Name: genome-wide profiling of transcription factor-dna binding interactions in candida albicans: a comprehensive cut&amp;run method and data analysis workflow
Uploaded: 2022-04-01T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow at JoVE.

Vi takker alle tidligere og nåværende medlemmer av Nobile- og Hernday-laboratoriene for tilbakemeldinger på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) tildelingsnummer R35GM124594 og av Kamangar-familien i form av en begavet stol til C.J.N. Dette arbeidet ble også støttet av NIH National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) tildelingsnummer R15AI137975 til A.D.H.C.L.E. ble støttet av NIH National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) stipendiatnummer F31DE028488. Innholdet er forfatternes eget ansvar og representerer ikke fundernes synspunkter. Finansiører hadde ingen rolle i utformingen av studien; i innsamling, analyser eller tolkning av data; i skrivingen av manuskriptet; eller i beslutningen om å publisere resultatene.

1. Epitop tagging av C. albicans stammer
<ol><li>Last opp genet av interesse, sammen med sine 1 kb oppstrøms og nedstrøms flankesekvenser, fra Candida Genome Database til primer design verktøyet (se tabell over materialer). Design en guide RNA (gRNA) ved å markere 50 bp oppstrøms og nedstrøms fra stop codon, og klikk på gRNA-markeringsverktøyet til høyre. Velg Utformings- og analyseveiledninger. Bruk genomet Ca22 (Candida...

<ol>
	<li>Gulati, M., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms:+development,+regulation,+and+molecular+mechanisms.">Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms.</a> Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).</li><li>Lohse, M. B., Gulati, M., Johnson, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regulation+of+single-and+multi-species+Candida+albicans+biofilms.">Development and regulation of single-and multi-species Candida albicans biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 19-31 (2018).</li><li>Nobile, C. J., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms+and+human+disease.">Candida albicans biofilms and human disease.</a> Annual Review of Microbiology. 69 (1), 71-92 (2015).</li><li>Nobile, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recently+evolved+transcriptional+network+controls+biofilm+development+in+Candida+albicans.">A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans.</a> Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).</li><li>Iracane, E., Vega-Est&#233;vez, S., Buscaino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+and+off:+epigenetic+regulation+of+C.+albicans+morphological+switches.">On and off: epigenetic regulation of C. albicans morphological switches.</a> Pathogens. 10 (11), 1463 (2021).</li><li>Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Hernday, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+chromatin+accessibility+in+regulating+the+Candida+albicans+white-opaque+phenotypic+switch.">The roles of chromatin accessibility in regulating the Candida albicans white-opaque phenotypic switch.</a> Journal of Fungi. 7 (1), 37 (2021).</li><li>Mancera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+complex+transcription+network+controlling+biofilm+formation+in+candida+species.">Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in candida species.</a> eLife. 10, 64682 (2021).</li><li>Lohse, M. B., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+Wor4,+a+new+transcriptional+regulator+of+white-opaque+switching.">Identification and characterization of Wor4, a new transcriptional regulator of white-opaque switching.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (3), 721-729 (2016).</li><li>Hernday, A. D., Noble, S. M., Mitrovich, Q. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+molecular+biology+in+Candida+albicans.">Genetics and molecular biology in Candida albicans.</a> Methods in Enzymology. 470, 737-758 (2010).</li><li>Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+and+microarray-based+analysis+of+protein+location.">Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location.</a> Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).</li><li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733 (2015).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIC+and+ChEC:+Genomic+mapping+of+chromatin+proteins.">ChIC and ChEC: Genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856 (2017).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+in+situ+genome-wide+profiling+with+high+efficiency+for+low+cell+numbers.">Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers.</a> Nature Protocols. 13 (5), 1006-1019 (2018).</li><li>Nguyen, N., Quail, M. M. F., Hernday, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient,+rapid,+and+recyclable+system+for+CRISPR-mediated+genome+editing+in+Candida+albicans.">An efficient, rapid, and recyclable system for CRISPR-mediated genome editing in Candida albicans.</a> American Society For Microbiology. 2 (2), 00149 (2017).</li><li>Ennis, C. L., Hernday, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+markerless+CRISPR-mediated+system+for+genome+editing+in+Candida+auris+reveals+a+conserved+role+for+Cas5+in+the+caspofungin+response.">A markerless CRISPR-mediated system for genome editing in Candida auris reveals a conserved role for Cas5 in the caspofungin response.</a> Microbiology Spectrum. 9 (3), 0182021 (2021).</li><li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+CUT&amp;RUN+chromatin+profiling+tools.">Improved CUT&amp;RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314 (2019).</li><li>Skrzypek, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Candida+Genome+Database+(CGD):+Incorporation+of+Assembly+22,+systematic+identifiers+and+visualization+of+high+throughput+sequencing+data.">The Candida Genome Database (CGD): Incorporation of Assembly 22, systematic identifiers and visualization of high throughput sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 45, 592-596 (2017).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li><li>Boyd, J., Rodriguez, P., Schjerven, H., Frietze, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ssvQC:+an+integrated+CUT&amp;RUN+quality+control+workflow+for+histone+modifications+and+transcription+factors.">ssvQC: an integrated CUT&amp;RUN quality control workflow for histone modifications and transcription factors.</a> BMC Research Notes. 14 (1), 366 (2021).</li><li>Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BigWig+and+BigBed:+enabling+browsing+of+large+distributed+datasets.">BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets.</a> Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).</li><li>Homann, O. R., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MochiView:+Versatile+software+for+genome+browsing+and+DNA+motif+analysis.">MochiView: Versatile software for genome browsing and DNA motif analysis.</a> BMC Biology. 8, 49 (2010).</li><li>Hainer, S. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+chromatin+profiling+using+CUT&amp;RUN.">High-resolution chromatin profiling using CUT&amp;RUN.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Rodriguez, D. L., Quail, M. M., Hernday, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+circuits+regulating+developmental+processes+in+Candida+albicans.">Transcriptional circuits regulating developmental processes in Candida albicans.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 605711 (2020).</li><li>Zhu, Q., Liu, N., Orkin, S. H., Yuan, G. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;amp;RUNTools:+a+flexible+pipeline+for+CUT&amp;amp;RUN+processing+and+footprint+analysis.">CUT&amp;amp;RUNTools: a flexible pipeline for CUT&amp;amp;RUN processing and footprint analysis.</a> Genome Biology. 20 (1), 192 (2019).</li><li>Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+expressed+loci+are+vulnerable+to+misleading+ChIP+localization+of+multiple+unrelated+proteins.">Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18602-18607 (2013).</li></ol>

Denne protokollen presenterer en omfattende eksperimentell og beregningsrørledning for genom-bred lokalisering av regulatoriske TFer i C. albicans. Den er designet for å være svært tilgjengelig for alle med standard mikrobiologi og molekylærbiologiopplæring. Ved å utnytte de høye dynamiske og lave kravene til prøveinngang i CUT&RUN-analysen og inkludert optimaliseringer for lokalisering av TF-DNA-bindingsinteraksjoner i C. albicans biofilm og planktoniske kulturer, presenterer denne protokollen...

Candida albicans er et klinisk relevant, polymorfisk menneskelig sopppatogen som eksisterer i en rekke forskjellige vekstformer, for eksempel den planktoniske (frittflytende) vekstmåten og som samfunn av tettsittende celler beskyttet av en ekstracellulær matrise, kjent som biofilmmodusen for vekst 1,2,3. I likhet med andre utviklings- og cellulære prosesser er biofilmutvikling et viktig C. albicans virulenstrekk som er kjent for å bli kontrollert på transkripsjonsnivå av regulatoriske transkripsjonsfaktorer (TFer) som binder seg til DNA på en sekvensspesifikk måte4. Nylig har kromatinregulatorer og histonemodifikatorer også dukket opp som viktige regulatorer for C. albicans biofilmformasjon5 og morfogenese6 ved å formidle DNA-tilgjengelighet. For å forstå den komplekse biologien til dette viktige sopppatogenet, er effektive metoder for å bestemme den genomomfattende lokaliseringen av spesifikke TFer under distinkte utviklings- og cellulære prosesser verdifull.
Kromatin immunoprecipitation etterfulgt av sekvensering (ChIP-seq) er en mye brukt metode for å undersøke protein-DNA interaksjoner i C. albicans 5,6 og har i stor grad erstattet den mer klassiske kromatin immunoprecipitation etterfulgt av mikroarray (ChIP-chip)9 metode. Både ChIP-seq- og ChIP-chip-metoder krever imidlertid et stort antall inngangsceller10, noe som kan være en kompliserende faktor når du undersøker TFer i sammenheng med spesifikke prøver og vekstmåter, for eksempel biofilmer samlet inn fra pasienter eller dyremodeller av infeksjon. I tillegg gir kromatinimmunoprecipitation (ChIP) analysen ofte et betydelig mengde bakgrunnssignal gjennom hele genomet, noe som krever et høyt nivå av berikelse for målet om interesse for å tilstrekkelig skille signal fra støy. Selv om ChIP-chip-analysen i stor grad er utdatert i dag, gjør sekvenseringsdybdene som er nødvendige for ChIP-seq denne analysen uoverkommelig dyrt for mange forskere, spesielt de som studerer flere TFer og / eller kromatinrelaterte proteiner.

Cleavage under mål og frigjøring ved hjelp av nuclease (CUT&RUN) er et attraktivt alternativ til ChIP-seq. Det ble utviklet av Henikoff lab i 2017 for å omgå begrensningene i ChIP-seq og kromatin endogen spalting etterfulgt av sekvensering ChEC-seq11,12, en annen metode for å identifisere protein-DNA interaksjoner på et genom-bredt nivå, samtidig som det gir høyoppløselig, genom-bred kartlegging av TFs og kromatin-assosierte proteiner13 . CUT&RUN er avhengig av målrettet fordøyelse av kromatin i permeabiliserte kjerner ved hjelp av tethered mikrokokkkjerner, etterfulgt av sekvensering av de fordøyde DNA-fragmentene 9,10. Ettersom DNA-fragmenter genereres spesifikt på loci som er bundet av et protein av interesse, i stedet for å bli generert over hele genomet via tilfeldig fragmentering som i ChIP-analyser, resulterer CUT&RUN-tilnærmingen i sterkt reduserte bakgrunnssignaler og krever dermed 1/10th av sekvenseringsdybden sammenlignet med ChIP-seq11,13, 14. Disse forbedringene fører til slutt til betydelige reduksjoner i sekvenseringskostnader og reduksjoner i det totale antallet inngangsceller som trengs som startmateriale for hvert utvalg.
Her beskrives en robust CUT&RUN-protokoll som er tilpasset og optimalisert for å bestemme den genomomfattende lokaliseringen av TFer i C. albicansceller isolert fra biofilmer og planktoniske kulturer. Det presenteres også en grundig dataanalysepipeline som muliggjør behandling og analyse av de resulterende sekvensdataene og krever at brukerne har minimal kompetanse innen koding eller bioinformatikk. Kort fortalt beskriver denne protokollen epitopmerking av TF-kodingsgener, høsting av biofilm og planktoniske celler, isolering av intakt permeabilisert kjerne, inkubasjon med primære antistoffer mot det spesifikke protein- eller epitopmerkede proteinet av interesse, tethering av den chimeriske A / G-mikrokokkkjernen (pAG-MNase) fusjonsproteiner til de primære antistoffene, genomisk DNA-utvinning etter kromatin fordøyelse og fremstilling av genomiske DNA-biblioteker for sekvensering.
Den eksperimentelle CUT&RUN-protokollen etterfølges av en spesialbygd dataanalysepipeline, som tar rå DNA-sekvenseringslesninger i FASTQ-format og implementerer alle nødvendige behandlingstrinn for å gi en komplett liste over betydelig beriket loci bundet av TF av interesse (målrettet av det primære antistoffet). Vær oppmerksom på at flere trinn i den beskrevne bibliotekforberedelsesprotokollen er spesielt tilpasset og optimalisert for CUT&RUN-analyse av TFer (i motsetning til nukleosomer). Mens dataene som presenteres i dette manuskriptet ble generert ved hjelp av TF-spesifikke tilpasninger av et kommersielt CUT&RUN-sett, har disse protokollene også blitt validert ved hjelp av individuelt produserte komponenter (dvs. pAG-MNase-enzym og magnetiske DNA-renseperler) og interne forberedte buffere, noe som kan redusere eksperimentelle kostnader betydelig. De omfattende eksperimentelle protokollene og dataanalyseprotokollene er beskrevet i detalj nedenfor i et trinnvis format. Alle reagenser og kritisk utstyr, samt buffer- og medieoppskrifter, er oppført i henholdsvis materialtabellen og tilleggsfil 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGPM33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.65 mL low-adhesion tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490003-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-152-341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M PIPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ61224AK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well untreated cell culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Digitonin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CHR103MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x phusion HF buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as &#34;DNA polymerase buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP magnetic beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;capillary electrophoresis instrument&#34;; user-dependepent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89133-910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchling primer design tool</td>
			<td>Benchling</td>
			<td></td>
			<td>https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as &#34;the primer design tool&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ77507AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor white stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida Genome Database</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.candidagenome.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>&#160;86057-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conda software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curl tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ 
			chromosomes.fasta.gz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUTANA ChIC/CUT&#38;RUN kit</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>14-1048</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;the CUT&#38;RUN kit&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco D-mannitol</td>
			<td>&#160;BD Biosciences</td>
			<td>217020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Loading Dye (6x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq green DNA polymerase</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>EP0713</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;cPCR DNA polymerase&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq green DNA polymerase buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>EP0713</td>
			<td>Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as &#34;cPCR DNA polymerase buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli spike-in DNA</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>18-1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELMI Microplate incubator</td>
			<td>ELMI</td>
			<td>TRMS-04</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;microplate incubator&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End Prep Enzyme Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End Prep Reaction Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest MssI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FD1344</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;restriction enzyme&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest MssI Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FD1344</td>
			<td>Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as &#34;restriction enzyme buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP525-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler low range DNA ladder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FERSM1192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GitBash workflow</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://gitforwindows.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GitHub source code</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-KOH pH 7.5</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BBH-75-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PX1830-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52846-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Enhancer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate dihydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>215525683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody</td>
			<td>Takara</td>
			<td>632592</td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://pypi.org/project/MACS2/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>10-0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate and cuvette spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>EPOCH2TC</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;spectrophotometer&#34;; user-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MochiView</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCBI GEO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Adaptor for Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as &#34;Adapter&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Index X Primer for Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as &#34;Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;library prep kit&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Universal PCR Primer for Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as &#34;Universal Forward Library Amplification Primer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin sulfate (NAT)</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>N-500-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex TBE Gels, 10%, 15 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>EC62755BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient broth</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C6471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH110</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90982</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90982&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH119</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90985</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90985&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH137</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90986</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90986&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH139</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90987</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90987&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH140</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90988</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90988&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG-MNase</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>15-1016 or 15-1116</td>
			<td>50 rxn or 250 rxn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCE1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>174434</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 174434&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes with clear lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion high fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;DNA polymerase&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 3350</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10791-816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x dsDNA HS assay kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;fluorometer&#34;; user-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG negative control antibody</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>13-0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109169001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M12820004</td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile inoculating loops</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30002-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO 13 nucleic acid stain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S7575</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;nucleic acid gel stain&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252859-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra II Ligation Master Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as &#34;Ligation Master Mix&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra II Q5 Master Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as &#34;High Fidelity DNA Polymerase Master Mix &#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure salmon sperm DNA solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER Enzyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as &#34;Uracil Excision Enzyme&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wget tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ 
			chromosomes.fasta.gz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C7341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0439194</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide profiling of transcription factor-dna binding interactions in candida albicans: a comprehensive cut&amp;run method and data analysis workflow

Regulatoriske transkripsjonsfaktorer kontrollerer mange viktige biologiske prosesser, inkludert cellulær differensiering, respons på miljøperturbasjoner og spenninger, og vertspatogeninteraksjoner. Å bestemme den genomomfattende bindingen av regulatoriske transkripsjonsfaktorer til DNA er avgjørende for å forstå funksjonen til transkripsjonsfaktorer i disse ofte komplekse biologiske prosessene. Cleavage under mål og frigjøring ved hjelp av nuklease (CUT&RUN) er en moderne metode for genom-wide kartlegging av in vivo protein-DNA bindende interaksjoner som er et attraktivt alternativ til den tradisjonelle og mye brukte kromatin immunoprecipitation etterfulgt av sekvensering (ChIP-seq) metode. CUT&RUN er egnet til et eksperimentelt oppsett med høyere gjennomstrømning og har et betydelig høyere dynamisk område med lavere sekvenseringskostnader per prøve enn ChIP-seq. Her beskrives en omfattende CUT&RUN-protokoll og tilhørende dataanalysearbeidsflyt skreddersydd for genomomfattende analyse av transkripsjonsfaktor-DNA-bindende interaksjoner i det menneskelige sopppatogenet Candida albicans . Denne detaljerte protokollen inkluderer alle nødvendige eksperimentelle prosedyrer, fra epitopmerking av transkripsjonsfaktorkodingsgener til bibliotekforberedelse for sekvensering; I tillegg inkluderer den en tilpasset beregningsarbeidsflyt for CUT&RUN-dataanalyse.

Denne robuste CUT&RUN-protokollen ble tilpasset og optimalisert for å undersøke den genomomfattende lokaliseringen av spesifikke TFer i C. albicans biofilmer og planktonkulturer (se figur 2 for en oversikt over eksperimentell tilnærming). En grundig dataanalysepipeline er også inkludert for å lette analysen av de resulterende CUT&RUN-sekvenseringsdataene og krever at brukerne har minimal kompetanse innen koding eller bioinformatikk (se figur 3 for ...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow at JoVE.

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow

Denne protokollen beskriver en eksperimentell metode- og dataanalysearbeidsflyt for spalting under mål og frigjøring ved hjelp av kjernease (CUT&RUN) i det menneskelige sopppatogenet Candida albicans.

Genomomfattende profilering av transkripsjonsfaktor-DNA-bindende interaksjoner i Candida albicans: En omfattende CUT&amp;RUN-metode og arbeidsflyt for dataanalyse

Regulatory transcription factors control many important biological processes, including cellular differentiation, responses to environmental perturbations ...

Denne protokollen beskriver alle eksperimentelle prosedyrer, fra epitopmerking av transkripsjonsfaktorkodingsgener gjennom beregningsdataanalyse, til å utføre genomomfattende profilering av transkripsjonsfaktor-DNA-bindende interaksjoner i Candida albicans via CUT&RUN. Dette er en mer tilgjengelig, raskere, mer følsom, rimeligere teknikk, og gir data av høyere kvalitet enn tradisjonelle ChIP-chip- og ChIP-seq-tilnærminger. Selv om vår protokoll er utviklet for Candida albicans celler isolert fra biofilmer eller planktoniske kulturer, bør det være praktisk å tilpasse den til nesten alle gode former for Candida albicans celler.Etter inkubering av cellefjæringen, overfør en fem-mikroliter aliquot til et nytt PCR-rør. Til fem mikroliter isolerte kjerner og en fem-mikroliter aliquot av intakte celler som tidligere var lagret ved fire grader Celsius, tilsett en mikroliter hver av kalorihvite og SYTO 13. Inkuber ved 30 grader Celsius i mørket i 30 minutter.Inspiser integriteten og renheten til de isolerte kjernene visuelt ved hjelp av et fluorescensmikroskop. Se etter isolerte kjerner som viser fremtredende SYTO 13-farging og sørg for at ingen celleveggfarging av kalorihvit fargestoffet. Gjenta inspeksjonen med intakte celler som en kontroll for celleveggfarging med kalorihvit fargestoff.Plasser rørene på et magnetisk stativ og vent til slammet er helt klart. Kast supernatanten med en pipette. Tilsett 50 mikroliter av antistoffbufferen og bland forsiktig ved pipettering.Tilsett tre mikroliter av anti-GFP polyklonal antistoff mot rørene og inkuber rørene på en nøtteblander ved 4 grader Celsius i to timer. Sentrifuger rørene kort ved 100 ganger g ved romtemperatur i fem sekunder og plasser rørene på et magnetisk stativ. Når slammet er klart, kast supernatanten ved hjelp av en pipette.Mens rørene med perlene fortsatt er på magnetstativet, tilsett 200 mikroliter iskald cellepermeabiliseringsbuffer direkte på perlene. Kast supernatanten med en pipette. Gjenta to vasker med den iskalde cellepermeabiliseringsbufferen.Tilsett 50 mikroliter iskald cellepermeabiliseringsbuffer til hvert rør og bland forsiktig ved pipettering. Tilsett 2,5 mikroliter av proteinet AG-MNase i hver prøve og bland ved pipettering. Plasser prøvene på en nøtteblander ved 4 grader Celsius og inkuber prøvene i en time.Sentrifuger kort striperørene ved 100 ganger g ved romtemperatur i fem sekunder, og plasser deretter rørene på et magnetisk stativ. Når slammet er klart, kast supernatanten ved hjelp av en pipette. Mens rørene med perlene fortsatt er på magnetstativet, tilsett 200 mikroliter iskald cellepermeabiliseringsbuffer direkte på perlene.Kast supernatanten med en pipette. Gjenta to vasker med den iskalde cellepermeabiliseringsbufferen. Tilsett 100 mikroliter av den iskalde cellepermeabiliseringsbufferen til prøvene og rør forsiktig opp og ned fem ganger.Fjern gelstøpet fra gelboksen og åpne gelstøpet i henhold til produsentens instruksjoner. Fjern gelen forsiktig fra gelstøpet og legg den inne i et gelholdende brett som inneholder 100 milliliter TBE med én styrke. Tilsett 10 mikroliter av nukleinsyregelflekken til brettet og virvle forsiktig.Dekk med folie for å beskytte mot lys og inkubere statisk ved romtemperatur i 10 minutter. Skyll deretter gelen to ganger med 100 milliliter deionisert vann fra springen. Se for deg gelen under blått lysbelysning ved hjelp av et gult filterdeksel.For hvert bibliotek kutter du gelen litt over det ca. 125 baseparets fremtredende adapter dimerbånd og under stigemerket på 400 basepar. Punkter bunnen av et 0,65 milliliter rør ved hjelp av en 22-gauge nål og plasser det punkterte røret inne i et sterilt mikrofugerør med to milliliter. Overfør gelskiven til det punkterte røret inne i mikrofugerøret med to milliliter.Sentrifuger det to milliliter mikrofunksjonsrøret som inneholder det punkterte røret på 0,65 milliliter og prøver ved 10 000 ganger g ved romtemperatur i to minutter for å samle gelslammet inne i det to milliliter mikrofugerøret. Tilsett 300 mikroliter iskald gel elutionbuffer til gelslammet. Bland på en mutter ved romtemperatur i minst tre timer eller over natten.Overfør all væske- og gelslam til en filterkolonne på 0,22 mikrometer og sentrifuger ved 10 000 ganger g ved romtemperatur i ett minutt. Last ned kildekoden for CUT&RUN-analysen fra GitHub-siden ved å klikke på den grønne Kode-knappen, etterfulgt av Last ned ZIP-alternativet. Pakk ut mappen til en relevant plassering på den lokale maskinen.Installer Conda Environment og kjør bare én gang. Når Conda er installert, oppretter du et virtuelt miljø som følger med den relevante kommandoen. Aktiver det virtuelle miljøet hver gang denne arbeidsflyten utføres.Cellevegg fordøyelse og kjernefysisk integritet ble vurdert ved å visualisere både kontroll intakte celler og isolerte kjerner farget med fluorescerende cellevegg og nukleinsyre flekker. I motsetning til de isolerte intakte kjernene der celleveggfarging ikke observeres, er både kjernen og celleveggene fluorescerende merket i de intakte kontrollcellene. Figuren viser CUT&RUN TF-biblioteker analysert ved hjelp av et kapillær elektroforeseinstrument.Vellykkede CUT&RUN TF-biblioteker er beriket for korte fragmenter som er mindre enn 200 basispar. Suboptimale CUT&RUN TF-biblioteker viser berikelse for store DNA-fragmenter. Figuren her viser at Ndt80 DNA-bindende motiver er beriket på tvers av alle Ndt80-bundet loci identifisert av CUT&RUN, noe som indikerer at de ekstra toppene identifisert av denne metodikken sannsynligvis er bonafide Ndt80-bundet nettsteder.Komparativ analyse indikerte at CUT&RUN-protokollen identifiserte de fleste tidligere kjente bindingshendelser for Ndt80 og Efg1 under biofilmdannelse. Totalt sett overlapper både Ndt80 og Efg1 med tidligere publiserte chromatin immunutfelling ChIP-data og identifiseres bare ved hjelp av CUT&RUN. Det gjør det mulig for oss å øke omfanget og tempoet i vår forskning betydelig fokusert på transkripsjonelle regulatoriske nettverk og Candida albicans.

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&amp;RUN Method and Data Analysis Workflow

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

En kvantitativ fitnessanalyse Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

A Novel Bayesiansk Change-point algoritme for Genome-wide analyse av Diverse ChIPseq Datatyper

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

Polysome fraksjonering og analyse av pattedyr Translatomes på en Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Genome-wide Kartlegging av narkotika DNA Interactions i Cells med COSMIC (Fornetting av små molekyler å isolere Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID-seq: Genome-wide Kartlegging av Protein-DNA Interaksjoner med høy gjennomstrømning Sekvensering av adenin-metylert DNA-fragmenter

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Komplett arbeidsflyt for analyse av Histone posttranslasjonelle modifikasjoner hjelp Bottom-up massespektrometri: Fra Histone Utvinning til dataanalyse

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

Omfattende arbeidsflyten for genomet-identifikasjon og uttrykk Meta-analyse av ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene familien i Grapevine

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...