Name: genome-wide profiling of transcription factor-dna binding interactions in candida albicans: a comprehensive cut&amp;run method and data analysis workflow
Uploaded: 2022-04-01T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow at JoVE.

Nobile ve Hernday laboratuvarlarının geçmiş ve şimdiki tüm üyelerine makale hakkındaki geri bildirimleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIGMS) ödül numarası R35GM124594 ve Kamangar ailesi tarafından C.J.N.'ye bağışlanmış bir sandalye şeklinde desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda NIH Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (NIAID) ödül numarası R15AI137975 tarafından A.D.H.'ye .C.L.E. tarafından desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve fon sağlayıcıların görüşlerini temsil etmemektedir. Fon verenlerin çalışmanın tasarımında hiçbir rolü yoktu; verilerin toplanmasında, analizinde veya yorumlanmasında; yazının yazımında; veya sonuçları yayınlama kararında.

1. C. albicans suşlarının epitop etiketlemesi
<ol><li>İlgilenilen geni, 1 kb yukarı akış ve aşağı akış yan dizileriyle birlikte, Candida Genom Veritabanından primer tasarım aracına yükleyin ( bkz. Durdurma kodonundan yukarı ve aşağı yönde 50 bp vurgulayarak bir kılavuz RNA (gRNA) tasarlayın ve sağdaki gRNA seçim aracına tıklayın. Tasarım ve Analiz Kılavuzları'nı seçin. Kılavuz parametreleri için Ca22...

<ol>
	<li>Gulati, M., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms:+development,+regulation,+and+molecular+mechanisms.">Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms.</a> Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).</li><li>Lohse, M. B., Gulati, M., Johnson, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regulation+of+single-and+multi-species+Candida+albicans+biofilms.">Development and regulation of single-and multi-species Candida albicans biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 19-31 (2018).</li><li>Nobile, C. J., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms+and+human+disease.">Candida albicans biofilms and human disease.</a> Annual Review of Microbiology. 69 (1), 71-92 (2015).</li><li>Nobile, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recently+evolved+transcriptional+network+controls+biofilm+development+in+Candida+albicans.">A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans.</a> Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).</li><li>Iracane, E., Vega-Est&#233;vez, S., Buscaino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+and+off:+epigenetic+regulation+of+C.+albicans+morphological+switches.">On and off: epigenetic regulation of C. albicans morphological switches.</a> Pathogens. 10 (11), 1463 (2021).</li><li>Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Hernday, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+chromatin+accessibility+in+regulating+the+Candida+albicans+white-opaque+phenotypic+switch.">The roles of chromatin accessibility in regulating the Candida albicans white-opaque phenotypic switch.</a> Journal of Fungi. 7 (1), 37 (2021).</li><li>Mancera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+complex+transcription+network+controlling+biofilm+formation+in+candida+species.">Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in candida species.</a> eLife. 10, 64682 (2021).</li><li>Lohse, M. B., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+Wor4,+a+new+transcriptional+regulator+of+white-opaque+switching.">Identification and characterization of Wor4, a new transcriptional regulator of white-opaque switching.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (3), 721-729 (2016).</li><li>Hernday, A. D., Noble, S. M., Mitrovich, Q. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+molecular+biology+in+Candida+albicans.">Genetics and molecular biology in Candida albicans.</a> Methods in Enzymology. 470, 737-758 (2010).</li><li>Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+and+microarray-based+analysis+of+protein+location.">Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location.</a> Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).</li><li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733 (2015).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIC+and+ChEC:+Genomic+mapping+of+chromatin+proteins.">ChIC and ChEC: Genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856 (2017).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+in+situ+genome-wide+profiling+with+high+efficiency+for+low+cell+numbers.">Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers.</a> Nature Protocols. 13 (5), 1006-1019 (2018).</li><li>Nguyen, N., Quail, M. M. F., Hernday, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient,+rapid,+and+recyclable+system+for+CRISPR-mediated+genome+editing+in+Candida+albicans.">An efficient, rapid, and recyclable system for CRISPR-mediated genome editing in Candida albicans.</a> American Society For Microbiology. 2 (2), 00149 (2017).</li><li>Ennis, C. L., Hernday, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+markerless+CRISPR-mediated+system+for+genome+editing+in+Candida+auris+reveals+a+conserved+role+for+Cas5+in+the+caspofungin+response.">A markerless CRISPR-mediated system for genome editing in Candida auris reveals a conserved role for Cas5 in the caspofungin response.</a> Microbiology Spectrum. 9 (3), 0182021 (2021).</li><li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+CUT&amp;RUN+chromatin+profiling+tools.">Improved CUT&amp;RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314 (2019).</li><li>Skrzypek, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Candida+Genome+Database+(CGD):+Incorporation+of+Assembly+22,+systematic+identifiers+and+visualization+of+high+throughput+sequencing+data.">The Candida Genome Database (CGD): Incorporation of Assembly 22, systematic identifiers and visualization of high throughput sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 45, 592-596 (2017).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li><li>Boyd, J., Rodriguez, P., Schjerven, H., Frietze, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ssvQC:+an+integrated+CUT&amp;RUN+quality+control+workflow+for+histone+modifications+and+transcription+factors.">ssvQC: an integrated CUT&amp;RUN quality control workflow for histone modifications and transcription factors.</a> BMC Research Notes. 14 (1), 366 (2021).</li><li>Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BigWig+and+BigBed:+enabling+browsing+of+large+distributed+datasets.">BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets.</a> Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).</li><li>Homann, O. R., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MochiView:+Versatile+software+for+genome+browsing+and+DNA+motif+analysis.">MochiView: Versatile software for genome browsing and DNA motif analysis.</a> BMC Biology. 8, 49 (2010).</li><li>Hainer, S. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+chromatin+profiling+using+CUT&amp;RUN.">High-resolution chromatin profiling using CUT&amp;RUN.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Rodriguez, D. L., Quail, M. M., Hernday, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+circuits+regulating+developmental+processes+in+Candida+albicans.">Transcriptional circuits regulating developmental processes in Candida albicans.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 605711 (2020).</li><li>Zhu, Q., Liu, N., Orkin, S. H., Yuan, G. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;amp;RUNTools:+a+flexible+pipeline+for+CUT&amp;amp;RUN+processing+and+footprint+analysis.">CUT&amp;amp;RUNTools: a flexible pipeline for CUT&amp;amp;RUN processing and footprint analysis.</a> Genome Biology. 20 (1), 192 (2019).</li><li>Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+expressed+loci+are+vulnerable+to+misleading+ChIP+localization+of+multiple+unrelated+proteins.">Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18602-18607 (2013).</li></ol>

Bu protokol, C. albicans'taki düzenleyici TF'lerin genom çapında lokalizasyonu için kapsamlı bir deneysel ve hesaplamalı boru hattı sunmaktadır. Standart mikrobiyoloji ve moleküler biyoloji eğitimi alan herkes için oldukça erişilebilir olacak şekilde tasarlanmıştır. CUT&RUN testinin yüksek dinamik aralığından ve düşük numune girdisi gereksinimlerinden yararlanarak ve C. albicans biyofilm ve planktonik kültürlerde TF-DNA bağlanma etkileşimlerinin lokalizasyonu için optimizasy...

Candida albicans, planktonik (serbest yüzen) büyüme modu ve biyofilm büyüme modu 1,2,3 olarak bilinen hücre dışı bir matris tarafından korunan sıkıca yapışmış hücrelerin toplulukları gibi çeşitlifarklı büyüme modlarında bulunan klinik olarak alakalı, polimorfik bir insan mantar patojenidir. Diğer gelişimsel ve hücresel süreçlere benzer şekilde, biyofilm gelişimi, DNA'ya diziye özgü bir şekilde bağlanan düzenleyici transkripsiyon faktörleri (TF'ler) tarafından transkripsiyonel düzeyde kontrol edildiği bilinen önemli bir C. albicans virülans özelliğidir4. Son zamanlarda, kromatin düzenleyicileri ve histon değiştiriciler, DNA erişilebilirliğine aracılık ederek C. albicans biyofilm oluşumu5 ve morfogenez6'nın önemli düzenleyicileri olarak ortaya çıkmıştır. Bu önemli mantar patojeninin karmaşık biyolojisini anlamak için, farklı gelişimsel ve hücresel süreçler sırasında spesifik TF'lerin genom çapında lokalizasyonunu belirlemek için etkili yöntemler değerlidir.
Kromatin immünopresipitasyonu ve ardından dizileme (ChIP-seq), C. albicans 5,6'da protein-DNA etkileşimlerini araştırmak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir ve büyük ölçüde daha klasik kromatin immünopresipitasyonunun yerini mikroarray (ChIP-çip)9 yönteminin almıştır. Bununla birlikte, hem ChIP-seq hem de ChIP-çip yöntemleri, hastalardan toplanan biyofilmler veya hayvan enfeksiyon modelleri gibi belirli örnekler ve büyüme modları bağlamında TF'leri araştırırken karmaşık bir faktör olabilecek çok sayıda giriş hücresi10 gerektirir. Ek olarak, kromatin immünopresipitasyon (ChIP) testi genellikle genom boyunca önemli miktarda arka plan sinyali verir ve ilgilenilen hedefin sinyali gürültüden yeterince ayırması için yüksek düzeyde zenginleştirme gerektirir. ChIP-çip testi bugün büyük ölçüde modası geçmiş olsa da, ChIP-seq için gerekli sıralama derinlikleri, bu tahlili birçok araştırmacı için, özellikle de birden fazla TF ve / veya kromatin ile ilişkili proteinleri inceleyenler için yasaklayıcı bir şekilde pahalı hale getirmektedir.

Hedeflerin altında bölünme ve nükleaz (CUT&RUN) kullanarak serbest bırakma, ChIP-seq'e cazip bir alternatiftir. 2017 yılında Henikoff laboratuvarı tarafından ChIP-seq ve kromatin endojen bölünmesinin sınırlamalarını aşmak için geliştirildi ve ardından protein-DNA etkileşimlerini genom çapında bir düzeyde tanımlamak için başka bir yöntem olan ChEC-seq 11,12'yi diziledi, aynı zamanda TF'lerin ve kromatinle ilişkili proteinlerin yüksek çözünürlüklü, genom çapında haritalanmasını sağladı13 . CUT&RUN, bağlı mikrokokal nükleazlar kullanılarak geçirgenleştirilmiş çekirdekler içindeki kromatinin hedeflenen sindirimine ve ardından sindirilen DNA fragmanlarının dizilimine dayanır 9,10. DNA fragmanları, ChIP tahlillerinde olduğu gibi rastgele parçalanma yoluyla genom boyunca üretilmek yerine, özellikle ilgili bir protein tarafından bağlanan lokuslarda üretildiğinden, CUT&RUN yaklaşımı büyük ölçüde azaltılmış arka plan sinyalleri ile sonuçlanır ve bu nedenle, ChIP-seq 11,13'e kıyasla dizileme derinliğinin 1 / 10'unu gerektirir. 14. Bu iyileştirmeler nihayetinde sıralama maliyetlerinde önemli azalmalara ve her numune için başlangıç malzemesi olarak ihtiyaç duyulan toplam giriş hücresi sayısında azalmaya yol açmaktadır.
Burada, biyofilmlerden ve planktonik kültürlerden izole edilen C. albicans hücrelerinde TF'lerin genom çapında lokalizasyonunu belirlemek için uyarlanmış ve optimize edilmiş sağlam bir CUT&RUN protokolü tanımlanmıştır. Elde edilen dizi verilerinin işlenmesini ve analizini sağlayan ve kullanıcıların kodlama veya biyoinformatik konusunda minimum uzmanlığa sahip olmalarını gerektiren kapsamlı bir veri analizi boru hattı da sunulmaktadır. Kısaca, bu protokol TF kodlayan genlerin epitop etiketlemesini, biyofilm ve planktonik hücrelerin toplanmasını, bozulmamış geçirgen çekirdeklerin izolasyonunu, spesifik protein veya epitop etiketli ilgili proteine karşı birincil antikorlarla inkübasyonu, kimerik A / G-mikrokokal nükleaz (pAG-MNaz) füzyon proteinlerinin birincil antikorlara bağlanmasını, kromatin sindiriminden sonra genomik DNA geri kazanımını ve dizileme için genomik DNA kütüphanelerinin hazırlanmasını açıklamaktadır.
Deneysel CUT&RUN protokolünü, ham DNA dizileme okumalarını FASTQ formatında alan ve ilgilenilen TF (birincil antikor tarafından hedeflenen) tarafından bağlanan önemli ölçüde zenginleştirilmiş lokusların tam bir listesini sağlamak için gerekli tüm işleme adımlarını uygulayan, amaca yönelik bir veri analizi boru hattı izler. Açıklanan kütüphane hazırlama protokolünün birden fazla adımının, TF'lerin CUT&RUN analizi için özel olarak uyarlandığını ve optimize edildiğini unutmayın (nükleozomların aksine). Bu makalede sunulan veriler, ticari bir CUT&RUN kitinin TF'ye özgü uyarlamaları kullanılarak üretilirken, bu protokoller ayrıca bireysel kaynaklı bileşenler (yani, pAG-MNaz enzimi ve manyetik DNA saflaştırma boncukları) ve deneysel maliyeti önemli ölçüde azaltabilen şirket içi hazırlanmış tamponlar kullanılarak doğrulanmıştır. Kapsamlı deneysel ve veri analizi protokolleri aşağıda adım adım formatta ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Tüm reaktifler ve kritik ekipmanların yanı sıra tampon ve ortam tarifleri sırasıyla Malzeme Tablosu ve Ek Dosya 1'de listelenmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGPM33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.65 mL low-adhesion tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490003-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-152-341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M PIPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ61224AK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well untreated cell culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Digitonin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CHR103MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x phusion HF buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as &#34;DNA polymerase buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP magnetic beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;capillary electrophoresis instrument&#34;; user-dependepent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89133-910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchling primer design tool</td>
			<td>Benchling</td>
			<td></td>
			<td>https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as &#34;the primer design tool&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ77507AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor white stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida Genome Database</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.candidagenome.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>&#160;86057-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conda software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curl tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ 
			chromosomes.fasta.gz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUTANA ChIC/CUT&#38;RUN kit</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>14-1048</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;the CUT&#38;RUN kit&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco D-mannitol</td>
			<td>&#160;BD Biosciences</td>
			<td>217020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Loading Dye (6x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq green DNA polymerase</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>EP0713</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;cPCR DNA polymerase&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq green DNA polymerase buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>EP0713</td>
			<td>Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as &#34;cPCR DNA polymerase buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli spike-in DNA</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>18-1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELMI Microplate incubator</td>
			<td>ELMI</td>
			<td>TRMS-04</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;microplate incubator&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End Prep Enzyme Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End Prep Reaction Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest MssI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FD1344</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;restriction enzyme&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest MssI Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FD1344</td>
			<td>Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as &#34;restriction enzyme buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP525-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler low range DNA ladder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FERSM1192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GitBash workflow</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://gitforwindows.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GitHub source code</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-KOH pH 7.5</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BBH-75-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PX1830-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52846-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Enhancer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate dihydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>215525683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody</td>
			<td>Takara</td>
			<td>632592</td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://pypi.org/project/MACS2/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>10-0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate and cuvette spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>EPOCH2TC</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;spectrophotometer&#34;; user-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MochiView</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCBI GEO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Adaptor for Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as &#34;Adapter&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Index X Primer for Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as &#34;Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;library prep kit&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Universal PCR Primer for Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as &#34;Universal Forward Library Amplification Primer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin sulfate (NAT)</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>N-500-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex TBE Gels, 10%, 15 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>EC62755BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient broth</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C6471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH110</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90982</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90982&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH119</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90985</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90985&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH137</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90986</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90986&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH139</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90987</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90987&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH140</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90988</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90988&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG-MNase</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>15-1016 or 15-1116</td>
			<td>50 rxn or 250 rxn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCE1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>174434</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 174434&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes with clear lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion high fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;DNA polymerase&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 3350</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10791-816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x dsDNA HS assay kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;fluorometer&#34;; user-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG negative control antibody</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>13-0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109169001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M12820004</td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile inoculating loops</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30002-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO 13 nucleic acid stain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S7575</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;nucleic acid gel stain&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252859-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra II Ligation Master Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as &#34;Ligation Master Mix&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra II Q5 Master Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as &#34;High Fidelity DNA Polymerase Master Mix &#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure salmon sperm DNA solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER Enzyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as &#34;Uracil Excision Enzyme&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wget tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ 
			chromosomes.fasta.gz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C7341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0439194</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide profiling of transcription factor-dna binding interactions in candida albicans: a comprehensive cut&amp;run method and data analysis workflow

Düzenleyici transkripsiyon faktörleri, hücresel farklılaşma, çevresel pertürbasyonlara ve streslere verilen tepkiler ve konakçı-patojen etkileşimleri dahil olmak üzere birçok önemli biyolojik süreci kontrol eder. Düzenleyici transkripsiyon faktörlerinin DNA'ya genom çapında bağlanmasının belirlenmesi, bu genellikle karmaşık biyolojik süreçlerde transkripsiyon faktörlerinin işlevini anlamak için esastır. Hedefler altında bölünme ve nükleaz (CUT&RUN) kullanılarak salınım, geleneksel ve yaygın olarak kullanılan kromatin immünopresipitasyonuna ve ardından dizileme (ChIP-seq) yöntemine çekici bir alternatif olan in vivo protein-DNA bağlanma etkileşimlerinin genom çapında haritalanması için modern bir yöntemdir. CUT&RUN, daha yüksek verimli bir deneysel kuruluma uygundur ve ChIP-seq'ten daha düşük numune başına sıralama maliyetleri ile önemli ölçüde daha yüksek bir dinamik aralığa sahiptir. Burada, insan mantar patojeni Candida albicans'taki transkripsiyon faktörü-DNA bağlanma etkileşimlerinin genom çapında analizi için uyarlanmış kapsamlı bir CUT&RUN protokolü ve beraberindeki veri analizi iş akışı açıklanmaktadır. Bu ayrıntılı protokol, transkripsiyon faktörü kodlayan genlerin epitop etiketlemesinden, dizileme için kütüphane hazırlığına kadar gerekli tüm deneysel prosedürleri içerir; Ayrıca, CUT&RUN veri analizi için özelleştirilmiş bir hesaplama iş akışı içerir.

Bu sağlam CUT&RUN protokolü, C. albicans biyofilmlerinde ve planktonik kültürlerde spesifik TF'lerin genom çapında lokalizasyonunu araştırmak için uyarlanmış ve optimize edilmiştir (deneysel yaklaşıma genel bir bakış için Şekil 2'ye bakınız). Elde edilen CUT&RUN sıralama verilerinin analizini kolaylaştırmak için kapsamlı bir veri analizi işlem hattı da dahil edilmiştir ve kullanıcıların kodlama veya biyoinformatik konusunda minimum uzmanlığa sahip ol...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow at JoVE.

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow

Bu protokol, insan mantar patojeni Candida albicans'ta nükleaz (CUT&RUN) kullanarak hedefler altında bölünme ve salınım için deneysel bir yöntem ve veri analizi iş akışını açıklamaktadır.

Candida albicans'ta Transkripsiyon Faktörü-DNA Bağlanma Etkileşimlerinin Genom Çapında Profillenmesi: Kapsamlı Bir CUT&amp;RUN Yöntemi ve Veri Analizi İş Akışı

Regulatory transcription factors control many important biological processes, including cellular differentiation, responses to environmental perturbations ...

Bu protokol, transkripsiyon faktörü kodlayan genlerin epitop etiketlemesinden hesaplamalı veri analizine kadar, CUT & RUN aracılığıyla Candida albicans'ta transkripsiyon faktörü-DNA bağlanma etkileşimlerinin genom çapında profillemesini gerçekleştirmeye kadar tüm deneysel prosedürleri detaylandırır. Bu daha erişilebilir, daha hızlı, daha hassas, daha ucuz bir tekniktir ve geleneksel ChIP-çip ve ChIP-seq yaklaşımlarından daha yüksek kaliteli veri sağlar. Protokolümüz biyofilmlerden veya planktonik kültürlerden izole edilen Candida albicans hücreleri için geliştirilmiş olsa da, onu hemen hemen her iyi Candida albicans hücresi formuna uyarlamak pratik olmalıdır.Hücre süspansiyonunu inkübe ettikten sonra, beş mikrolitrelik bir alikotu yeni bir PCR tüpüne aktarın. Daha önce dört santigrat derecede depolanmış beş mikrolitre izole çekirdeğe ve beş mikrolitrelik sağlam hücrelerin alikotuna, her biri kalkoflor-beyaz ve SYTO 13'ün her birine bir mikrolitre ekleyin. 30 dakika boyunca karanlıkta 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Bir floresan mikroskobu kullanarak izole edilmiş çekirdeklerin bütünlüğünü ve saflığını görsel olarak inceleyin. Belirgin SYTO 13 boyaması gösteren izole çekirdekleri arayın ve kalkoflor-beyaz boya ile hücre duvarının boyanmadığından emin olun. Kalkoflor-beyaz boya ile hücre duvarı boyama kontrolü olarak sağlam hücrelerle muayeneyi tekrarlayın.Tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin ve bulamaç tamamen temizlenene kadar bekleyin. Süpernatantı pipet kullanarak atın. 50 mikrolitre antikor tamponu ekleyin ve pipetleyerek, hafifçe karıştırın.Tüplere üç mikrolitre anti-GFP poliklonal antikoru ekleyin ve tüpleri iki saat boyunca 4 santigrat derecede bir somun karıştırıcı üzerinde inkübe edin. Tüpleri oda sıcaklığında 100 kez g'de beş saniye boyunca kısaca santrifüj edin ve tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin. Bulamaç temizlendikten sonra, süpernatantı bir pipet kullanarak atın.Boncuklu tüpler hala manyetik raf üzerindeyken, doğrudan boncukların üzerine 200 mikrolitre buz gibi soğuk hücre geçirgenlik tamponu ekleyin. Süpernatantı pipet kullanarak atın. Buz gibi soğuk hücre geçirgenlik tamponu ile iki yıkamayı tekrarlayın.Her tüpe 50 mikrolitre buz gibi soğuk hücre geçirgenlik tamponu ekleyin ve pipetleme ile nazikçe karıştırın. Her numuneye 2,5 mikrolitre AG-MNaz proteini ekleyin ve pipetle karıştırın. Numuneleri 4 santigrat derecede bir nutasyon karıştırıcısına yerleştirin ve numuneleri bir saat boyunca inkübe edin.Şerit tüpleri beş saniye boyunca oda sıcaklığında 100 kez g'de kısaca santrifüj edin, ardından tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin. Bulamaç temizlendikten sonra, süpernatantı bir pipet kullanarak atın. Boncuklu tüpler hala manyetik raf üzerindeyken, doğrudan boncukların üzerine 200 mikrolitre buz gibi soğuk hücre geçirgenlik tamponu ekleyin.Süpernatantı pipet kullanarak atın. Buz gibi soğuk hücre geçirgenlik tamponu ile iki yıkamayı tekrarlayın. Numunelere 100 mikrolitre buz gibi soğuk hücre geçirgenlik tamponu ekleyin ve beş kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.Jel dökümünü jel kutusundan çıkarın ve üreticinin talimatlarına göre jel dökümünü açın. Jeli jel dökümünden yavaşça çıkarın ve 100 mililitre tek mukavemetli TBE içeren bir jel tutma tepsisinin içine yerleştirin. Tepsiye 10 mikrolitre nükleik asit jel lekesi ekleyin ve yavaşça döndürün.Işıktan korumak için folyo ile örtün ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında statik olarak inkübe edin. Daha sonra jeli 100 mililitre deiyonize musluk suyu ile iki kez durulayın. Sarı filtre kapağı kullanarak jeli mavi ışık aydınlatması altında görüntüleyin.Her kütüphane için, jeli yaklaşık 125 baz çifti belirgin adaptör dimer bandının biraz üstünde ve 400 baz çift merdiven işaretinin altında kesin. 22 gauge'lik bir iğne kullanarak 0.65 mililitrelik bir tüpün tabanını delin ve delinmiş tüpü steril iki mililitrelik bir mikrofüj tüpünün içine yerleştirin. Jel dilimini iki mililitrelik mikrofüj tüpünün içindeki delinmiş tüpe aktarın.0.65 mililitrelik delinmiş tüpü içeren iki mililitrelik mikrofüj tüpünü santrifüj edin ve iki mililitrelik mikrofüj tüpünün içindeki jel bulamacını toplamak için iki dakika boyunca oda sıcaklığında 10.000 kez g'de numune alın. Jel bulamacına 300 mikrolitre buz gibi soğuk jel elüsyon tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında bir nutator üzerinde en az üç saat veya gece boyunca karıştırın.Tüm sıvı ve jel bulamacı 0,22 mikrometrelik bir filtre kolonuna aktarın ve bir dakika boyunca oda sıcaklığında 10.000 kez g'da santrifüj yapın. Yeşil Kod düğmesine ve ardından ZIP İndir seçeneğine tıklayarak GitHub sayfasından CUT&RUN analizi için kaynak kodunu indirin. Klasörü yerel makinede ilgili bir konuma açın.Conda Ortamını yükleyin ve yalnızca bir kez çalıştırın. Conda kurulduktan sonra, ilgili komutla sağlanan sanal bir ortam oluşturun. Bu iş akışı her yürütüldüğünde sanal ortamı etkinleştirin.Hücre duvarı sindirimi ve nükleer bütünlük, hem kontrol sağlam hücreleri hem de floresan hücre duvarı ve nükleik asit lekeleri ile boyanmış izole çekirdekleri görselleştirerek değerlendirildi. Hücre duvarı boyamasının gözlenmediği izole edilmiş bozulmamış çekirdeklerin aksine, hem çekirdekler hem de hücre duvarları, bozulmamış kontrol hücrelerinde floresan olarak etiketlenir. Şekil, kılcal elektroforez cihazı kullanılarak analiz edilen CUT&RUN TF kütüphanelerini göstermektedir.Başarılı CUT&RUN TF kütüphaneleri, 200 baz çiftinden küçük kısa parçalar için zenginleştirilmiştir. Optimal olmayan CUT&RUN TF kütüphaneleri büyük DNA fragmanları için zenginleştirme gösterir. Buradaki şekil, Ndt80 DNA bağlayıcı motiflerin, CUT&RUN tarafından tanımlanan tüm Ndt80'e bağlı lokuslarda zenginleştirildiğini göstermektedir, bu da bu metodoloji tarafından tanımlanan ek zirvelerin muhtemelen iyi niyetli Ndt80'e bağlı bölgeler olduğunu göstermektedir.Karşılaştırmalı analiz, CUT&RUN protokolünün biyofilm oluşumu sırasında Ndt80 ve Efg1 için daha önce bilinen bağlanma olaylarının çoğunu tanımladığını göstermiştir. Genel olarak, lokuslara bağlı hem Ndt80 hem de Efg1, daha önce yayınlanmış kromatin immün çökeltme ChIP verileriyle örtüşür ve yalnızca CUT & RUN kullanılarak tanımlanır. Transkripsiyonel düzenleyici ağlara ve Candida albicans'a odaklanan araştırmamızın kapsamını ve hızını önemli ölçüde artırmamızı sağlar.

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&amp;RUN Method and Data Analysis Workflow

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

Mikroarray&#39;ler kullanarak tRNA Aminoacylation (Şarj) Seviyeler genom Analizi

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Izoform özel Gen Hedefler Belirlemek için ChIP kullanarak genom analizi

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Kantitatif Spor Analizi İş Akışı

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

Çeşitli ChIPseq Veri Türleri Genom çapında Analizi İçin Yeni Bir Bayesian değiştir nokta Algoritması

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

Bir genom Ölçeği Polizom Fraksiyonu ve Memeli Translatomes Analizi

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

COSMIC ile Hücrelerde İlaç-DNA Etkileşimlerinin genom Haritalama (Küçük moleküllerinin çapraz bağlanmasını Kromatin yalıtmak için)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID seq: Adenin-metillenmiş DNA Fragments Yüksek Verimli Dizileme tarafından Protein-DNA Etkileşimleri genom Haritalama

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Histon Ekstraksiyon Gönderen Data Analizi: Aşağıdan yukarıya Kütle Spektrometre kullanarak histon post-translasyonel modifikasyonlar Analizi için komple iş akışı

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

Genom kapsamındaki bir tanımlama ve ifade Meta-Analizi ATL E3 Ubikuitin ligaz gen ailesinin asma için kapsamlı iş akışı

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...