Name: nitroreductase/metronidazole-mediated ablation and a matlab platform (rpegen) for studying regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium
Uploaded: 2022-03-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Het hierin beschreven werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (RO1-EY29410 tot J.M.G, en NIH CORE Grant P30-EY08098 tot de afdeling Oogheelkunde); het UPMC Immune Transplant & Therapy Center (aan L.L.L. en J.M.G.); en de E. Ronald Salvitti-leerstoel in oogheelkundig onderzoek (aan J.M.G.). Aanvullende steun werd ontvangen van de Wiegand Fellowship in Ophthalmology (aan L.L.L), de Eye & Ear Foundation of Pittsburgh, en een onbeperkte subsidie van Research to Prevent Blindness, New York, NY. Auteurs willen ook Amanda Platt bedanken voor technische assistentie en Dr. Hugh Hammer en het aquatische personeel voor uitstekende ondersteuning van de dierenverzorging.

Alle hierin beschreven methodologieën voldoen aan het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Pittsburgh.
1. Voorbereiding voorafgaand aan het verzamelen van zebravisembryo's
<ol><li>Stel de embryo-incubator in op 28,5°C.</li>
	<li>Bereid een 25x stockoplossing van de melanogeneseremmer, N-fenylethiourea (PTU)21,22. Deze stamoplossing wordt geschaald op basis van een gan...

Dit protocol beschrijft methodologie om de RPE genetisch te aborteren en bestudeert mechanismen van degeneratie en regeneratie bij larvale-oude zebravissen. Dit protocol is ook met succes uitgevoerd bij volwassen zebravissen3, maar met minder uitgebreide karakterisering, daarom zijn larven hier de focus. Kritische aspecten van dit deel van het protocol (stappen 1-4) omvatten: 1) het toevoegen van 1,5x PTU aan embryo's voorafgaand aan het begin van melanogenese, 2) het dechorioneren van met PTU beh...

De hierin beschreven methodologie beschrijft een protocol om het retinale pigmentepitheel (RPE) genetisch te aborteren met behulp van larvale zebravissen. De RPE strekt zich uit over de achterkant van het oog en bevindt zich tussen de gelaagde lagen van het neurale netvlies en de laag vasculatuur die het vaatvlies vormt. Trofische ondersteuning, absorptie van fototoxisch licht en onderhoud van visuele cycluseiwitten zijn slechts enkele van de kritieke functies die de RPE uitvoert en die essentieel zijn voor het behoud van de gezondheid en integriteit van deze aangrenzende weefsels1. Schade aan RPE bij zoogdieren is te herstellen wanneer laesies klein zijn2; schade geleden door grotere verwondingen of progressieve degeneratieve ziekte is echter onomkeerbaar. Bij mensen leiden RPE-degeneratieve ziekten (bijv. leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) en de ziekte van Stargardt) tot permanent verlies van het gezichtsvermogen en, met weinig beschikbare behandelingsopties, verminderde kwaliteit van leven van de patiënt. Het beperkte vermogen van RPE bij zoogdieren om zichzelf te herstellen heeft een kenniskloof gecreëerd op het gebied van RPE-regeneratieve processen. Gezien het robuuste regeneratieve vermogen van de zebravis in veel verschillende weefseltypen, is dit protocol ontwikkeld om een in vivo gewerveld systeem op te zetten om studies naar intrinsiek regenererende RPE te vergemakkelijken en mechanismen bloot te leggen die die respons stimuleren. Met behulp van het hier geschetste ablatieparadigma zijn de canonieke Wnt-signaleringsroute3, de mTOR-route4 en immuungerelateerde responsen5 geïdentificeerd als kritieke mediatoren van RPE-regeneratie, waarschijnlijk met overlappende functies.
In dit genetische ablatieparadigma brengen Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 zebravissen het bacteriële nitroreductase (NTR/nfsB) gen6 tot expressie, gefuseerd met eGFP onder controle van het RPE-versterkerelement, rpe65a7. Ablatie wordt bereikt door de prodrug, metronidazol (MTZ), toe te voegen aan het systeemwater dat zebravissen huisvest. Intracellulaire activering van MTZ door nitroreductase resulteert in DNA-crosslinking en apoptose in NTR/nfsB-tot expressie brengende cellen 8,9. Deze technologie is veel gebruikt in zebravissen om cellen van het netvlies10,11,12,13 en andere weefsels te aborteren8. Samen maken deze elementen gerichte expressie (rpe65a) van een induceerbare celablatiemethodologie (NTR/MTZ)8,9 en een fluorescerende marker (eGFP) voor visualisatie mogelijk.
Er bestaan ook andere interessante in vivo modellen die kunnen worden gebruikt om het regeneratieve potentieel van de RPE14 te bestuderen. Deze zijn breed en omvatten RPE-naar-retina transdifferentiatie post-retinectomie bij amfibieën, waarbij RPE-cellen die verloren gaan aan retinale hergroei worden vervangen15,16; RPE restauratie na letsel in de "super healing" MRL/MpJ muis17; en exogene stimulatie van RPE-proliferatie in een rattenmodel van spontane RPE en retinale degeneratie18, onder anderen. Er zijn ook in vitro modellen ontwikkeld, zoals volwassen menselijke RPE-stamcellen (RPESCs)19. Deze modellen zijn allemaal waardevolle hulpmiddelen die werken aan het blootleggen van de cellulaire processen die verband houden met RPE-regeneratie (bijv. Proliferatie, differentiatie, enz.); de zebravis is echter uniek in zijn vermogen tot intrinsiek RPE-herstel na ablatie.
Hoewel de methodologie hier is geschreven om zich te concentreren op het begrijpen van de mechanismen die RPE-regeneratie aansturen, kunnen de Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) - lijn en dit genetische ablatieprotocol worden gebruikt om andere cellulaire processen te bestuderen, zoals RPE-apoptose, RPE-degeneratie en het effect van RPE-letsel op aangrenzende retinale en vasculaire weefsels. Het ablatieprotocol kan ook worden gewijzigd om farmacologische manipulatie op te nemen, wat een handige voorlopige strategie is om signaalroutes van belang te screenen. Het blokkeren van de canonieke Wnt-route met behulp van Inhibitor of Wnt Response-1 (IWR-1)20, is bijvoorbeeld aangetoond dat het de RPE-regeneratie3 schaadt. Dit werd hier herhaald om gebruikers door een farmacologisch manipulatie-experiment te leiden en als proof-of-concept te dienen om een MATLAB-script (RpEGEN) te valideren dat is gemaakt om RPE-regeneratie te kwantificeren op basis van herstel van pigmentatie. Net als de transgene lijn en het ablatieprotocol zijn de RpEGEN-scripts aanpasbaar en kunnen ze worden gebruikt om andere markers / cellulaire processen binnen de RPE te kwantificeren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lab Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>Catalog number is for 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond tip scribing pen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-254-51</td>
			<td>Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO) &#8805;99.7 %</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo incubator (large)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3720A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo incubator (mini/tabletop)</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Zoom.V16</td>
			<td>Or similar, with 488 nm excitation laser/filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-4</td>
			<td>Manufactured by Corning, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5.04462</td>
			<td>Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue (powder)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP117-100</td>
			<td>Also available as a premade aqeuous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metronidazole (MTZ)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M3761</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td>Chemical waste, proper disposal required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (powder packets)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Used to make 10 X PBS stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PRON-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>H2010</td>
			<td>Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>Or similar, with transmitted light illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Fine-tipped forceps for manual dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop rotator/shaker</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>SK-D1807-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z135003</td>
			<td>3.2 mL bulb draw, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>TRS1, TRS2, TRS5</td>
			<td>Also available from Fisher Scientific (NC0342409)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td>Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRAMM examples and how-tos</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td>
			<td>Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB support</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/support.html</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nitroreductase/metronidazole-mediated ablation and a matlab platform (rpegen) for studying regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium

Het retinale pigmentepitheel (RPE) bevindt zich aan de achterkant van het oog en vervult functies die essentieel zijn voor het behoud van de gezondheid en integriteit van aangrenzende retinale en vasculaire weefsels. Op dit moment heeft de beperkte herstelcapaciteit van RPE bij zoogdieren, die beperkt is tot kleine verwondingen, de vooruitgang in het begrijpen van in vivo RPE regeneratieve processen belemmerd. Hier wordt een gedetailleerde methodologie gegeven om de studie van in vivo RPE-reparatie met behulp van de zebravis te vergemakkelijken, een gewerveld model dat in staat is tot robuuste weefselregeneratie. Dit protocol beschrijft een transgeen nitroreductase/metronidazol (NTR/MTZ)-gemedieerd letselparadigma (rpe65a:nfsB-eGFP), dat resulteert in ablatie van de centrale tweederde van de RPE na 24 uur behandeling met MTZ, met daaropvolgend weefselherstel. De nadruk wordt gelegd op RPE-ablaties in larvale zebravissen en methoden voor het testen van de effecten van farmacologische verbindingen op RPE-regeneratie worden ook geschetst. Generatie en validatie van RpEGEN, een MATLAB-script dat is gemaakt om de kwantificering van RPE-regeneratie op basis van pigmentatie te automatiseren, wordt ook besproken. Naast actieve RPE-reparatiemechanismen kan dit protocol worden uitgebreid naar studies van RPE-degeneratie en letselresponsen, evenals de effecten van RPE-schade op aangrenzende retinale en vasculaire weefsels, naast andere cellulaire en moleculaire processen. Dit zebravissysteem is veelbelovend bij het identificeren van genen, netwerken en processen die RPE-regeneratie en RPE-ziektegerelateerde mechanismen aansturen, met het langetermijndoel om deze kennis toe te passen op zoogdiersystemen en, uiteindelijk, in de richting van therapeutische ontwikkeling.

Het is bekend dat het remmen van de canonieke Wnt-signaleringsroute de RPE-regeneratie van zebravissen aanzienlijk schaadt met behulp van het genetische ablatieparadigma (rpe65a: nfsB-eGFP) en farmacologische manipulatiemethodologie (IWR-1) beschreven in het protocol3. Dit experiment werd hier herhaald om een geautomatiseerde methode te valideren voor het kwantificeren van zebravis RPE-regeneratie op basis van pigmentatie. De hieronder samengevatte resultaten omvatten alle stappen van het...

Watch this Scientific Journal Video about Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

Dit protocol beschrijft de methodologie om het retinale pigmentepitheel (RPE) genetisch te aborteren met behulp van een transgeen zebravismodel. Het aanpassen van het protocol om signaleringsroutemodulatie met behulp van farmacologische verbindingen op te nemen, is uitgebreid gedetailleerd. Een MATLAB-platform voor het kwantificeren van RPE-regeneratie op basis van pigmentatie werd ontwikkeld en wordt gepresenteerd en besproken.

Nitroreductase/metronidazol-gemedieerde ablatie en een MATLAB-platform (RpEGEN) voor het bestuderen van regeneratie van het retinale pigmentepitheel van de zebravis

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

De zebravis is uniek in zijn intrinsieke vermogen om veel verschillende weefseltypen te regenereren, waaronder de RPE. Dit protocol kan worden gebruikt om moleculaire routes te identificeren die RPE-regeneratie en RPE-ziektegerelateerde mechanismen aansturen. Veelzijdigheid is een belangrijk voordeel van deze methodiek.Naast het bestuderen van RPE-regeneratie, kan dit protocol worden gebruikt om RPE-degeneratieve processen en de effecten van RPE-schade op aangrenzende weefsels in het oog te onderzoeken. Zoogdieren, inclusief mensen, zijn niet in staat om grote RPE-verwondingen als gevolg van trauma of degeneratieve ziekten te herstellen. Het gebruik van zebravissen als een hulpmiddel om RPE pro-regeneratieve factoren te ontdekken, is een belangrijke stap in de richting van het bevorderen van RPE-regeneratie bij zoogdieren.Om een verse 10 millimolaire MTZ-oplossing te bereiden, vijf dagen na de bevruchting, voegt u MTZ-poeder toe aan systeemwater zonder PTU en mengt u grondig door krachtig te schudden gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Koel 10 millimolaire MTZ-oplossing gedurende één uur bij kamertemperatuur op een tafelrotator of shaker. Om zebravislarven van het rpe65a:nsfB-eGFP-transgen te screenen, scheidt u transgene eGFP-positieve larven van niet-transgene eGFP-negatieve larven met behulp van een fluorescerende stereomicroscoop met een excitatielaser van 488 nanometer.Wek gescreende larven onmiddellijk op door direct te pipetteren in een petrischaaltje met verse 1,5X PTU zonder tricaïne. Na voltooiing van de screening, scheid de eGFP-positieve larven verder in twee groepen petrischalen, één groep om MTZ-behandeling te krijgen en één groep om de niet-aangegeven controle te zijn. Verwijder vervolgens het retinale pigmentepitheel door 1,5x PTU uit de geableerde behandelingsschotels te verwijderen en voeg de vers gemaakte 10 millimolaire MTZ-oplossing toe.Verwijder ook 1,5x PTU uit de niet-opgeluchte controleschalen en voeg vers systeemwater toe zonder PTU. Verwijder de 10 millimolaire MTZ-oplossing na precies 24 uur en voeg vers systeemwater toe zonder PTU. Ververs het verse systeemwater zonder PTU op de MTZ-negatieve gerechten.Screen eGFP positieve larven op vier dagen na de bevruchting. De eGFP is vier dagen na de bevruchting zichtbaar, maar lijkt op de vijfde dag zwakker dan de signaalintensiteit. Plaats eGFP-positieve larven in platen met zes putten in plaats van petrischalen met een dichtheid van niet meer dan 10 larven per put voor farmacologische behandeling.Wijs afzonderlijke platen met zes putten aan voor ablated en niet-aangegeven larven. Bepaal het volume van 15 micromolaire IWR-1 of volume-afgestemde DMSO-voertuigcontrolevoorbehandelingen die nodig zijn en aliquot 1,5X PTU in conische buizen dienovereenkomstig. Voeg IWR-1-voorraad toe aan 1,5x PTU voor een uiteindelijke concentratie van 15 micromolaire IWR-1.Voeg een overeenkomend volume DMSO-voorraad toe aan 1,5x PTU. Meng goed door vortexing en bevestig visueel het oplossen van verbindingen. Verwijder 1,5x PTU uit de eGFP-positieve larven in zes-well platen en voeg vijf milliliter per put vers gemaakte 0,06% DMSO of 15 micromolaire IWR-1 behandelingen toe.Ablate de RPE de volgende dag. Bepaal vijf dagen na de bevruchting het volume farmacologische en voertuigcontrolebehandelingen die nodig zijn voor zowel niet-aangegeven als geableerde zesputplaten en aliquot geschikte volumes zoet systeemwater zonder PTU of 10 millimolar MTZ-oplossing in conische buizen. Voeg IWR-1 en DMSO stockoplossingen toe aan de respectievelijke conische buizen zoals eerder uitgevoerd.Meng goed door vortexing en bevestig visueel het oplossen van verbindingen. Verwijder 0,06% DMSO en 15 micromolaire IWR-1 voorbehandelingen in 1,5X PTU van aangewezen niet-gebleerde en geableerde zes-well platen. Vul aan met het juiste verse systeemwater zonder PTU- en MTZ-oplossingsbehandelingen.Verwijder 0,06% DMSO en 15 micromolaire IWR-1 behandelingen in 10 millimolaire MTZ-oplossing na precies 24 uur en vul aan met behandelingen in vers systeemwater zonder PTU. Vul 0,06% DMSO en 15 micromolaire IWR-1-behandelingen aan in zoet systeemwater zonder PTU op de niet-aangegeven zesputtenplaat. Monitor het succes en de omvang van ablatie in vivo met behulp van doorgelaten lichtverlichting op een stereomicroscoop voor larvaal onderhoud post-genetische ablatie.Als u het interessante RPE-gebied of de ROI wilt genereren met Fiji, opent u een acht-bits TIFF-afbeelding, heroriënteert u de afbeelding zodat de dorsale zijde omhoog is en distal wordt achtergelaten door afbeelding te kiezen, te transformeren en horizontaal om te draaien. Kies voor de laatste opdracht de optie die het beste past bij de directionaliteit die nodig is voor die afbeelding. Start de ROI manager door te kiezen voor analyse, tools, ROI manager.Gebruik afbeelding, zoom en schakel tussen de DAPI- en Brightfield-kanalen. Gebruik sneltoetsen voor efficiëntie. Identificeer het punt waarop de apicale kant van de RPE grenst aan de punt van het buitenste begrenzingsmembraan en gebruik dit anatomische oriëntatiepunt als het ROI-startpunt.Maak de RPE ROI met het gereedschap polygoonselecties op de Fiji-werkbalk met behulp van zowel de DAPI- als Brightfield-afbeeldingskanalen en de beeldzoomfunctie om apicale en basale RPE-grenzen te identificeren. Breng de dorsale en ventrale uiteinden van de ROI naar een scherp punt in plaats van af te stompen of af te ronden. Voeg de ROI toe door in de ROI manager op toevoegen te klikken.Sla het ROI-bestand op door meer te kiezen en bespaar binnen de ROI-manager. Dubbelklik op de rpegen. m-bestand te openen in het editorvenster.Onder de door de gebruiker gedefinieerde variabele sectie van de rpegen. m-bestand, voer de maplocaties in voor mappen met de roi-bestanden, de tiff-afbeeldingsbestanden en waar uitvoerbestanden moeten worden opgeslagen. Voer de groepsnaam in voor het matbestand dat moet worden geëxporteerd en de locatie van het Brightfield-kanaal in de TIFF-afbeeldingsstapel.Voer het script uit door op de knop Uitvoeren in het editormenu boven aan MATLAB te klikken. Na het opslaan van het MAT-bestand verschijnt er een figuur met drie panelen en wordt deze ook opgeslagen als PDF in de uitvoermap voor elke afbeeldingsrun. Wacht totdat deze kwaliteitscontrole-PDF's zijn opgeslagen in de uitvoermap en het laatste cijfer is verdwenen.Open de afzonderlijke PDF's en controleer of alle ROI's overeenkomen met de Brightfield-afbeeldingen. Dubbelklik op de rpegen_permplot. m bestand te openen in een nieuw editortabblad.Voer onder sectie door één gebruiker gedefinieerde variabelen de maplocatie in voor de uitvoermap met de MAT-bestanden van het uitvoeren van de rpegen. m script. Voer elke MAT-bestandsnaam in die moet worden geladen.Voer dit gedeelte van het script uit door op de knop Uitvoeren in het editormenu te klikken. Voer in deel twee de namen van de twee groepen in voor een statistische vergelijking in de variabelen gegevens A en B en geef het aantal herhalingen van permutatiesimulaties in de variabele reps aan. Slechts 2.000 herhalingen werden gebruikt voor deze demo om de verwerkingstijd te verkorten.Voer dit gedeelte van het script uit door op de knop Uitvoeren in het editormenu te klikken. Voer heatmap-figuur- en groepsresultaten en P-waardesecties onafhankelijk van elkaar uit met behulp van de knop Sectie uitvoeren. Hele mount schade van een vijf dagen na de bevruchting larve vertoonde heldere transgene expressie in de RPE op het moment van screening op genetische ablatie.Transversale cryosectie van niet-geobleerde zesdaagse post-bevruchtingslarve toonde aan dat transgene expressie beperkt was tot volwassen RPE-cellen met de helderste expressie beperkt tot de centrale 2/3 van de RPE. Pijlpunten geven apicale microvilli aan. Transversale cryosectie van een geableerde eendaagse post-verwondingslarve onthulde verstoring van de eGFP-positieve celmorfologie.Pijlen geven pyknotische kernen aan. Hele mount schade van niet-aangegeven zeven dagen na de bevruchting larven vertoonde RPE pigmentatie door het hele oog en ablated twee dagen post-verwonding larven vertoonden een ablatiezone afwezig pigment in de centrale RPE. Een plot gegenereerd met behulp van RpEGEN vertoonde gelijkenis tussen de niet-gesynchroniseerde negendaagse dmso- en IWR-1-groepen na de bevruchting over de lengte van de RPE.De plot toonde een algehele lichtere pixelintensiteit in de ablated vierdaagse DMSO- en IWR-1-groepen na het letsel, die het lichtst leken in de geableerde IWR-1 in vergelijking met elke andere behandelingsgroep. Verschillen in centrale RPE-pigmentatie waren significant bij het vergelijken van met Ablated IWR-1 behandelde larven met met ablated DMSO behandelde controles. Met behulp van dit zebravisablatieparadigma zijn we in staat geweest om verschillende moleculaire signaalroutes te identificeren, zoals windsignalering die we hier hebben laten zien, die kritieke regulatoren zijn van RPE-regeneratie.

Research

JoVE Journal

Biology

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Een systeem voor het kweken van Iris pigment epitheelcellen aan Lens Regeneratie Study in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Laser Ablatie van de zebravis Pronephros renale epitheliale regeneratie Study

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

MicroRNA expressie profielen van de Mens iPS cellen, retinale pigment epitheel Derived From iPS en Foetale retinale pigment epitheel

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea MNU-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methyl- (MNU) geïnduceerde retinale degeneratie en regeneratie in de zebravis: histologische en functionele kenmerken

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primaire celculturen van de muis retinale Pigment epitheel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Isolatie van primaire retinale gepigmenteerde epitheelcellen van muizen

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Efficiënte en consistente generatie van retinale pigmentepitheel / choroïde flatmounts uit menselijke ogen voor histologische analyse

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Caudal Peduncle Cryoinjury in Adult Zebrafish

A Cryoinjury Model for Studying Skeletal Muscle Regeneration of the Caudal Peduncle in Adult Zebrafish

A Cryoinjury Model for Studying Skeletal Muscle Regeneration of the Caudal Peduncle in Adult Zebrafish (Video) | JoVE 

Een cryoletselmodel voor het bestuderen van skeletspierregeneratie van de caudale steel bij volwassen zebravissen

Skeletal muscle undergoes renewal and restoration after minor injury through the activation of satellite-like stem cells. Severe injuries of the ...

Modeling and Analyzing Retinal Degeneration

LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

Unraveling the Pathogenesis of Age-Related Macular Degeneration and Discovering Potential Therapies (Video) | JoVE

LipidUNet-Machine Learning-gebaseerde methode voor karakterisering en kwantificering van lipideafzettingen met behulp van iPSC-afgeleid retinaal pigmentepitheel