Name: genome-wide profiling of transcription factor-dna binding interactions in candida albicans: a comprehensive cut&amp;run method and data analysis workflow
Uploaded: 2022-04-01T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow at JoVE.

원고에 대한 피드백에 대해 Nobile 및 Hernday 연구소의 과거와 현재의 모든 회원들에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 (NIH) 국립 일반 의료 과학 연구소 (NIGMS) 상 번호 R35GM124594와 C.J.N.에 부여 된 의자의 형태로 Kamangar 가족에 의해 지원되었습니다. 이 연구는 또한 NIH 국립 알레르기 및 전염병 연구소 (NIAID) 상 번호 R15AI137975 A.D.H.L.E.에 의해 지원되었.C NIH 국립 치과 및 두개골 안면 연구 연구소 (NIDCR) 펠로우십 번호 F31DE028488에 의해 지원되었습니다. 내용은 저자의 전적인 책임이며 자금 제공자의 견해를 대표하지 않습니다. 기금 제공자는 연구 설계에 아무런 역할을하지 못했습니다. 데이터의 수집, 분석 또는 해석에서; 원고의 쓰기에; 또는 결과를 게시하기로 결정했습니다.

1. C. 알비칸 균주의 에피토프 태깅
<ol><li>1kb 상류 및 하류 플랭킹 서열과 함께 관심있는 유전자를 칸디다 게놈 데이터베이스에서 프라이머 설계 도구로 업로드하십시오 ( 자료 표 참조). 정지 코돈으로부터 50 bp 상류 및 하류를 강조하여 가이드 RNA (gRNA)를 설계하고, 오른쪽의 gRNA 선택 도구를 클릭하십시오. 안내선 설계 및 분석을 선...

<ol>
	<li>Gulati, M., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms:+development,+regulation,+and+molecular+mechanisms.">Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms.</a> Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).</li><li>Lohse, M. B., Gulati, M., Johnson, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regulation+of+single-and+multi-species+Candida+albicans+biofilms.">Development and regulation of single-and multi-species Candida albicans biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 19-31 (2018).</li><li>Nobile, C. J., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms+and+human+disease.">Candida albicans biofilms and human disease.</a> Annual Review of Microbiology. 69 (1), 71-92 (2015).</li><li>Nobile, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recently+evolved+transcriptional+network+controls+biofilm+development+in+Candida+albicans.">A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans.</a> Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).</li><li>Iracane, E., Vega-Est&#233;vez, S., Buscaino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+and+off:+epigenetic+regulation+of+C.+albicans+morphological+switches.">On and off: epigenetic regulation of C. albicans morphological switches.</a> Pathogens. 10 (11), 1463 (2021).</li><li>Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Hernday, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+chromatin+accessibility+in+regulating+the+Candida+albicans+white-opaque+phenotypic+switch.">The roles of chromatin accessibility in regulating the Candida albicans white-opaque phenotypic switch.</a> Journal of Fungi. 7 (1), 37 (2021).</li><li>Mancera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+complex+transcription+network+controlling+biofilm+formation+in+candida+species.">Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in candida species.</a> eLife. 10, 64682 (2021).</li><li>Lohse, M. B., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+Wor4,+a+new+transcriptional+regulator+of+white-opaque+switching.">Identification and characterization of Wor4, a new transcriptional regulator of white-opaque switching.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (3), 721-729 (2016).</li><li>Hernday, A. D., Noble, S. M., Mitrovich, Q. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+molecular+biology+in+Candida+albicans.">Genetics and molecular biology in Candida albicans.</a> Methods in Enzymology. 470, 737-758 (2010).</li><li>Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+and+microarray-based+analysis+of+protein+location.">Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location.</a> Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).</li><li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733 (2015).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIC+and+ChEC:+Genomic+mapping+of+chromatin+proteins.">ChIC and ChEC: Genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856 (2017).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+in+situ+genome-wide+profiling+with+high+efficiency+for+low+cell+numbers.">Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers.</a> Nature Protocols. 13 (5), 1006-1019 (2018).</li><li>Nguyen, N., Quail, M. M. F., Hernday, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient,+rapid,+and+recyclable+system+for+CRISPR-mediated+genome+editing+in+Candida+albicans.">An efficient, rapid, and recyclable system for CRISPR-mediated genome editing in Candida albicans.</a> American Society For Microbiology. 2 (2), 00149 (2017).</li><li>Ennis, C. L., Hernday, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+markerless+CRISPR-mediated+system+for+genome+editing+in+Candida+auris+reveals+a+conserved+role+for+Cas5+in+the+caspofungin+response.">A markerless CRISPR-mediated system for genome editing in Candida auris reveals a conserved role for Cas5 in the caspofungin response.</a> Microbiology Spectrum. 9 (3), 0182021 (2021).</li><li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+CUT&amp;RUN+chromatin+profiling+tools.">Improved CUT&amp;RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314 (2019).</li><li>Skrzypek, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Candida+Genome+Database+(CGD):+Incorporation+of+Assembly+22,+systematic+identifiers+and+visualization+of+high+throughput+sequencing+data.">The Candida Genome Database (CGD): Incorporation of Assembly 22, systematic identifiers and visualization of high throughput sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 45, 592-596 (2017).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li><li>Boyd, J., Rodriguez, P., Schjerven, H., Frietze, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ssvQC:+an+integrated+CUT&amp;RUN+quality+control+workflow+for+histone+modifications+and+transcription+factors.">ssvQC: an integrated CUT&amp;RUN quality control workflow for histone modifications and transcription factors.</a> BMC Research Notes. 14 (1), 366 (2021).</li><li>Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BigWig+and+BigBed:+enabling+browsing+of+large+distributed+datasets.">BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets.</a> Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).</li><li>Homann, O. R., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MochiView:+Versatile+software+for+genome+browsing+and+DNA+motif+analysis.">MochiView: Versatile software for genome browsing and DNA motif analysis.</a> BMC Biology. 8, 49 (2010).</li><li>Hainer, S. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+chromatin+profiling+using+CUT&amp;RUN.">High-resolution chromatin profiling using CUT&amp;RUN.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Rodriguez, D. L., Quail, M. M., Hernday, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+circuits+regulating+developmental+processes+in+Candida+albicans.">Transcriptional circuits regulating developmental processes in Candida albicans.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 605711 (2020).</li><li>Zhu, Q., Liu, N., Orkin, S. H., Yuan, G. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;amp;RUNTools:+a+flexible+pipeline+for+CUT&amp;amp;RUN+processing+and+footprint+analysis.">CUT&amp;amp;RUNTools: a flexible pipeline for CUT&amp;amp;RUN processing and footprint analysis.</a> Genome Biology. 20 (1), 192 (2019).</li><li>Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+expressed+loci+are+vulnerable+to+misleading+ChIP+localization+of+multiple+unrelated+proteins.">Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18602-18607 (2013).</li></ol>

이 프로토콜은 C. albicans에서 규제 TF의 게놈 전체 현지화를위한 포괄적 인 실험 및 계산 파이프 라인을 제공합니다. 표준 미생물학 및 분자 생물학 교육을받은 모든 사람이 쉽게 접근 할 수 있도록 설계되었습니다. CUT&RUN 분석의 높은 동적 범위와 낮은 시료 입력 요구 사항을 활용하고 C. 알비칸 생물막 및 플랑크톤 배양에서 TF-DNA 결합 상호작용의 국산화를 위한 최적화를 포함함으로?...

칸디다 알비칸스는 임상적으로 관련성이 있는, 다형성 인간 진균 병원체로서, 플랑크톤(free-floating) 성장 모드 및 세포외 매트릭스에 의해 보호되는 단단히 부착된 세포의 군집으로서 1,2,3의 생물막 성장 모드로 알려져 있다. 다른 발달 및 세포 과정과 유사하게, 생물막 개발은 서열 특이적 방식으로 DNA에 결합하는 조절 전사 인자 (TFs)에 의해 전사 수준에서 조절되는 것으로 알려진 중요한 C. 알비칸 독성 특성이다4. 최근에, 크로마틴 조절제 및 히스톤 개질제는 또한 DNA 접근성을 매개함으로써 C. 알비칸 생물막 형성5 및 형태형성6의 중요한 조절제로서 등장하였다. 이 중요한 곰팡이 병원체의 복잡한 생물학을 이해하기 위해, 뚜렷한 발달 및 세포 과정 동안 특정 TF의 게놈 전체 국소화를 결정하는 효과적인 방법이 중요합니다.
크로마틴 면역침전에 이어 시퀀싱(ChIP-seq)은 C. 알비칸5,6에서 단백질-DNA 상호작용을 조사하기 위해 널리 사용되는 방법이며, 마이크로어레이(ChIP-chip)9 방법에 이어 보다 고전적인 크로마틴 면역침전을 대체하고 있다. 그러나 ChIP-seq 및 ChIP-chip 방법 둘 다 많은 수의 입력 세포(10)를 필요로 하며, 이는 환자 또는 감염의 동물 모델로부터 수집된 생물막과 같은 특정 샘플 및 성장 모드의 맥락에서 TF를 조사할 때 복잡한 인자가 될 수 있다. 또한, 크로마틴 면역침전 (ChIP) 분석은 종종 게놈 전체에 걸쳐 상당한 양의 배경 신호를 산출하며, 관심있는 표적에 대해 높은 수준의 농축이 필요하여 신호를 노이즈로부터 충분히 분리한다. ChIP-chip 분석은 오늘날 대부분 구식이지만, ChIP-seq 에 필요한 시퀀싱 깊이는 많은 연구자, 특히 여러 TF 및 / 또는 크로마틴 관련 단백질을 연구하는 연구자에게이 분석을 엄청나게 비싸게 만듭니다.

표적 하에서의 절단 및 뉴클레아제 (CUT&RUN)를 이용한 방출은 ChIP-seq에 대한 매력적인 대안이다. 2017년 Henikoff 연구실에서 ChIP-seq 및 크로마틴 내인성 절단의 한계를 우회한 후 ChEC-seq 11,12를 시퀀싱하여 게놈 전체 수준에서 단백질-DNA 상호작용을 확인하는 또 다른 방법인 TF 및 크로마틴 관련 단백질의 고분해능, 게놈 전체 매핑을 제공하기 위해 개발되었다(13) . CUT&RUN은 테더링된 미세구균 핵을 사용하여 투과된 핵 내에서 크로마틴의 표적 소화에 의존하고, 이어서 소화된 DNA 단편 9,10의 시퀀싱에 의존한다. DNA 단편은 ChIP 분석에서와 같이 무작위 단편화를 통해 게놈 전체에 걸쳐 생성되기보다는 관심있는 단백질에 의해 결합되는 유전자좌에서 특이적으로 생성되기 때문에 CUT&RUN 접근법은 배경 신호를 크게 감소시키고, 따라서 ChIP-서열 11,13에 비해 시퀀싱 깊이의1/10 번째를 필요로 하며, 14. 이러한 개선은 궁극적으로 시퀀싱 비용을 크게 줄이고 각 샘플의 출발 물질로 필요한 총 입력 셀 수를 줄입니다.
여기에서, 생물막 및 플랑크톤 배양물로부터 분리된 C. 알비칸 세포에서 TFs의 게놈 전체 국소화를 결정하기 위해 적응되고 최적화된 강력한 CUT&RUN 프로토콜이 기술된다. 철저한 데이터 분석 파이프 라인도 제공되어 결과 시퀀스 데이터를 처리 및 분석 할 수 있으며 사용자는 코딩 또는 생물 정보학에 대한 최소한의 전문 지식을 필요로합니다. 간략하게, 이 프로토콜은 TF 코딩 유전자의 에피토프 태깅, 생물막 및 플랑크톤 세포의 수확, 무손상 투과화된 핵의 단리, 관심있는 특정 단백질 또는 에피토프 태깅된 단백질에 대한 일차 항체와의 인큐베이션, 키메라 A/G-마이크로코카셀 뉴클레아제(pAG-MNase) 융합 단백질을 일차 항체에 테더링, 염색질 소화 후 게놈 DNA 회수, 시퀀싱을 위한 게놈 DNA 라이브러리의 제조를 기술한다.
실험적 CUT&RUN 프로토콜은 FASTQ 형식으로 원시 DNA 시퀀싱 판독을 취하고 필요한 모든 처리 단계를 구현하여 관심 TF에 의해 결합된 상당히 풍부한 유전자좌의 전체 목록을 제공하는 특수 목적의 데이터 분석 파이프라인이 뒤따릅니다(기본 항체에 의해 표적화됨). 설명된 라이브러리 준비 프로토콜의 여러 단계는 TF의 CUT&RUN 분석을 위해 특별히 조정되고 최적화되었습니다(뉴클레오솜과는 반대). 이 원고에 제시된 데이터는 상용 CUT&RUN 키트의 TF 특이적 적응을 사용하여 생성되었지만, 이러한 프로토콜은 개별적으로 공급되는 성분(즉, pAG-MNase 효소 및 자기 DNA 정제 비드)과 사내에서 제조된 완충액을 사용하여 검증되었으며, 이는 실험 비용을 상당히 절감할 수 있다. 포괄적인 실험 및 데이터 분석 프로토콜은 아래에 단계별 형식으로 자세히 설명되어 있습니다. 버퍼 및 미디어 레시피뿐만 아니라 모든 시약 및 중요 장비는 각각 재료 표 및 보충 파일 1에 나열되어 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGPM33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.65 mL low-adhesion tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490003-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-152-341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M PIPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ61224AK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well untreated cell culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Digitonin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CHR103MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x phusion HF buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as &#34;DNA polymerase buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP magnetic beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;capillary electrophoresis instrument&#34;; user-dependepent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89133-910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchling primer design tool</td>
			<td>Benchling</td>
			<td></td>
			<td>https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as &#34;the primer design tool&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ77507AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor white stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida Genome Database</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.candidagenome.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>&#160;86057-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conda software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curl tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ 
			chromosomes.fasta.gz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUTANA ChIC/CUT&#38;RUN kit</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>14-1048</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;the CUT&#38;RUN kit&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco D-mannitol</td>
			<td>&#160;BD Biosciences</td>
			<td>217020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Loading Dye (6x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq green DNA polymerase</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>EP0713</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;cPCR DNA polymerase&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq green DNA polymerase buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>EP0713</td>
			<td>Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as &#34;cPCR DNA polymerase buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli spike-in DNA</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>18-1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELMI Microplate incubator</td>
			<td>ELMI</td>
			<td>TRMS-04</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;microplate incubator&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End Prep Enzyme Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End Prep Reaction Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest MssI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FD1344</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;restriction enzyme&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest MssI Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FD1344</td>
			<td>Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as &#34;restriction enzyme buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP525-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler low range DNA ladder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FERSM1192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GitBash workflow</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://gitforwindows.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GitHub source code</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-KOH pH 7.5</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BBH-75-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PX1830-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52846-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Enhancer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate dihydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>215525683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody</td>
			<td>Takara</td>
			<td>632592</td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://pypi.org/project/MACS2/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>10-0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate and cuvette spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>EPOCH2TC</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;spectrophotometer&#34;; user-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MochiView</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCBI GEO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Adaptor for Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as &#34;Adapter&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Index X Primer for Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as &#34;Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;library prep kit&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Universal PCR Primer for Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as &#34;Universal Forward Library Amplification Primer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin sulfate (NAT)</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>N-500-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex TBE Gels, 10%, 15 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>EC62755BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient broth</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C6471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH110</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90982</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90982&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH119</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90985</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90985&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH137</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90986</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90986&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH139</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90987</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90987&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH140</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90988</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90988&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG-MNase</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>15-1016 or 15-1116</td>
			<td>50 rxn or 250 rxn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCE1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>174434</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 174434&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes with clear lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion high fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;DNA polymerase&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 3350</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10791-816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x dsDNA HS assay kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;fluorometer&#34;; user-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG negative control antibody</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>13-0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109169001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M12820004</td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile inoculating loops</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30002-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO 13 nucleic acid stain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S7575</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;nucleic acid gel stain&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252859-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra II Ligation Master Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as &#34;Ligation Master Mix&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra II Q5 Master Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as &#34;High Fidelity DNA Polymerase Master Mix &#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure salmon sperm DNA solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER Enzyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as &#34;Uracil Excision Enzyme&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wget tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ 
			chromosomes.fasta.gz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C7341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0439194</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide profiling of transcription factor-dna binding interactions in candida albicans: a comprehensive cut&amp;run method and data analysis workflow

조절 전사 인자는 세포 분화, 환경 혼란 및 스트레스에 대한 반응, 숙주 - 병원체 상호 작용을 포함한 많은 중요한 생물학적 과정을 제어합니다. DNA에 대한 조절 전사 인자의 게놈 전체 결합을 결정하는 것은 이러한 종종 복잡한 생물학적 과정에서 전사 인자의 기능을 이해하는 데 필수적이다. 뉴클레아제 (CUT&RUN)를 이용한 표적 및 방출 하에서의 절단은 시퀀싱 (ChIP-seq) 방법에 이어 전통적이고 널리 사용되는 크로마틴 면역침전에 대한 매력적인 대안인 생체내 단백질-DNA 결합 상호작용의 게놈 전체 매핑을 위한 현대적인 방법이다. CUT&RUN은 더 높은 처리량의 실험 설정을 적용할 수 있으며 ChIP-seq보다 샘플당 시퀀싱 비용이 낮고 동적 범위가 상당히 높습니다. 여기에서는 인간 진균 병원균 칸 디다 알비칸 스에서 전사 인자-DNA 결합 상호작용의 게놈 전체 분석을 위해 맞춤화된 포괄적인 CUT&RUN 프로토콜 및 수반되는 데이터 분석 워크플로우가 설명된다. 이 상세한 프로토콜은 전사 인자-코딩 유전자의 에피토프 태깅으로부터 시퀀싱을 위한 라이브러리 준비에 이르기까지 필요한 모든 실험 절차를 포함한다; 또한 CUT&RUN 데이터 분석을 위한 맞춤형 계산 워크플로우가 포함되어 있습니다.

이 강력한 CUT&RUN 프로토콜은 C. 알비칸 생물막 및 플랑크톤 배양물에서 특정 TF의 게놈 전체 국소화를 조사하기 위해 채택되고 최적화되었습니다(실험 접근법에 대한 개요는 그림 2 참조). 결과 CUT&RUN 시퀀싱 데이터의 분석을 용이하게 하기 위해 철저한 데이터 분석 파이프라인도 포함되어 있으며 사용자는 코딩 또는 생물정보학에 대한 최소한의 전문 지식을 보유해야 ...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow at JoVE.

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow

이 프로토콜은 인간 곰팡이 병원균 칸 디다 알비칸스에서 뉴클레아제(CUT&RUN)를 사용하여 표적 하에서의 절단 및 방출을 위한 실험 방법 및 데이터 분석 워크플로우를 기술한다.

칸디다 알비칸스에서의 전사 인자-DNA 결합 상호작용의 게놈 전체 프로파일링: 포괄적인 CUT&amp;RUN 방법 및 데이터 분석 워크플로우

Regulatory transcription factors control many important biological processes, including cellular differentiation, responses to environmental perturbations ...

이 프로토콜은 전사 인자 코딩 유전자의 에피토프 태깅부터 전산 데이터 분석을 통한 전사 인자-DNA 결합 상호작용의 게놈 전체 프로파일링을 수행하는 것에서부터 CUT&RUN을 통해 칸디다 알비칸스에서 전사 인자-DNA 결합 상호작용의 게놈 전체 프로파일링을 수행하는 모든 실험 절차를 상세히 기술한다. 이것은 더 접근하기 쉽고, 빠르고, 민감하고, 덜 비싼 기술이며, 기존의 ChIP-chip 및 ChIP-seq 접근법보다 더 높은 품질의 데이터를 제공합니다. 우리의 프로토콜은 생물막 또는 플랑크톤 배양물에서 분리 된 칸디다 알비 칸스 세포를 위해 개발되었지만 거의 모든 좋은 형태의 칸디다 알비 칸스 세포에 적응시키는 것이 실용적이어야합니다.세포 현탁액을 인큐베이션한 후, 다섯 마이크로리터 분취량을 새로운 PCR 튜브 내로 옮긴다. 다섯 마이크로 리터의 분리 된 핵과 이전에 섭씨 네 도에 저장된 손상되지 않은 세포의 5 마이크로 리터 분취량에 calcofluor-white 및 SYTO 13의 각각 하나의 마이크로 리터를 추가하십시오. 어둠 속에서 섭씨 30도에서 30 분 동안 배양하십시오.형광 현미경을 사용하여 분리된 핵의 완전성과 순도를 육안으로 검사한다. 눈에 띄는 SYTO 13 염색을 나타내는 단리된 핵을 찾고 칼코플루오르-백색 염료에 의한 세포벽 염색이 없는지 확인하십시오. 칼코플루오르-백색 염료로 세포벽 염색을 위한 대조군으로서 무손상 세포로 검사를 반복한다.튜브를 마그네틱 랙에 놓고 슬러리가 완전히 깨끗해질 때까지 기다리십시오. 피펫을 사용하여 상층액을 버리십시오. 50 마이크로 리터의 항체 완충액을 넣고 피펫팅으로 부드럽게 혼합하십시오.세 마이크로리터의 항-GFP 폴리클로날 항체를 튜브에 첨가하고, 튜브를 섭씨 4도의 너트 믹서에서 두 시간 동안 인큐베이션한다. 튜브를 실온에서 100 배 g에서 5 초 동안 간단히 원심분리하고 튜브를 자기 랙 위에 놓습니다. 슬러리가 맑아지면 피펫을 사용하여 상층액을 버리십시오.비드가 있는 튜브가 여전히 마그네틱 랙에 있는 동안, 200마이크로리터의 얼음처럼 차가운 세포 투과 버퍼를 비드에 직접 첨가하십시오. 피펫을 사용하여 상층액을 버리십시오. 얼음처럼 차가운 세포 투과 버퍼로 두 번의 세척을 반복하십시오.50 마이크로 리터의 얼음 차가운 세포 투과 버퍼를 각 튜브에 넣고 피펫팅으로 부드럽게 섞으십시오. 2.5 마이크로리터의 단백질 AG-MNase를 각 샘플에 첨가하고 피펫팅하여 혼합한다. 샘플을 섭씨 4도의 너트 믹서 상에 놓고 샘플을 한 시간 동안 인큐베이션한다.스트립 튜브를 실온에서 100 배 g에서 5 초 동안 간단히 원심분리 한 다음 튜브를 자기 랙에 놓습니다. 슬러리가 맑아지면 피펫을 사용하여 상층액을 버리십시오. 비드가 있는 튜브가 여전히 마그네틱 랙에 있는 동안, 200마이크로리터의 얼음처럼 차가운 세포 투과 버퍼를 비드에 직접 첨가하십시오.피펫을 사용하여 상층액을 버리십시오. 얼음처럼 차가운 세포 투과 버퍼로 두 번의 세척을 반복하십시오. 얼음처럼 차가운 세포 투과 완충액 100 마이크로리터를 시료에 넣고 다섯 번 위아래로 부드럽게 피펫을 만듭니다.젤 상자에서 젤 캐스트를 제거하고 제조업체의 지침에 따라 젤 캐스트를 엽니 다. 겔 캐스트에서 겔을 부드럽게 제거하고 100 밀리리터의 단일 강도 TBE가 들어있는 젤 유지 트레이 안에 넣으십시오. 핵산 젤 얼룩 10 마이크로 리터를 트레이에 넣고 부드럽게 소용돌이 치십시오.빛으로부터 보호하기 위해 호일로 덮고 실온에서 10 분 동안 정적으로 배양하십시오. 그런 다음 100 밀리리터의 탈 이온수로 젤을 두 번 헹구십시오. 호박색 필터 커버를 사용하여 청색광 조명 아래에서 젤을 이미지화하십시오.각 라이브러리에 대해 젤을 약 125 염기쌍 눈에 띄는 어댑터 이량체 밴드 위와 400 염기쌍 사다리 마크 아래로 약간 자릅니다. 22 게이지 바늘을 사용하여 0.65 밀리리터 튜브의 바닥에 구멍을 뚫고 뚫린 튜브를 멸균 된 2 밀리리터 마이크로 퍼지 튜브 안에 넣으십시오. 겔 슬라이스를 두 밀리리터 마이크로퍼지 튜브 내부의 뚫린 튜브로 옮깁니다.0.65 밀리리터 천공 튜브 및 샘플을 함유하는 두 밀리리터 마이크로퍼지 튜브를 실온에서 10, 000 배 g에서 2분 동안 원심분리하여 두 밀리리터 마이크로퍼지 튜브 내부의 겔 슬러리를 수집한다. 300 마이크로리터의 얼음처럼 차가운 겔 용출 완충액을 겔 슬러리에 첨가한다. 실온에서 너트 레이터에 최소 세 시간 또는 하룻밤 동안 혼합하십시오.모든 액체 및 겔 슬러리를 0.22 마이크로미터 필터 컬럼으로 옮기고 실온에서 1분 동안 10, 000 배 g에서 원심분리한다. GitHub 페이지에서 녹색 코드 버튼을 클릭한 다음 ZIP 다운로드 옵션을 클릭하여 CUT&RUN 분석의 소스 코드를 다운로드합니다. 폴더의 압축을 로컬 컴퓨터의 관련 위치에 풉니다.콘다 환경을 설치하고 한 번만 실행하십시오. Conda가 설치되면 관련 명령과 함께 제공되는 가상 환경을 만듭니다. 이 워크플로가 실행될 때마다 가상 환경을 활성화합니다.세포벽 소화 및 핵 완전성은 대조군 무손상 세포 및 형광 세포벽 및 핵산 염색으로 염색된 단리된 핵 둘 다를 가시화함으로써 평가되었다. 세포벽 염색이 관찰되지 않는 단리된 무손상 핵과는 달리, 핵과 세포벽 모두 무손상 대조군 세포에서 형광으로 표지된다. 그림은 모세관 전기영동 장비를 사용하여 분석된 CUT&RUN TF 라이브러리를 보여줍니다.성공적인 CUT&RUN TF 라이브러리는 200개의 기본 쌍보다 작은 짧은 조각에 대해 보강됩니다. 차선책의 CUT&RUN TF 라이브러리는 큰 DNA 단편에 대한 농축을 보여줍니다. 본원의 도면은 Ndt80 DNA 결합 모티프가 CUT&RUN에 의해 확인된 모든 Ndt80 결합 유전자좌에 걸쳐 풍부하다는 것을 보여주며, 이는 이 방법론에 의해 확인된 추가적인 피크가 보나피드 Ndt80 결합 부위일 가능성이 있음을 나타낸다.비교 분석은 CUT&RUN 프로토콜이 생물막 형성 동안 Ndt80 및 Efg1에 대해 이전에 알려진 대부분의 결합 사건을 확인했음을 나타냈다. 전반적으로, 유전자좌에 결합된 Ndt80 및 Efg1 둘 모두는 이전에 공개된 크로마틴 면역 침전 ChIP 데이터와 중첩되며, CUT&RUN을 통해서만 확인된다. 이를 통해 전사 규제 네트워크와 칸디다 알비칸에 초점을 맞춘 연구의 범위와 속도를 크게 높일 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&amp;RUN Method and Data Analysis Workflow

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

Microarrays을 사용하여 tRNA의 Aminoacylation (충전) 레벨의 게놈 - 와이드 분석

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

연구

생물학

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

이소형 특정 유전자 목표를 식별 칩을 사용하여 게놈 차원의 분석

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

양적 휘트니스 분석 워크플로우

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

다양한 ChIPseq 데이터 유형의 게놈 차원의 분석을위한 소설 베이지안 변경 - 포인트 알고리즘

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

게놈 전체 규모에 Polysom​​e 분별과 포유류 Translatomes 분석

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

COSMIC와 세포의 약물-DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑 (작은 분자의 가교는 염색질을 분리)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID-SEQ : 아데닌 - 메틸화 된 DNA 단편의 높은 처리량 시퀀싱에 의해 단백질 DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

히스톤 추출에서 데이터 분석에 : 상향식 질량 분석 사용 히스톤 번역 후 변형 분석을위한 완벽한 워크 플로우

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

게놈 넓은 식별 및 소문의 ATL E3 유비퀴틴 리가 유전자 가족의 식 메타 분석을 위한 포괄적인 워크플로

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...