड़ दें।जबकि मोतियों के साथ ट्यूब अभी भी चुंबकीय रैक पर हैं, बर्फ-ठंडे सेल permeabilization बफर के 200 माइक्रोलीटर सीधे मोतियों पर जोड़ें। एक पिपेट का उपयोग करके supernatant को छोड़ दें। बर्फ-ठंडे सेल permeabilization बफर के साथ दो washes दोहराएँ।प्रत्येक ट्यूब के लिए बर्फ-ठंडे सेल permeabilization बफर के 50 microliters जोड़ें और धीरे pipetting द्वारा मिश्रण. प्रत्येक नमूने के लिए प्रोटीन एजी-MNase के 2.5 माइक्रोलीटर जोड़ें और pipetting द्वारा मिश्रण। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक nutating मिक्सर पर नमूनों को रखें और एक घंटे के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें।संक्षेप में पांच सेकंड के लिए कमरे के तापमान पर 100 बार जी पर पट्टी ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें, फिर ट्यूबों को चुंबकीय रैक पर रखें। एक बार घोल स्पष्ट होने के बाद, एक पिपेट का उपयोग करके supernatant को छोड़ दें। जबकि मोतियों के साथ ट्यूब अभी भी चुंबकीय रैक पर हैं, बर्फ-ठंडे सेल permeabilization बफर के 200 माइक्रोलीटर सीधे मोतियों पर जोड़ें।एक पिपेट का उपयोग करके supernatant को छोड़ दें। बर्फ-ठंडे सेल permeabilization बफर के साथ दो washes दोहराएँ। नमूनों के लिए बर्फ-ठंडे सेल permeabilization बफर के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और धीरे से पिपेट ऊपर और नीचे पांच बार।जेल बॉक्स से जेल कास्ट निकालें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार जेल कास्ट खोलें। धीरे से जेल कास्ट से जेल को हटा दें और इसे एक जेल-होल्डिंग ट्रे के अंदर रखें जिसमें एकल-शक्ति टीबीई के 100 मिलीलीटर होते हैं। ट्रे में न्यूक्लिक एसिड जेल दाग के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें और धीरे से घुमाएं।प्रकाश से बचाने के लिए पन्नी के साथ कवर करें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्थैतिक रूप से इनक्यूबेट करें। फिर जेल को 100 मिलीलीटर विआयनीकृत नल के पानी के साथ दो बार कुल्ला करें। एक एम्बर फिल्टर कवर का उपयोग कर नीली रोशनी रोशनी के तहत जेल छवि.प्रत्येक पुस्तकालय के लिए, जेल को लगभग 125 बेस जोड़ी प्रमुख एडाप्टर डिमर बैंड के ऊपर और 400 बेस जोड़ी सीढ़ी चिह्न के नीचे थोड़ा ऊपर काटें। एक 22-गेज सुई का उपयोग करके एक 0.65-मिलीलीटर ट्यूब के नीचे पंचर करें और एक बाँझ दो-मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूब के अंदर पंचर ट्यूब रखें। जेल स्लाइस को दो-मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूब के अंदर पंचर ट्यूब में स्थानांतरित करें।दो-मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें जिसमें 0.65-मिलीलीटर पंचर ट्यूब होती है और दो-मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूब के अंदर जेल घोल को इकट्ठा करने के लिए दो मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 10, 000 बार ग्राम पर नमूना होता है। जेल घोल के लिए बर्फ ठंडा जेल क्षालन बफर के 300 microliters जोड़ें. कम से कम तीन घंटे या रात भर के लिए कमरे के तापमान पर एक nutator पर मिश्रण।एक मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 10, 000 बार जी पर एक 0.22 माइक्रोमीटर फिल्टर कॉलम और सेंट्रीफ्यूज करने के लिए सभी तरल और जेल घोल स्थानांतरित करें। हरे रंग के कोड बटन पर क्लिक करके GitHub पृष्ठ से CUT&RUN विश्लेषण के लिए स्रोत कोड डाउनलोड करें, इसके बाद डाउनलोड ज़िप विकल्प। फ़ोल्डर को स्थानीय मशीन पर किसी प्रासंगिक स्थान पर अनज़िप करें.कोंडा पर्यावरण स्थापित करें और केवल एक बार चलाएँ। एक बार कोंडा स्थापित हो जाने के बाद, प्रासंगिक कमांड के साथ प्रदान किया गया एक आभासी वातावरण बनाएं। हर बार जब यह वर्कफ़्लो निष्पादित किया जाता है तो वर्चुअल वातावरण को सक्रिय करें.सेल की दीवार पाचन और परमाणु अखंडता का मूल्यांकन दोनों नियंत्रण बरकरार कोशिकाओं और अलग-अलग नाभिक को फ्लोरोसेंट सेल की दीवार और न्यूक्लिक एसिड दाग के साथ दागकर किया गया था। पृथक अक्षुण्ण नाभिक के विपरीत जहां सेल की दीवार धुंधला नहीं देखी जाती है, नाभिक और सेल दीवारों दोनों को बरकरार नियंत्रण कोशिकाओं में फ्लोरोसेंटली लेबल किया जाता है। आंकड़ा CUT &RUN TF पुस्तकालयों को एक केशिका वैद्युतकणसंचलन उपकरण का उपयोग करके विश्लेषण से पता चलता है।सफल CUT&RUN TF पुस्तकालयों को 200 आधार जोड़े से छोटे टुकड़ों के लिए समृद्ध किया जाता है। सबऑप्टिमल कट एंड रन टीएफ पुस्तकालय बड़े डीएनए टुकड़ों के लिए संवर्धन दिखाते हैं। यहां दिए गए आंकड़े से पता चलता है कि Ndt80 डीएनए-बाइंडिंग रूपांकनों को CUT & RUN द्वारा पहचाने गए सभी Ndt80-बाउंड लोकी में समृद्ध किया जाता है, यह दर्शाता है कि इस पद्धति द्वारा पहचानी गई अतिरिक्त चोटियों की संभावना बोनाफाइड Ndt80-बाउंड साइटें हैं।तुलनात्मक विश्लेषण ने संकेत दिया कि CUT &RUN प्रोटोकॉल ने बायोफिल्म गठन के दौरान Ndt80 और Efg1 के लिए पहले से ज्ञात अधिकांश बाध्यकारी घटनाओं की पहचान की। कुल मिलाकर, Ndt80 और Efg1 दोनों पहले प्रकाशित क्रोमैटिन प्रतिरक्षा वर्षा CHIP डेटा के साथ लोकी ओवरलैप करने के लिए बाध्य हैं और केवल CUT & RUN का उपयोग करके पहचाने जाते हैं। यह हमें ट्रांसक्रिप्शनल नियामक नेटवर्क और कैंडिडा अल्बिकन्स पर केंद्रित हमारे शोध के दायरे और गति को काफी बढ़ाने में सक्षम बनाता है।

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&amp;RUN Method and Data Analysis Workflow

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

जीनोम चौड़ा Aminoacylation tRNA (चार्ज) स्तर प्रोटीन का उपयोग का विश्लेषण

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

जीनोम चौड़ा चिप का उपयोग isoform विशेष जीन लक्ष्य पहचानें विश्लेषण

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

एक मात्रात्मक स्वास्थ्य विश्लेषण कार्यप्रवाह

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

विविध ChIPseq डेटा प्रकार के एक उपन्यास Bayesian बदलें बिंदु जीनोम चौड़ा विश्लेषण के लिए एल्गोरिथ्म

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

एक जीनोम व्यापक पैमाने पर Polysome Fractionation और स्तनधारी Translatomes का विश्लेषण

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

लौकिक के साथ कोशिकाओं में ड्रग-डीएनए सहभागिता के जीनोम चौड़ा मानचित्रण (छोटे अणुओं की crosslinking Chromatin को अलग करने के लिए)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID-सेक: Adenine-methylated डीएनए टुकड़े के उच्च throughput अनुक्रमण द्वारा प्रोटीन डीएनए सहभागिता के जीनोम चौड़ा मानचित्रण

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Histone बाद translational संशोधनों के विश्लेषण के लिए पूरा कार्यप्रवाह नीचे अप मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग: Histone निकासी से डेटा विश्लेषण करने के लिए

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

जीनोम-वाइड पहचान और अभिव्यक्ति मेटा-विश्लेषण के लिए व्यापक कार्यप्रवाह ATL E3 के Ubiquitin Ligase जीन परिवार में चर्चा

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...