Name: nitroreductase/metronidazole-mediated ablation and a matlab platform (rpegen) for studying regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium
Uploaded: 2022-03-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Les travaux décrits ici ont été soutenus par les National Institutes of Health (RO1-EY29410 à J.M.G, et NIH CORE Grant P30-EY08098 au Département d’ophtalmologie); le Centre de transplantation immunitaire et de thérapie upMC (à L.L.L. et J.M.G.); et la Chaire E. Ronald Salvitti en recherche en ophtalmologie (à J.M.G.). Un soutien supplémentaire a été reçu de la bourse Wiegand en ophtalmologie (à L.L.L), de la Fondation Eye & Ear de Pittsburgh et d’une subvention sans restriction de Research to Prevent Blindness, New York, NY. Les auteurs tiennent également à remercier Amanda Platt pour son aide technique et le Dr Hugh Hammer et le personnel aquatique pour l’excellent soutien en matière de soins aux animaux.

Toutes les méthodologies décrites dans le présent document sont conformes à l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Pittsburgh.
1. Préparation avant la collecte d’embryons de poisson zèbre
<ol><li>Réglez l’incubateur d’embryons à 28,5 °C.</li>
	<li>Préparer une solution mère 25x de l’inhibiteur de la mélanogenèse, la N-phénylthiourée (PTU)21,22. Ce...

Ce protocole décrit la méthodologie pour ablation génétique de l’EPR et étudie les mécanismes de dégénérescence et de régénération chez les poissons-zèbres d’âge larvaire. Ce protocole a également été réalisé avec succès chez le poisson-zèbre adulte3, mais avec une caractérisation moins étendue, c’est pourquoi les larves sont au centre de l’attention ici. Les aspects critiques de cette partie du protocole (étapes 1 à 4) comprennent: 1) l’ajout de 1,5x PTU aux emb...

La méthodologie décrite ici détaille un protocole pour ablation génétique de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à l’aide de larves de poisson-zèbre. L’EPR s’étend sur l’arrière de l’œil et réside entre les couches stratifiées de la rétine neurale et la couche de vascularisation constituant la choroïde. Le soutien trophique, l’absorption de la lumière phototoxique et le maintien des protéines du cycle visuel ne sont que quelques-unes des fonctions critiques de l’EPR qui sont essentielles au maintien de la santé et de l’intégrité de ces tissus adjacents1. Les dommages causés à l’EPR chez les mammifères sont réparables lorsque les lésions sont petites2; cependant, les dommages subis par des blessures plus importantes ou une maladie dégénérative progressive sont irréversibles. Chez l’homme, les maladies dégénératives de l’EPR (p. ex., la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) et la maladie de Stargardt) entraînent une perte de vision permanente et, avec peu d’options de traitement disponibles, une diminution de la qualité de vie des patients. La capacité limitée des RPE des mammifères à s’auto-réparer a créé un manque de connaissances dans le domaine des processus de régénération des EPR. Compte tenu de la capacité de régénération robuste du poisson-zèbre dans de nombreux types de tissus différents, ce protocole a été développé pour établir un système de vertébrés in vivo afin de faciliter les études sur l’EPR à régénération intrinsèque et de découvrir les mécanismes qui déterminent cette réponse. En utilisant le paradigme d’ablation décrit ici, la voie de signalisation canonique Wnt3, la voie mTOR4 et les réponses immunitaires5 ont été identifiées comme des médiateurs critiques de la régénération de l’EPR, probablement avec des fonctions qui se chevauchent.
Dans ce paradigme d’ablation génétique, le poisson-zèbre Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 exprime le gène6 de la nitroréductase dérivée de bactéries (NTR/nfsB) fusionné à l’eGFP sous le contrôle de l’élément amplificateur RPE, rpe65a7. L’ablation est obtenue en ajoutant le promédicament, le métronidazole (MTZ), à l’eau du système abritant le poisson-zèbre. L’activation intracellulaire de MTZ par la nitroréductase entraîne la réticulation de l’ADN et l’apoptose dans les cellules exprimant NTR/nfsB 8,9. Cette technologie a été largement utilisée chez le poisson-zèbre pour ablation des cellules de la rétine 10,11,12,13 et d’autres tissus 8. Ensemble, ces éléments permettent l’expression ciblée (rpe65a) d’une méthodologie d’ablation cellulaire inductible (NTR/MTZ)8,9 et d’un marqueur fluorescent (eGFP) pour la visualisation.
Il existe également d’autres modèles in vivo intéressants qui peuvent être utilisés pour étudier le potentiel de régénération de l’EPR14. Ceux-ci sont larges et comprennent la transdifférenciation de l’EPR à la rétine après la rétinbectomie chez les amphibiens, dans laquelle les cellules d’EPR perdues par la repousse rétinienne sont remplacées15,16; Restauration de l’EPR après une blessure chez la souris LMR/MpJ « super cicatrisante »17; et stimulation exogène de la prolifération de l’EPR chez un modèle de rat d’EPR spontanée et de dégénérescence rétinienne18, entre autres. Des modèles in vitro, tels que les cellules souches EPR humaines adultes (CSP)19 ont également été mis au point. Ces modèles sont tous des outils précieux qui permettent de découvrir les processus cellulaires liés à la régénération de l’EPR (p. ex., prolifération, différenciation, etc.); cependant, le poisson-zèbre est unique dans sa capacité de réparation intrinsèque de l’EPR après l’ablation.
Bien que la méthodologie ici soit écrite pour se concentrer sur la compréhension des mécanismes à l’origine de la régénération de l’EPR, la lignée Tg(rpe65a:nfsB-eGFP) et ce protocole d’ablation génétique pourraient être utilisés pour étudier d’autres processus cellulaires tels que l’apoptose de l’EPR, la dégénérescence de l’EPR et l’effet des lésions de l’EPR sur les tissus rétiniens et vasculaires adjacents. Le protocole d’ablation peut également être modifié pour inclure la manipulation pharmacologique, qui est une stratégie préliminaire pratique pour dépister les voies de signalisation d’intérêt. Par exemple, il a été démontré que le blocage de la voie Wnt canonique à l’aide de l’inhibiteur de la réponse Wnt-1 (IWR-1)20 altère la régénération del’EPR 3. Cela a été répété ici pour guider les utilisateurs à travers une expérience de manipulation pharmacologique et servir de preuve de concept pour valider un script MATLAB (RpEGEN) créé pour quantifier la régénération RPE basée sur la récupération de la pigmentation. Comme la lignée transgénique et le protocole d’ablation, les scripts RpEGEN sont adaptables et pourraient être utilisés pour quantifier d’autres marqueurs / processus cellulaires au sein de l’EPR.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Lab Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>Catalog number is for 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond tip scribing pen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-254-51</td>
			<td>Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO) &#8805;99.7 %</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo incubator (large)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3720A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo incubator (mini/tabletop)</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Zoom.V16</td>
			<td>Or similar, with 488 nm excitation laser/filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-4</td>
			<td>Manufactured by Corning, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5.04462</td>
			<td>Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue (powder)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP117-100</td>
			<td>Also available as a premade aqeuous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metronidazole (MTZ)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M3761</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td>Chemical waste, proper disposal required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (powder packets)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Used to make 10 X PBS stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PRON-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>H2010</td>
			<td>Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>Or similar, with transmitted light illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Fine-tipped forceps for manual dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop rotator/shaker</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>SK-D1807-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z135003</td>
			<td>3.2 mL bulb draw, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>TRS1, TRS2, TRS5</td>
			<td>Also available from Fisher Scientific (NC0342409)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td>Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRAMM examples and how-tos</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td>
			<td>Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB support</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/support.html</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nitroreductase/metronidazole-mediated ablation and a matlab platform (rpegen) for studying regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) réside à l’arrière de l’œil et remplit des fonctions essentielles au maintien de la santé et de l’intégrité des tissus rétiniens et vasculaires adjacents. À l’heure actuelle, la capacité réparatrice limitée de l’EPR des mammifères, qui se limite aux petites blessures, a entravé les progrès dans la compréhension des processus de régénération de l’EPR in vivo . Ici, une méthodologie détaillée est fournie pour faciliter l’étude de la réparation in vivo de l’EPR à l’aide du poisson-zèbre, un modèle de vertébré capable d’une régénération tissulaire robuste. Ce protocole décrit un paradigme de lésion transgénique médié par la nitroréductase / métronidazole (NTR / MTZ) (rpe65a: nfsB-eGFP), qui entraîne l’ablation des deux tiers centraux de l’EPR après un traitement de 24 heures par MTZ, avec récupération tissulaire ultérieure. L’accent est mis sur les ablations de l’EPR chez les larves de poisson-zèbre et les méthodes de test des effets des composés pharmacologiques sur la régénération de l’EPR sont également décrites. La génération et la validation de RpEGEN, un script MATLAB créé pour automatiser la quantification de la régénération RPE basée sur la pigmentation, sont également abordées. Au-delà des mécanismes actifs de réparation de l’EPR, ce protocole peut être étendu aux études de la dégénérescence de l’EPR et des réponses aux blessures, ainsi que des effets des lésions de l’EPR sur les tissus rétiniens et vasculaires adjacents, entre autres processus cellulaires et moléculaires. Ce système de poisson-zèbre est très prometteur dans l’identification des gènes, des réseaux et des processus qui stimulent la régénération de l’EPR et les mécanismes liés à la maladie de l’EPR, dans le but à long terme d’appliquer ces connaissances aux systèmes mammifères et, en fin de compte, au développement thérapeutique.

L’inhibition de la voie canonique de signalisation Wnt est connue pour nuire de manière significative à la régénération de l’EPR du poisson-zèbre en utilisant le paradigme d’ablation génétique (rpe65a:nfsB-eGFP) et la méthodologie de manipulation pharmacologique (IWR-1) décrite dans le protocole3. Cette expérience a été répétée ici pour valider une méthode automatisée de quantification de la régénération RPE du poisson-zèbre basée sur la pigmentation. Les rés...

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Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

Ce protocole décrit la méthodologie pour ablation génétique de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à l’aide d’un modèle transgénique de poisson-zèbre. L’adaptation du protocole pour incorporer la modulation de la voie de signalisation à l’aide de composés pharmacologiques est très détaillée. Une plate-forme MATLAB pour quantifier la régénération RPE basée sur la pigmentation a été développée et est présentée et discutée.

Ablation médiée par la nitroréductase/métronidazole et une plate-forme MATLAB (RpEGEN) pour l’étude de la régénération de l’épithélium pigmentaire rétinien du poisson-zèbre

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

Le poisson-zèbre est unique dans sa capacité intrinsèque à régénérer de nombreux types de tissus différents, y compris l’EPR. Ce protocole peut être utilisé pour identifier les voies moléculaires qui conduisent à la régénération de l’EPR et aux mécanismes liés à la maladie de l’EPR. La polyvalence est l’un des principaux avantages de cette méthodologie.En plus d’étudier la régénération de l’EPR, ce protocole peut être utilisé pour examiner les processus dégénératifs de l’EPR et les effets des dommages causés par l’EPR sur les tissus adjacents de l’œil. Les mammifères, y compris les humains, sont incapables de réparer les blessures d’EPR importantes résultant d’un traumatisme ou d’une maladie dégénérative. L’utilisation du poisson-zèbre comme outil pour découvrir les facteurs pro-régénération de l’EPR est une étape importante vers la promotion de la régénération de l’EPR chez les mammifères.Pour préparer une solution fraîche de MTZ de 10 millimolaires, cinq jours après la fertilisation, ajoutez de la poudre de MTZ à l’eau du système sans PTU et mélangez soigneusement en agitant vigoureusement pendant une heure à 37 degrés Celsius. Refroidir la solution MTZ de 10 millimolaires pendant une heure à température ambiante sur un rotateur ou un agitateur de table. Pour dépister les larves de poisson zèbre du transgène rpe65a:nsfB-eGFP, séparez les larves transgéniques positives eGFP des larves négatives eGFP non transgéniques à l’aide d’un stéréomicroscope fluorescent avec un laser d’excitation de 488 nanomètres.Réveillez immédiatement les larves filtrées en pipetant directement dans une boîte de Pétri avec 1,5X PTU frais sans tricaïne. À la fin du dépistage, séparez davantage les larves positives à l’eGFP en deux groupes de boîtes de Pétri, un groupe pour recevoir un traitement MTZ et un groupe pour être le témoin non atténué. Ensuite, ablation de l’épithélium pigmentaire rétinien en retirant 1,5X PTU des plats de traitement ablés et ajouter la solution de MTZ de 10 millimolaires fraîchement préparée.Retirez également 1,5X PTU des plats de contrôle non atablés et ajoutez de l’eau fraîche du système sans PTU. Retirez la solution MTZ de 10 millimolaires après exactement 24 heures et ajoutez de l’eau fraîche du système sans PTU. Changez l’eau fraîche du système sans PTU sur les plats négatifs MTZ.Dépister les larves eGFP positives quatre jours après la fécondation. L’eGFP est visible quatre jours après la fécondation, mais apparaît plus faible que l’intensité du signal le cinquième jour. Placer les larves eGFP positives dans des plaques de six puits au lieu de boîtes de Petri à une densité ne dépassant pas 10 larves par puits pour un traitement pharmacologique.Désigner des plaques séparées de six puits pour les larves ablées et non ablées. Déterminer le volume de 15 prétraitements de contrôle de véhicule DMSO micromolaires IWR-1 ou DMSO adaptés au volume nécessaires et aliquote 1,5X PTU dans des tubes coniques en conséquence. Ajouter la souche IWR-1 à 1,5X PTU pour une concentration finale de 15 IWR-1 micromolaires.Ajoutez un volume correspondant de stock de DMSO à 1,5X PTU. Bien mélanger par vortex et confirmer visuellement la dissolution des composés. Retirer 1,5 fois la PTU des larves positives à l’eGFP dans des plaques à six puits et ajouter cinq millilitres par puits de traitements 0,06% DMSO fraîchement préparés ou 15 traitements IWR-1 micromolaires.Ablate le RPE le lendemain. Cinq jours après la fécondation, déterminer le volume de traitements pharmacologiques et de contrôle des véhicules nécessaires pour les plaques de six puits non abrasées et ablées et aliquote les volumes appropriés d’eau douce du système sans PTU ou de solution de MTZ de 10 millimolaires dans des tubes coniques. Ajoutez des solutions mères IWR-1 et DMSO aux tubes coniques respectifs comme cela a été effectué précédemment.Bien mélanger par vortex et confirmer visuellement la dissolution des composés. Retirer 0,06 % de DMSO et 15 prétraitements micromolaires IWR-1 dans 1,5 X PTU des plaques désignées à six puits non ablées et ablées. Réapprovisionnez avec l’eau douce appropriée du système sans traitements de solution PTU et MTZ.Retirer 0,06% de DMSO et 15 traitements IWR-1 micromolaires dans une solution de MTZ de 10 millimolaires après exactement 24 heures et reconstituer avec des traitements dans de l’eau douce du système sans PTU. Reconstituer 0,06 % de DMSO et 15 traitements IWR-1 micromolaires dans de l’eau douce du système sans PTU sur la plaque non atablée de six puits. Surveiller le succès et l’étendue de l’ablation in vivo à l’aide de l’éclairage lumineux transmis sur un stéréomicroscope pour l’entretien larvaire post-ablation génétique.Pour générer la région RPE d’intérêt ou roi à l’aide de Fidji, ouvrez une image TIFF huit bits, réorientez l’image de sorte que la face dorsale soit vers le haut et que la distale soit laissée en choisissant l’image, transformez et retournez horizontalement. Pour la dernière commande, choisissez l’option qui convient le mieux à la directionnalité nécessaire pour cette image. Démarrez le gestionnaire de retour sur investissement en choisissant analyser, outils, gestionnaire de retour sur investissement.Utilisez l’image, le zoom et basculez entre les canaux DAPI et Brightfield. Utilisez des raccourcis clavier pour plus d’efficacité. Identifiez le point auquel le côté apical de l’EPR est adjacent à l’extrémité de la membrane limitante externe et utilisez ce repère anatomique comme point de départ du retour sur investissement.Créez le retour sur investissement RPE avec l’outil de sélection de polygones de la barre d’outils Fidji à l’aide des canaux d’image DAPI et Brightfield et de la fonction de zoom d’image pour identifier les limites RPE apicales et basales. Amenez les extrémités dorsale et ventrale du roi à un point pointu plutôt que de les émousser ou de les arrondir. Ajoutez le roi en cliquant sur ajouter dans le gestionnaire de retour sur investissement.Enregistrez le fichier ROI en choisissant plus et enregistrez dans le gestionnaire ROI. Double-cliquez sur le rpegen. m à ouvrir dans le volet de l’éditeur.Sous la section variable définie par l’utilisateur du rpegen. m, entrez les emplacements de répertoire pour les dossiers contenant les fichiers roi, les fichiers image tiff et où les fichiers de sortie doivent être enregistrés. Entrez le nom du groupe pour le fichier mat à exporter et l’emplacement du canal Brightfield dans la pile d’images TIFF.Exécutez le script en cliquant sur le bouton Exécuter dans le menu de l’éditeur en haut de MATLAB. Après avoir enregistré le fichier MAT, une figure à trois panneaux apparaîtra et sera également enregistrée au format PDF dans le répertoire de sortie de chaque exécution d’image. Attendez que ces pdf de contrôle qualité aient été enregistrés dans le dossier de sortie et que le dernier chiffre ait disparu.Ouvrez les fichiers PDF individuels et vérifiez que tous les retours sur investissement correspondent aux images Brightfield. Double-cliquez sur le rpegen_permplot. m à ouvrir dans un nouvel onglet de l’éditeur.Sous la section Variables définies par un utilisateur, entrez l’emplacement du répertoire du dossier de sortie contenant les fichiers MAT de l’exécution du rpegen. m script. Entrez chaque nom de fichier MAT à charger.Exécutez cette section du script en cliquant sur le bouton Exécuter la section dans le menu de l’éditeur. Dans la deuxième section, entrez les noms des deux groupes pour une comparaison statistique dans les variables de données A et de données B et désignez le nombre de répétitions de simulation de permutation dans la variable reps. Seulement 2 000 répétitions ont été utilisées pour cette démo afin de réduire le temps de traitement.Exécutez cette section du script en cliquant sur le bouton Exécuter la section dans le menu de l’éditeur. Exécutez les résultats de la figure de carte thermique et du groupe et les sections de valeur P indépendamment à l’aide du bouton Exécuter la section. Les dommages causés à la monture d’une larve de cinq jours après la fécondation ont montré une expression transgénique brillante dans l’EPR au moment du dépistage de l’ablation génétique.La cryosection transversale de la larve non ajourée de six jours après la fécondation a montré que l’expression transgénique était limitée aux cellules EPR matures, l’expression la plus brillante étant confinée aux 2/3 centraux de l’EPR. Les pointes de flèche indiquent des microvillosités apicales. La cryosection transversale d’une larve ablée d’un jour après une blessure a révélé une perturbation de la morphologie cellulaire positive de l’eGFP.Les flèches indiquent les noyaux pyknotiques. Les dommages de monture entiers des larves non accolées de sept jours après la fécondation ont montré une pigmentation de l’EPR dans tout l’œil et les larves ablées deux jours après la blessure ont montré une zone d’ablation sans pigment dans l’EPR centrale. Un diagramme généré à l’aide de RpEGEN a montré une similitude entre les groupes DMSO et IWR-1 non atténués de neuf jours après la fécondation sur toute la longueur de l’EPR.Le graphique a montré une intensité globale de pixels plus légère dans les groupes DMSO et IWR-1 de quatre jours ablés après la blessure, qui semblaient les plus légers dans l’IWR-1 ablée par rapport à tout autre groupe de traitement. Les différences dans la pigmentation centrale de l’EPR étaient significatives lorsque l’on comparait les larves traitées par IWR-1 ablée aux témoins traités par DMSO ablée. En utilisant ce paradigme d’ablation du poisson-zèbre, nous avons pu identifier plusieurs voies de signalisation moléculaire, telles que la signalisation du vent que nous avons montrée ici, qui sont des régulateurs critiques de la régénération RPE.

Research

JoVE Journal

Biology

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Un système de culture de cellules épithéliales de l&#39;iris Pigment étudier la régénération Lens Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Recherche

Biologie

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Laser Ablation de l&#39;pronéphros Zebrafish d&#39;étude rénale régénération épithéliale

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

Profils MicroRNA d&#39;expression de cellules iPS humaines, l&#39;épithélium pigmentaire rétinien Derived From iPS, et fœtale épithélium pigmentaire rétinien

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea MNU-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Méthylnitrosourée (MNU) induite par dégénérescence rétinienne et la régénération dans le poisson zèbre: caractéristiques histologiques et fonctionnelles

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Cultures de cellules primaires de l’épithélium pigmentaire rétinien de souris

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Isolement de cellules épithéliales pigmentées rétiniennes primaires de souris

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Génération efficace et cohérente d’épithélium/platures choroïdes pigmentaires rétiniens à partir d’yeux humains pour l’analyse histologique

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Caudal Peduncle Cryoinjury in Adult Zebrafish

A Cryoinjury Model for Studying Skeletal Muscle Regeneration of the Caudal Peduncle in Adult Zebrafish

A Cryoinjury Model for Studying Skeletal Muscle Regeneration of the Caudal Peduncle in Adult Zebrafish (Video) | JoVE 

Un modèle de cryoblessure pour étudier la régénération des muscles squelettiques du pédoncule caudal chez le poisson-zèbre adulte

Skeletal muscle undergoes renewal and restoration after minor injury through the activation of satellite-like stem cells. Severe injuries of the ...

Modeling and Analyzing Retinal Degeneration

LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

Unraveling the Pathogenesis of Age-Related Macular Degeneration and Discovering Potential Therapies (Video) | JoVE

Méthode de caractérisation et de quantification de dépôts lipidiques basée sur l’apprentissage automatique à l’aide d’un épithélium pigmentaire rétinien dérivé d’iPSC

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to ...

Staining of Sub-Retinal Pigment Epithelium (RPE) Deposits

Staining of Sub-Retinal Pigment Epithelium (RPE) Deposits (Video) | JoVE 

Coloration des dépôts d’épithélium pigmentaire sous-rétinien (EPR)