Name: nitroreductase/metronidazole-mediated ablation and a matlab platform (rpegen) for studying regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium
Uploaded: 2022-03-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Arbejdet beskrevet heri blev støttet af National Institutes of Health (RO1-EY29410 til J.M.G og NIH CORE Grant P30-EY08098 til Institut for Oftalmologi); UPMC Immune Transplant & Therapy Center (til L.L.L. og J.M.G.); og E. Ronald Salvitti Chair i oftalmologiforskning (til J.M.G.). Yderligere støtte blev modtaget fra Wiegand Fellowship in Ophthalmology (til L.L.L), Eye & Ear Foundation of Pittsburgh og et ubegrænset tilskud fra Research to Prevent Blindness, New York, NY. Forfattere vil også gerne takke Amanda Platt for teknisk bistand og Dr. Hugh Hammer og akvatikpersonalet for fremragende dyreplejestøtte.

Alle metoder, der er skitseret heri, er i overensstemmelse med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Pittsburgh.
1. Forberedelse forud for indsamling af zebrafiskembryoner
<ol><li>Indstil embryoinkubator til 28,5 ° C.</li>
	<li>Der fremstilles en 25x stamopløsning af melanogenesehæmmeren, N-phenylthiourea (PTU)21,22. Denne stamopløsning skaleres ud fra en almindelig opskri...

Denne protokol beskriver metoden til genetisk ablat rpE og undersøgelsesmekanismer for degeneration og regenerering i larvelagrede zebrafisk. Denne protokol er også blevet udført med succes i voksne zebrafisk3, men med mindre omfattende karakterisering, hvorfor larver er i fokus her. Kritiske aspekter af denne del af protokollen (trin 1-4) omfatter: 1) tilføjelse af 1,5x PTU til embryoner før begyndelsen af melanogenese, 2) deforkortende PTU-behandlede embryoner på 2-3 dpf, 3) omhyggelig scr...

Metoden beskrevet heri beskriver en protokol til genetisk ablat retinal pigmentepitel (RPE) ved hjælp af larvezebrafisk. RPE strækker sig over bagsiden af øjet og befinder sig mellem de stratificerede lag af den neurale nethinde og det lag af vaskulatur, der udgør choroid. Trofisk støtte, absorption af fototoksisk lys og vedligeholdelse af visuelle cyklusproteiner er kun nogle af de kritiske funktioner, RPE udfører, der er afgørende for at opretholde sundheden og integriteten af disse tilstødende væv1. Skader på pattedyrs RPE kan repareres, når læsionerne er små2; Skader, der er lidt af større skader eller progressiv degenerativ sygdom, er imidlertid irreversible. Hos mennesker fører RPE-degenerative sygdomme (f.eks. Aldersrelateret makuladegeneration (AMD) og Stargardt-sygdom) til permanent synstab og, med få behandlingsmuligheder til rådighed, nedsat patientkvalitet. Den begrænsede evne for pattedyrs RPE til selvreparation har skabt et vidensgab inden for RPE-regenerative processer. I betragtning af zebrafiskens robuste regenerative kapacitet på tværs af mange forskellige vævstyper blev denne protokol udviklet til at etablere et in vivo-hvirveldyrsystem for at lette undersøgelser af iboende regenerering af RPE og afdække mekanismer, der driver dette svar. Ved hjælp af ablationsparadigmet, der er skitseret her, er den kanoniske Wnt-signalvej3, mTOR-vejen4 og immunrelaterede responser5 blevet identificeret som kritiske mediatorer for RPE-regenerering, sandsynligvis med overlappende funktioner.
I dette genetiske ablationsparadigme udtrykker Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 zebrafisk det bakterieafledte nitroreduktase (NTR/nfsB) gen6 smeltet sammen med eGFP under kontrol af RPE-forstærkerelementet, rpe65a7. Ablation opnås ved at tilsætte prodrug, metronidazol (MTZ), til systemvand, der huser zebrafisk. Intracellulær aktivering af MTZ ved nitroreductase resulterer i DNA-tværbinding og apoptose i NTR/nfsB-ekspressionerende celler 8,9. Denne teknologi er blevet anvendt i vid udstrækning i zebrafisk til at ablatere celler i nethinden 10,11,12,13 og andre væv 8. Tilsammen muliggør disse elementer målrettet ekspression (rpe65a) af en inducerbar celleablationsmetode (NTR/MTZ)8,9 og en fluorescerende markør (eGFP) til visualisering.
Der findes også andre interessante in vivo-modeller, der kan bruges til at studere RPE14's regenerative potentiale. Disse er brede og omfatter RPE-til-retina transdifferentiering post-retinektomi hos padder, hvor RPE-celler tabt til retinal genvækst erstattes15,16; RPE-restaurering efter skade i "super healing" MRL / MpJ-musen17; og eksogen stimulering af RPE-spredning i en rottemodel af spontan RPE og retinal degeneration18, blandt andre. Der er også udviklet in vitro-modeller, f.eks. voksne humane RPE-stamceller (RPESC'er)19. Disse modeller er alle værdifulde værktøjer, der arbejder for at afdække de cellulære processer relateret til RPE-regenerering (f.eks. Spredning, differentiering osv.); zebrafisken er dog unik i sin evne til iboende RPE-reparation efter ablation.
Mens metoden her er skrevet for at fokusere på at forstå de mekanismer, der driver RPE-regenerering, kan Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) -linjen og denne genetiske ablationsprotokol bruges til at studere andre cellulære processer såsom RPE-apoptose, RPE-degeneration og effekten af RPE-skade på tilstødende retinale og vaskulære væv. Ablationsprotokollen kan også ændres til at omfatte farmakologisk manipulation, hvilket er en bekvem foreløbig strategi til at screene signalveje af interesse. For eksempel har blokering af den kanoniske Wnt-vej ved hjælp af Inhibitor of Wnt Response-1 (IWR-1)20 vist sig at forringe RPE-regenerering3. Dette blev gentaget her for at guide brugerne gennem et farmakologisk manipulationseksperiment og tjene som proof-of-concept for at validere et MATLAB-script (RpEGEN), der blev oprettet for at kvantificere RPE-regenerering baseret på genopretning af pigmentering. Ligesom den transgene linje og ablationsprotokollen er RpEGEN-scripts tilpasningsdygtige og kan bruges til at kvantificere andre markører / cellulære processer inden for RPE.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lab Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>Catalog number is for 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond tip scribing pen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-254-51</td>
			<td>Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO) &#8805;99.7 %</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo incubator (large)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3720A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo incubator (mini/tabletop)</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Zoom.V16</td>
			<td>Or similar, with 488 nm excitation laser/filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-4</td>
			<td>Manufactured by Corning, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5.04462</td>
			<td>Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue (powder)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP117-100</td>
			<td>Also available as a premade aqeuous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metronidazole (MTZ)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M3761</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td>Chemical waste, proper disposal required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (powder packets)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Used to make 10 X PBS stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PRON-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>H2010</td>
			<td>Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>Or similar, with transmitted light illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Fine-tipped forceps for manual dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop rotator/shaker</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>SK-D1807-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z135003</td>
			<td>3.2 mL bulb draw, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>TRS1, TRS2, TRS5</td>
			<td>Also available from Fisher Scientific (NC0342409)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td>Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRAMM examples and how-tos</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td>
			<td>Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB support</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/support.html</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nitroreductase/metronidazole-mediated ablation and a matlab platform (rpegen) for studying regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium

Retinalpigmentepitelet (RPE) befinder sig på bagsiden af øjet og udfører funktioner, der er afgørende for at opretholde sundheden og integriteten af tilstødende retinale og vaskulære væv. På nuværende tidspunkt har den begrænsede reparative kapacitet hos pattedyrs RPE, som er begrænset til små skader, hindret fremskridt med hensyn til at forstå in vivo RPE regenerative processer. Her tilvejebringes en detaljeret metode til at lette undersøgelsen af in vivo RPE-reparation ved hjælp af zebrafisken, en hvirveldyrmodel, der er i stand til robust vævsregenerering. Denne protokol beskriver et transgent nitroreduktase/metronidazol (NTR/MTZ)-medieret skadesparadigme (rpe65a:nfsB-eGFP), som resulterer i ablation af de centrale to tredjedele af RPE efter 24 timers behandling med MTZ med efterfølgende vævsgenopretning. Der fokuseres på RPE-ablationer i larvezebrafisk, og metoder til test af farmakologiske forbindelsers virkninger på RPE-regenerering er også skitseret. Generering og validering af RpEGEN, et MATLAB-script oprettet for at automatisere kvantificering af RPE-regenerering baseret på pigmentering, diskuteres også. Ud over aktive RPE-reparationsmekanismer kan denne protokol udvides til undersøgelser af RPE-degeneration og skadesresponser samt virkningerne af RPE-skader på tilstødende retinale og vaskulære væv, blandt andre cellulære og molekylære processer. Dette zebrafiskesystem har et betydeligt løfte om at identificere gener, netværk og processer, der driver RPE-regenerering og RPE-sygdomsrelaterede mekanismer, med det langsigtede mål at anvende denne viden på pattedyrssystemer og i sidste ende mod terapeutisk udvikling.

Hæmning af den kanoniske Wnt-signalvej er kendt for signifikant at forringe zebrafisk RPE-regenerering ved hjælp af det genetiske ablationsparadigme (rpe65a: nfsB-eGFP) og farmakologisk manipulationsmetode (IWR-1) beskrevet i protokol3. Dette eksperiment blev gentaget her for at validere en automatiseret metode til kvantificering af zebrafisk RPE-regenerering baseret på pigmentering. Resultaterne opsummeret nedenfor omfattede alle trin i protokollen, fra befrugtningsdagen (0 dpf) til k...

Watch this Scientific Journal Video about Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

Denne protokol beskriver metoden til genetisk at ablate retinal pigmentepitel (RPE) ved hjælp af en transgen zebrafiskmodel. Tilpasning af protokollen til at inkorporere signalvejsmodulering ved hjælp af farmakologiske forbindelser er udførligt detaljeret. En MATLAB-platform til kvantificering af RPE-regenerering baseret på pigmentering blev udviklet og præsenteres og diskuteres.

Nitroreductase/metronidazolmedieret ablation og en MATLAB-platform (RpEGEN) til undersøgelse af regenerering af zebrafiskens retinale pigmentepitel

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

Zebrafisken er unik i sin iboende evne til at regenerere mange forskellige vævstyper, herunder RPE. Denne protokol kan bruges til at identificere molekylære veje, der driver RPE-regenerering og RPE-sygdomsrelaterede mekanismer. Alsidighed er en primær fordel ved denne metode.Ud over at studere RPE-regenerering kan denne protokol bruges til at undersøge RPE-degenerative processer og virkningerne af RPE-skader på tilstødende væv i øjet. Pattedyr, herunder mennesker, er ude af stand til at reparere store RPE-skader som følge af traumer eller degenerative sygdomme. Brug af zebrafisk som et redskab til at opdage RPE pro-regenerative faktorer er et vigtigt skridt i retning af at fremme pattedyrs RPE-regenerering.For at forberede en frisk 10 millimolær MTZ-opløsning, fem dage efter befrugtning, tilsættes MTZ-pulver til systemvand uden PTU og blandes grundigt ved kraftig omrystning i en time ved 37 grader Celsius. Afkøl 10 millimolær MTZ-opløsning i en time ved stuetemperatur på en bordplade rotator eller ryster. For at screene zebrafisklarver fra rpe65a:nsfB-eGFP-transgenet skal du adskille transgene eGFP-positive larver fra ikke-transgene eGFP-negative larver ved hjælp af et fluorescerende stereomikroskop med en 488 nanometer excitationslaser.Væk screenede larver med det samme ved at pipette direkte i en petriskål med frisk 1,5X PTU uden tricain. Efter afslutningen af screeningen adskilles de eGFP-positive larver yderligere i to grupper af petriskåle, en gruppe, der skal modtage MTZ-behandling, og en gruppe, der skal være den utilblerede kontrol. Derefter ablate retinal pigmentepitel ved at fjerne 1,5X PTU fra de ablated behandlingsretter og tilsæt den frisklavede 10 millimolære MTZ-opløsning.Fjern også 1,5X PTU fra de utilblated kontrolskåle og tilsæt frisk systemvand uden PTU. Fjern den 10 millimolære MTZ-opløsning efter nøjagtigt 24 timer, og tilsæt ferskvand uden PTU. Skift det friske systemvand uden PTU på MTZ negative retter.Screen eGFP positive larver på fire dage efter befrugtning. EGFP er synlig fire dage efter befrugtning, men ser ud til at være svagere end signalintensiteten på den femte dag. Anbring eGFP-positive larver i plader med seks brønde i stedet for petriskåle med en tæthed på højst 10 larver pr. Brønd til farmakologisk behandling.Udpeg separate seks-brøndsplader til ablated og unablated larver. Bestem volumenet af 15 mikromolære IWR-1 eller volumenmatchede DMSO-køretøjskontrolforbehandlinger, der er nødvendige, og aliquot 1,5X PTU i koniske rør i overensstemmelse hermed. Tilføj IWR-1-lager til 1,5X PTU for en endelig koncentration på 15 mikromolære IWR-1.Føj en matchet mængde DMSO-lager til 1,5X PTU. Bland godt ved hvirvel og bekræft visuelt opløsningen af forbindelser. Fjern 1,5X PTU fra de eGFP-positive larver i plader med seks brønde, og tilsæt fem milliliter pr. brønd frisklavede 0,06 % DMSO eller 15 mikromolære IWR-1-behandlinger.Ablat RPE den næste dag. På fem dage efter befrugtningen bestemmes mængden af farmakologiske behandlinger og køretøjskontrolbehandlinger, der er nødvendige for både utilblerede og ablated seksbrøndede plader og aliquot passende mængder af enten ferskvandsvand uden PTU eller 10 millimolær MTZ-opløsning i koniske rør. Tilføj IWR-1- og DMSO-stamopløsninger til de respektive koniske rør som tidligere udført.Bland godt ved hvirvel og bekræft visuelt opløsningen af forbindelser. Fjern 0,06% DMSO og 15 mikromolære IWR-1 forbehandlinger i 1,5X PTU fra udpegede utilblerede og ablated seks-brønds plader. Genopfyld med det passende ferskvand uden PTU- og MTZ-opløsningsbehandlinger.Fjern 0,06% DMSO og 15 mikromolære IWR-1 behandlinger i 10 millimolær MTZ-opløsning efter nøjagtigt 24 timer og genopfyld med behandlinger i ferskvand uden PTU. Genopfyld 0,06% DMSO og 15 mikromolære IWR-1-behandlinger i ferskvand uden PTU på den utilblated seks-brønds plade. Overvåg succesen og omfanget af ablation in vivo ved hjælp af transmitteret lysbelysning på et stereomikroskop til larvevedligeholdelse efter genetisk ablation.For at generere RPE-området af interesse eller ROI ved hjælp af Fiji skal du åbne et otte bit TIFF-billede, omorientere billedet, så den dorsale side er oppe, og distal er tilbage ved at vælge billede, transformere og vende vandret. For den sidste kommando skal du vælge den indstilling, der bedst passer til den retningsbestemthed, der er nødvendig for det pågældende billede. Start ROI manager ved at vælge analyser, værktøjer, ROI manager.Brug billede, zoom og skift mellem DAPI- og Brightfield-kanalerne. Brug tastaturgenveje til effektivitet. Identificer det punkt, hvor den apikale side af RPE støder op til spidsen af den ydre begrænsende membran, og brug dette anatomiske vartegn som ROI-udgangspunkt.Opret RPE ROI med polygonvalgsværktøjet i Fiji-værktøjslinjen ved hjælp af både DAPI- og Brightfield-billedkanalerne og billedzoomfunktionen til at identificere apikale og basale RPE-grænser. Bring de dorsale og ventrale ender af ROI til et skarpt punkt i stedet for at afstumpe eller afrunde. Tilføj ROI ved at klikke på tilføj i ROI manager.Gem ROI-filen ved at vælge mere og gem i ROI-manageren. Dobbeltklik på rpegen. m-fil, der skal åbnes i editorruden.Under den brugerdefinerede variabelsektion af rpegen. m fil, indtast mappeplaceringerne for mapper, der indeholder roi-filerne, tiff-billedfilerne, og hvor outputfiler skal gemmes. Angiv gruppenavnet på den måttefil, der skal eksporteres, og placeringen af Brightfield-kanalen i TIFF-billedstakken.Kør scriptet ved at klikke på knappen Kør i editormenuen øverst på MATLAB. Når du har gemt MAT-filen, vises en figur med tre paneler og gemmes også som en PDF i outputmappen for hver billedkørsel. Vent, indtil disse PDF-filer til kvalitetskontrol er gemt i outputmappen, og det sidste tal er forsvundet.Åbn de enkelte PDF-filer, og kontroller, at alle ROI'er matcher Brightfield-billederne. Dobbeltklik på rpegen_permplot. m-fil, der skal åbnes i en ny editorfane.Under afsnit 1-brugerdefinerede variabler skal du indtaste mappeplaceringen for outputmappen, der indeholder MAT-filerne fra at køre rpegen. m script. Indtast hvert MAT-filnavn, der skal indlæses.Kør dette afsnit af scriptet ved at klikke på knappen Kør sektion i editormenuen. I afsnit to skal du indtaste navnene på de to grupper til en statistisk sammenligning i data A- og data B-variablerne og angive antallet af permutationssimuleringsgentagelser i reps-variablen. Kun 2.000 reps blev brugt til denne demo for at reducere behandlingstiden.Kør dette afsnit af scriptet ved at klikke på knappen Kør sektion i editormenuen. Kør heat map figur og gruppér resultater og P-værdi sektioner uafhængigt ved hjælp af knappen Kør sektion. Hele mountskader af en fem-dages post-befrugtningslarve viste lys transgen ekspression i RPE på tidspunktet for screening for genetisk ablation.Tværgående kryosektion af utilbibelt seks-dages efterbefrugtningslarve viste, at transgenekspression var begrænset til modne RPE-celler med det lyseste udtryk begrænset til den centrale 2/3 af RPE. Pilespidser angiver apikale mikrovilli. Tværgående kryosektion af en ableret en-dags larve efter skade afslørede forstyrrelse af eGFP positiv cellemorfologi.Pile angiver pyknotiske kerner. Hele monteringsskader af utilblated syv-dages efter befrugtningslarver viste RPE-pigmentering i hele øjet, og ablerede to-dages larver efter skade viste en ablationszone uden pigment i den centrale RPE. Et plot genereret ved hjælp af RpEGEN viste lighed mellem de utilblated ni-dages dmso- og IWR-1-grupper efter befrugtning på tværs af RPE's længde.Handlingen viste den samlede lettere pixelintensitet i de ablated fire-dages DMSO- og IWR-1-grupper efter skaden, som syntes lettest i den ablerede IWR-1 sammenlignet med enhver anden behandlingsgruppe. Forskelle i central RPE-pigmentering var signifikante, når man sammenlignede ablerede IWR-1-behandlede larver med ablerede DMSO-behandlede kontroller. Ved hjælp af dette zebrafiskablationsparadigme har vi været i stand til at identificere flere molekylære signalveje, såsom vindsignalering, som vi har vist her, der er kritiske regulatorer for RPE-regenerering.

Research

JoVE Journal

Biology

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

MicroRNA Expression Profiler af menneskelige iPS celler, retinale pigmentepitel arvet fra iPS og Føtal retinale pigmentepitel

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea MNU-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea (MNU) -inducerede nethindedegeneration og Regeneration i zebrafisk: Histologisk og funktionelle egenskaber

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primære cellekulturer fra mus retinale Pigment epitel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Isolering af primære muse retinale pigmenterede epitelceller

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Effektiv og konsistent generering af retinal pigmentepitel / choroid flatmounts fra menneskelige øjne til histologisk analyse

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...