Name: nitroreductase/metronidazole-mediated ablation and a matlab platform (rpegen) for studying regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium
Uploaded: 2022-03-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

تم دعم العمل الموصوف هنا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (RO1-EY29410 إلى J.M.G ، ومنحة NIH CORE P30-EY08098 إلى قسم طب العيون) ؛ مركز UPMC لزراعة وعلاج المناعة (إلى L.L.L. و J.M.G.) ؛ وكرسي E. Ronald Salvitti في أبحاث طب العيون (إلى J.M.G.). تم تلقي دعم إضافي من زمالة ويغاند في طب العيون (إلى L.L.L) ، ومؤسسة العين والأذن في بيتسبرغ ، ومنحة غير مقيدة من Research to Prevent Blindness ، New York ، NY. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا أماندا بلات على المساعدة التقنية والدكتور هيو هامر وموظفي الألعاب المائية على دعمهم الممتاز لرعاية الحيوانات.

جميع المنهجيات الموضحة هنا متوافقة مع اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) بجامعة بيتسبرغ.
1. التحضير قبل جمع جنين الزرد
<ol><li>اضبط حاضنة الأجنة على 28.5 درجة مئوية.</li>
	<li>قم بإعداد محلول مخزون 25x لمثبط تكوين الميلانوجينيا ، N-phenylthiourea (PTU) 21,22</...

يصف هذا البروتوكول منهجية لاستئصال RPE وراثيا ودراسة آليات التنكس والتجديد في أسماك الزرد في عمر اليرقات. كما تم تنفيذ هذا البروتوكول بنجاح في الزرد البالغ3 ولكن مع توصيف أقل شمولا ، وهذا هو السبب في أن اليرقات هي التركيز هنا. تشمل الجوانب الحرجة لهذا الجزء من البروتوكول (الخطو?...

تفصل المنهجية الموصوفة هنا بروتوكولا لاستئصال ظهارة صبغة الشبكية (RPE) وراثيا باستخدام الزرد اليرقي. يمتد RPE فوق الجزء الخلفي من العين ويقيم بين الطبقات الطبقية للشبكية العصبية وطبقة الأوعية الدموية التي تشكل المشيمة. الدعم الغذائي ، وامتصاص الضوء السام للضوء ، والحفاظ على بروتينات الدورة البصرية ليست سوى بعض الوظائف الحرجة التي يؤديها RPE والتي تعتبر ضرورية للحفاظ على صحة وسلامة هذه الأنسجة المجاورة1. الأضرار التي لحقت RPE الثدييات قابلة للإصلاح عندما تكون الآفات صغيرة2 ؛ ومع ذلك ، فإن الأضرار التي تعاني منها الإصابات الأكبر أو الأمراض التنكسية التقدمية لا رجعة فيها. في البشر ، تؤدي الأمراض التنكسية RPE (على سبيل المثال ، التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ومرض Stargardt) إلى فقدان البصر الدائم ، ومع قلة خيارات العلاج المتاحة ، انخفاض نوعية حياة المريض. وقد خلقت القدرة المحدودة ل RPE الثدييات على الإصلاح الذاتي فجوة معرفية في مجال العمليات التجديدية RPE. وبالنظر إلى القدرة التجديدية القوية لأسماك الزرد عبر العديد من أنواع الأنسجة المختلفة، تم تطوير هذا البروتوكول لإنشاء نظام فقاريات في الجسم الحي لتسهيل الدراسات حول تجديد RPE بشكل جوهري والكشف عن الآليات التي تدفع هذه الاستجابة. باستخدام نموذج الاستئصال الموضح هنا ، تم تحديد مسار إشارات Wnt الأساسي3 ، ومسار mTOR4 ، والاستجابات المتعلقة بالمناعة5 كوسطاء حاسمين لتجديد RPE ، على الأرجح مع وظائف متداخلة.
في نموذج الاستئصال الجيني هذا، يعبر Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 الزرد عن الجين6 المشتق من البكتيريا النيتروجيني المختزل (NTR/nfsB) المنصهر في eGFP تحت سيطرة عنصر محسن RPE، rpe65a7. يتم تحقيق الاجتثاث عن طريق إضافة البرودوية ، ميترونيدازول (MTZ) ، إلى نظام الزرد الذي يحتوي على الماء. يؤدي التنشيط داخل الخلايا ل MTZ بواسطة nitroreductase إلى ترابط الحمض النووي وموت الخلايا المبرمج في الخلايا المعبرة عن NTR / nfsB 8,9. وقد استخدمت هذه التكنولوجيا على نطاق واسع في أسماك الزرد للقضاء على خلايا شبكية العين 10،11،12،13 وغيرها من الأنسجة8. معا ، تتيح هذه العناصر التعبير المستهدف (rpe65a) لمنهجية استئصال الخلايا القابلة للحث (NTR / MTZ) 8,9 وعلامة الفلورسنت (eGFP) للتصور.
توجد أيضا نماذج أخرى مثيرة للاهتمام في الجسم الحي يمكن استخدامها لدراسة الإمكانات التجديدية ل RPE14. وهي واسعة النطاق وتشمل تحويل RPE إلى شبكية العين بعد استئصال شبكية العين في البرمائيات ، حيث يتم استبدال خلايا RPE المفقودة بسبب إعادة نمو الشبكية15,16 ؛ استعادة RPE بعد الإصابة في الماوس MRL / MpJ17 "الشفاء الفائق" ؛ والتحفيز الخارجي لانتشار RPE في نموذج الفئران من RPE التلقائي وتنكس الشبكية18 ، من بين أمور أخرى. كما تم تطوير نماذج في المختبر، مثل الخلايا الجذعية البشرية البالغة (RPESCs)19. وهذه النماذج كلها أدوات قيمة تعمل على الكشف عن العمليات الخلوية المتصلة بتجديد قواعد التشغيل والتقييم (مثل الانتشار، والتمايز، وما إلى ذلك)؛ ومع ذلك ، فإن الزرد فريد من نوعه في قدرته على إصلاح RPE الجوهري بعد الاستئصال.
في حين أن المنهجية هنا مكتوبة للتركيز على فهم الآليات التي تقود تجديد RPE ، يمكن استخدام خط Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) وبروتوكول الاستئصال الجيني هذا لدراسة العمليات الخلوية الأخرى مثل موت الخلايا المبرمج RPE ، وتنكس RPE ، وتأثير إصابة RPE على أنسجة الشبكية والأوعية الدموية المجاورة. يمكن أيضا تعديل بروتوكول الاستئصال ليشمل التلاعب الدوائي ، وهو استراتيجية أولية مريحة لفحص مسارات الإشارات ذات الاهتمام. على سبيل المثال ، ثبت أن حظر مسار Wnt الأساسي باستخدام مثبط استجابة Wnt Response-1 (IWR-1)20 ، يضعف تجديد RPE3. تم تكرار ذلك هنا لتوجيه المستخدمين من خلال تجربة التلاعب الدوائي ويكون بمثابة إثبات للمفهوم للتحقق من صحة برنامج نصي MATLAB (RpEGEN) تم إنشاؤه لتحديد تجديد RPE بناء على استعادة التصبغ. مثل الخط المعدل وراثيا وبروتوكول الاستئصال ، فإن نصوص RpEGEN قابلة للتكيف ويمكن استخدامها لتحديد العلامات / العمليات الخلوية الأخرى داخل RPE.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lab Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>Catalog number is for 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond tip scribing pen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-254-51</td>
			<td>Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO) &#8805;99.7 %</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo incubator (large)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3720A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo incubator (mini/tabletop)</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Zoom.V16</td>
			<td>Or similar, with 488 nm excitation laser/filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-4</td>
			<td>Manufactured by Corning, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5.04462</td>
			<td>Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue (powder)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP117-100</td>
			<td>Also available as a premade aqeuous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metronidazole (MTZ)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M3761</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td>Chemical waste, proper disposal required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (powder packets)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Used to make 10 X PBS stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PRON-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>H2010</td>
			<td>Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>Or similar, with transmitted light illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Fine-tipped forceps for manual dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop rotator/shaker</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>SK-D1807-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z135003</td>
			<td>3.2 mL bulb draw, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>TRS1, TRS2, TRS5</td>
			<td>Also available from Fisher Scientific (NC0342409)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td>Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRAMM examples and how-tos</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td>
			<td>Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB support</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/support.html</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nitroreductase/metronidazole-mediated ablation and a matlab platform (rpegen) for studying regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium

توجد ظهارة صبغة الشبكية (RPE) في الجزء الخلفي من العين وتؤدي وظائف ضرورية للحفاظ على صحة وسلامة أنسجة الشبكية والأوعية الدموية المجاورة. وفي الوقت الحاضر، أعاقت القدرة المحدودة على إصلاح قواعد السلوك في الثدييات، التي تقتصر على الإصابات الصغيرة، التقدم المحرز في فهم العمليات التجديدية للقواعد في الجسم الحي . هنا ، يتم توفير منهجية مفصلة لتسهيل دراسة إصلاح RPE في الجسم الحي باستخدام الزرد ، وهو نموذج فقاري قادر على تجديد الأنسجة القوية. يصف هذا البروتوكول نموذج إصابة بوساطة النيتروجين / ميترونيدازول المعدل وراثيا (NTR / MTZ) (rpe65a: nfsB-eGFP) ، والذي يؤدي إلى استئصال الثلثين المركزيين من RPE بعد 24 ساعة من العلاج باستخدام MTZ ، مع استعادة الأنسجة لاحقا. وينصب التركيز على عمليات استئصال RPE في أسماك الزرد اليرقية وطرق اختبار آثار المركبات الدوائية على تجديد RPE. كما تمت مناقشة إنشاء والتحقق من صحة RpEGEN ، وهو برنامج نصي MATLAB تم إنشاؤه لأتمتة القياس الكمي لتجديد RPE على أساس التصبغ. بالإضافة إلى آليات إصلاح RPE النشطة ، يمكن توسيع هذا البروتوكول ليشمل دراسات انحطاط RPE واستجابات الإصابة بالإضافة إلى آثار تلف RPE على أنسجة الشبكية والأوعية الدموية المجاورة ، من بين العمليات الخلوية والجزيئية الأخرى. يحمل نظام الزرد هذا وعدا كبيرا في تحديد الجينات والشبكات والعمليات التي تدفع تجديد RPE والآليات المتعلقة بأمراض RPE ، مع هدف طويل الأجل يتمثل في تطبيق هذه المعرفة على أنظمة الثدييات ، وفي النهاية ، نحو التطوير العلاجي.

من المعروف أن تثبيط مسار إشارات Wnt الأساسي يضعف بشكل كبير تجديد RPE لأسماك الزرد باستخدام نموذج الاستئصال الجيني (rpe65a: nfsB-eGFP) ومنهجية التلاعب الدوائي (IWR-1) الموصوفة في البروتوكول3. تم تكرار هذه التجربة هنا للتحقق من صحة طريقة آلية لقياس كمية تجديد RPE لأسماك الزرد بناء على الت?...

Watch this Scientific Journal Video about Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

يصف هذا البروتوكول منهجية استئصال ظهارة صبغة الشبكية وراثيا (RPE) باستخدام نموذج الزرد المعدل وراثيا. تكييف البروتوكول لدمج تعديل مسار الإشارات باستخدام المركبات الدوائية مفصل على نطاق واسع. تم تطوير منصة MATLAB لقياس تجديد RPE على أساس التصبغ ويتم تقديمها ومناقشتها.

الاستئصال بوساطة النيتروكتاز / ميترونيدازول ومنصة MATLAB (RpEGEN) لدراسة تجديد صبغة شبكية الزرد

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

الزرد فريد من نوعه في قدرته الجوهرية على تجديد العديد من أنواع الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك RPE. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد المسارات الجزيئية التي تدفع تجديد RPE والآليات المتعلقة بمرض RPE. التنوع هو ميزة أساسية لهذه المنهجية.بالإضافة إلى دراسة تجديد RPE ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لفحص العمليات التنكسية RPE وآثار تلف RPE على الأنسجة المجاورة في العين. الثدييات ، بما في ذلك البشر ، غير قادرة على إصلاح إصابات RPE الكبيرة الناتجة عن الصدمات أو الأمراض التنكسية. يعد استخدام أسماك الزرد كأداة لاكتشاف العوامل المؤيدة للتجدد من RPE خطوة مهمة نحو تعزيز تجديد RPE للثدييات.لتحضير محلول MTZ طازج 10 ملليمولار ، بعد خمسة أيام من الإخصاب ، أضف مسحوق MTZ إلى ماء النظام بدون PTU واخلطه جيدا عن طريق الاهتزاز القوي لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. قم بتبريد محلول MTZ 10 ملليمولار لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على دوار الطاولة أو الخلاط. لفحص يرقات الزرد من الجينات المعدلة rpe65a:nsfB-eGFP، افصل يرقات eGFP الإيجابية المعدلة وراثيا عن يرقات eGFP السلبية غير المعدلة وراثيا باستخدام مجهر ستيريو فلورسنت مع ليزر إثارة 488 نانومتر.استيقظ على الفور من اليرقات التي تم فحصها عن طريق السحب مباشرة إلى طبق بتري مع 1.5X PTU طازج بدون تريكاين. عند الانتهاء من الفحص ، قم بفصل اليرقات الإيجابية eGFP إلى مجموعتين من أطباق Petri ، مجموعة واحدة لتلقي علاج MTZ ومجموعة واحدة لتكون السيطرة غير المنفذة. ثم قم بإزالة ظهارة صبغة الشبكية عن طريق إزالة 1.5X PTU من أطباق العلاج المذبوحة وإضافة محلول MTZ الطازج 10 ملليمولار.قم أيضا بإزالة 1.5X PTU من أطباق التحكم غير المنفذة وأضف مياه النظام العذبة بدون PTU. قم بإزالة محلول MTZ 10 مللي مولا بعد 24 ساعة بالضبط وأضف مياه النظام العذبة بدون PTU. تغيير مياه النظام العذبة دون PTU على الأطباق السلبية MTZ.فحص يرقات eGFP الإيجابية في أربعة أيام بعد الإخصاب. يظهر eGFP بعد أربعة أيام من الإخصاب ، ولكنه يبدو أكثر قتامة من شدة الإشارة في اليوم الخامس. ضع يرقات eGFP الإيجابية في أطباق من ستة آبار بدلا من أطباق بتري بكثافة لا تزيد عن 10 يرقات لكل بئر للعلاج الدوائي.قم بتعيين لوحات منفصلة من ستة آبار لليرقات المبطنة وغير المذبوحة. حدد حجم 15 ميكرومولار IWR-1 أو الحجم المطابق للمعالجة المسبقة للتحكم في مركبة DMSO اللازمة و aliquot 1.5X PTU في أنابيب مخروطية وفقا لذلك. أضف مخزون IWR-1 إلى 1.5X PTU للحصول على تركيز نهائي من 15 ميكرومولار IWR-1.أضف حجما مطابقا من مخزون DMSO إلى 1.5X PTU. تخلط جيدا عن طريق الدوامة وتؤكد بصريا ذوبان المركبات. قم بإزالة 1.5X PTU من يرقات eGFP الإيجابية في لوحات من ستة آبار وأضف خمسة ملليلترات لكل بئر من 0.06٪ DMSO الطازج أو 15 معالجة IWR-1 ميكرومولار.قم بإلغاء RPE في اليوم التالي. في خمسة أيام بعد الإخصاب ، حدد حجم العلاجات الدوائية وعلاجات التحكم في المركبات اللازمة لكل من الصفائح المكونة من ستة آبار غير مأخوذة و aliquot كميات مناسبة من مياه النظام العذبة بدون PTU أو محلول MTZ 10 ملليمولار في أنابيب مخروطية. أضف حلول مخزون IWR-1 و DMSO إلى الأنابيب المخروطية ذات الصلة كما تم تنفيذها سابقا.تخلط جيدا عن طريق الدوامة وتؤكد بصريا ذوبان المركبات. قم بإزالة 0.06٪ DMSO و 15 ميكرومولار IWR-1 من المعالجات المسبقة في 1.5X PTU من لوحات ستة آبار محددة غير ممسوخة ومحذوفة. قم بالتجديد بمياه النظام العذبة المناسبة دون معالجة محلول PTU و MTZ.قم بإزالة 0.06٪ DMSO و 15 معالجة IWR-1 ميكرومولار في محلول MTZ 10 ملليمولار بعد 24 ساعة بالضبط وتجديدها بالعلاجات في مياه النظام العذبة بدون PTU. قم بتجديد 0.06٪ DMSO و 15 معالجة IWR-1 ميكرومولار في مياه النظام العذبة بدون PTU على لوحة الآبار الستة غير المنفذة. رصد نجاح ومدى الاستئصال في الجسم الحي باستخدام الإضاءة الضوئية المنقولة على مجهر ستيريو للحفاظ على اليرقات بعد الاستئصال الوراثي.لإنشاء منطقة اهتمام RPE أو عائد الاستثمار باستخدام فيجي ، افتح صورة TIFF ثمانية بت ، وأعد توجيه الصورة بحيث يكون الجانب الظهري لأعلى ويتم ترك الجانب البعيد عن طريق اختيار الصورة وتحويلها وقلبها أفقيا. بالنسبة للأمر الأخير، حدد الخيار الذي يناسب الاتجاه المطلوب لتلك الصورة. ابدأ تشغيل مدير عائد الاستثمار عن طريق اختيار التحليل والأدوات ومدير عائد الاستثمار.استخدم الصورة والتكبير/التصغير والتبديل بين قناتي DAPI وBrightfield. استخدم اختصارات لوحة المفاتيح لتحقيق الكفاءة. حدد النقطة التي يكون فيها الجانب القمي من RPE مجاورا من طرف الغشاء الخارجي المحدد واستخدم هذا المعلم التشريحي كنقطة انطلاق عائد الاستثمار.قم بإنشاء عائد استثمار RPE باستخدام أداة تحديدات المضلع في شريط أدوات فيجي باستخدام كل من قنوات الصور DAPI و Brightfield ووظيفة تكبير الصورة لتحديد حدود RPE القمية والقاعدية. اجعل الأطراف الظهرية والبطنية لعائد الاستثمار إلى نقطة حادة بدلا من التثبيط أو التقريب. أضف عائد الاستثمار بالنقر فوق إضافة في مدير عائد الاستثمار.احفظ ملف عائد الاستثمار عن طريق اختيار المزيد واحفظ داخل مدير عائد الاستثمار. انقر نقرا مزدوجا فوق rpegen. m لفتحه في جزء المحرر.ضمن قسم المتغير المعرف من قبل المستخدم من rpegen. m file ، أدخل مواقع الدليل للمجلدات التي تحتوي على ملفات عائد الاستثمار وملفات صور TIFF وحيث يجب حفظ ملفات الإخراج. أدخل اسم المجموعة لملف الحصيرة المراد تصديره وموقع قناة Brightfield في مكدس صور TIFF.قم بتشغيل البرنامج النصي بالنقر فوق الزر "تشغيل" في قائمة المحرر أعلى MATLAB. بعد حفظ ملف MAT ، سيظهر شكل ثلاث لوحات وسيتم حفظه أيضا كملف PDF في دليل الإخراج لكل تشغيل صورة. انتظر حتى يتم حفظ ملفات PDF لمراقبة الجودة هذه في مجلد المخرجات ويختفي الشكل الأخير.افتح ملفات PDF الفردية وتحقق من تطابق جميع عائد الاستثمار مع صور Brightfield. انقر نقرا مزدوجا فوق rpegen_permplot. m ملف لفتحه في علامة تبويب محرر جديد.ضمن قسم المتغيرات المعرفة من قبل مستخدم واحد، أدخل موقع الدليل لمجلد الإخراج الذي يحتوي على ملفات MAT من تشغيل rpegen. م النص. أدخل كل اسم ملف MAT ليتم تحميله.قم بتشغيل هذا القسم من البرنامج النصي بالنقر فوق زر تشغيل القسم في قائمة المحرر. في القسم الثاني، أدخل أسماء المجموعتين لإجراء مقارنة إحصائية في متغيري البيانات A والبيانات B وحدد عدد تكرارات محاكاة التباديل في متغير الممثلين. تم استخدام 2000 مندوب فقط لهذا العرض التوضيحي لتقليل وقت المعالجة.قم بتشغيل هذا القسم من البرنامج النصي بالنقر فوق زر تشغيل القسم في قائمة المحرر. قم بتشغيل شكل الخريطة الحرارية ونتائج المجموعة وأقسام القيمة P بشكل مستقل باستخدام زر قسم التشغيل. أظهر الضرر الكامل لليرقة بعد الإخصاب لمدة خمسة أيام تعبيرا جينيا مشرقا في RPE في وقت فحص الاستئصال الجيني.أظهر التشريح المبرد المستعرض لليرقة بعد الإخصاب لمدة ستة أيام أن التعبير الجيني المتحول يقتصر على خلايا RPE الناضجة مع ألمع تعبير يقتصر على 2/3 المركزي من RPE. تشير رؤوس الأسهم إلى الزغابات الدقيقة القمي. كشف التشريح المبرد المستعرض ليرقة ما بعد الإصابة لمدة يوم واحد عن اضطراب في مورفولوجيا الخلايا الإيجابية eGFP.تشير الأسهم إلى النوى البيكنوية. أظهرت أضرار التركيب الكاملة ليرقات ما بعد الإخصاب لمدة سبعة أيام غير متوقفة تصبغ RPE في جميع أنحاء العين وأظهرت يرقات ما بعد الإصابة لمدة يومين منطقة استئصال غائبة عن الصباغ في RPE المركزية. أظهرت مؤامرة تم إنشاؤها باستخدام RpEGEN تشابها بين مجموعات DMSO و IWR-1 التي استمرت تسعة أيام بعد الإخصاب عبر طول RPE.أظهرت المؤامرة كثافة بكسل أخف بشكل عام في مجموعات DMSO و IWR-1 التي تم إزالتها لمدة أربعة أيام بعد الإصابة ، والتي بدت أخف وزنا في IWR-1 المذبوحة عند مقارنتها بأي مجموعة علاج أخرى. كانت الاختلافات في تصبغ RPE المركزي كبيرة عند مقارنة اليرقات المعالجة IWR-1 المذبوحة بالضوابط المعالجة DMSO المذبوحة. باستخدام نموذج استئصال الزرد هذا ، تمكنا من تحديد العديد من مسارات الإشارات الجزيئية ، مثل إشارات الرياح التي أظهرناها هنا ، والتي تعد منظمات مهمة لتجديد RPE.

Research

JoVE Journal

Biology

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

نظام لخلايا الظهارية التثقيف صبغات قزحية عدسة لدراسة التجديد في نيوت

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

تذرية الليزر للاسماك الزرد سليفة الكلوة لدراسة التجديد طلائي الكلوي

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

ملامح التعبير microRNA من خلايا الجذع الإنسان، الشبكية المشتقة من الظهارة الصبغية المحفزة، والجنين الظهارة الصبغية الشبكية

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea MNU-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea (MNU) يسببها الشبكية البقعي والتجدد في الزرد: التركيب النسيجي والخصائص الوظيفية

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

الثقافات الخلية الأولية من ظهارة صباغ الشبكية الماوس

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

عزل الخلايا الظهارية المصطبغة بالشبكية الأولية للفأر

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

توليد فعال ومتسق لظهارة صبغية شبكية العين / المشيمية من العين البشرية للتحليل النسيجي

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...