Name: nitroreductase/metronidazole-mediated ablation and a matlab platform (rpegen) for studying regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium
Uploaded: 2022-03-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Die hierin beschriebenen Arbeiten wurden von den National Institutes of Health (RO1-EY29410 bis J.M.G. und NIH CORE Grant P30-EY08098 an die Abteilung für Augenheilkunde) unterstützt; das UPMC Immune Transplant & Therapy Center (zu L.L.L. und J.M.G.); und der E. Ronald Salvitti Lehrstuhl für Ophthalmologie Forschung (an J.M.G.). Zusätzliche Unterstützung erhielt die Wiegand Fellowship in Ophthalmology (an L.L.L.), die Eye & Ear Foundation of Pittsburgh und ein uneingeschränktes Stipendium von Research to Prevent Blindness, New York, NY. Die Autoren danken auch Amanda Platt für die technische Unterstützung und Dr. Hugh Hammer und den Aquatics-Mitarbeitern für die hervorragende Unterstützung der Tierpflege.

Alle hier beschriebenen Methoden entsprechen dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Pittsburgh.
1. Vorbereitung vor der Entnahme von Zebrafischembryonen
<ol><li>Stellen Sie den Embryo-Inkubator auf 28,5 ° C ein.</li>
	<li>Es wird eine 25-fache Stammlösung des Melanogenesehemmers N-Phenylthioharnstoff (PTU)21,22 hergestellt. Diese Stammlösung wird nach einem gängigen Rez...

Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur genetischen Abrundung der RPE und zur Untersuchung von Degenerations- und Regenerationsmechanismen bei larvengealterten Zebrafischen. Dieses Protokoll wurde auch bei erwachsenenZebrafischen 3 erfolgreich durchgeführt, jedoch mit weniger umfangreicher Charakterisierung, weshalb Larven hier im Mittelpunkt stehen. Zu den kritischen Aspekten dieses Teils des Protokolls (Schritte 1-4) gehören: 1) Zugabe von 1,5x PTU zu Embryonen vor Beginn der Melanogenese...

Die hierin beschriebene Methodik beschreibt ein Protokoll zur genetischen Ablation des retinalen Pigmentepithels (RPE) unter Verwendung von Larvenzebrafischen. Die RPE erstreckt sich über den Augenhintergrund und befindet sich zwischen den geschichteten Schichten der neuronalen Netzhaut und der Gefäßschicht, aus der die Aderhaut besteht. Trophische Unterstützung, Absorption von phototoxischem Licht und Aufrechterhaltung von Proteinen des visuellen Zyklus sind nur einige der kritischen Funktionen, die das RPE ausübt, die für die Aufrechterhaltung der Gesundheit und Integrität dieser benachbarten Gewebe unerlässlichsind 1. Schäden an der RPE von Säugetieren sind reparierbar, wenn die Läsionen klein sind2; Schäden, die durch größere Verletzungen oder fortschreitende degenerative Erkrankungen erlitten werden, sind jedoch irreversibel. Beim Menschen führen degenerative RPE-Erkrankungen (z. B. altersbedingte Makuladegeneration (AMD) und Stargardt-Krankheit) zu einem dauerhaften Sehverlust und, da nur wenige Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung stehen, zu einer verminderten Lebensqualität der Patienten. Die begrenzte Fähigkeit von Säugetier-RPE, sich selbst zu reparieren, hat eine Wissenslücke im Bereich der regenerativen RPE-Prozesse geschaffen. Angesichts der robusten Regenerationsfähigkeit des Zebrafisches über viele verschiedene Gewebetypen hinweg wurde dieses Protokoll entwickelt, um ein In-vivo-Wirbeltiersystem zu etablieren, um Studien zur intrinsischen Regeneration von RPE zu erleichtern und Mechanismen aufzudecken, die diese Reaktion antreiben. Unter Verwendung des hier beschriebenen Ablationsparadigmas wurden der kanonische Wnt-Signalweg3, der mTOR-Signalweg4 und die immunbezogenen Reaktionen5 als kritische Mediatoren der RPE-Regeneration identifiziert, wahrscheinlich mit überlappenden Funktionen.
In diesem genetischen Ablationsparadigma exprimieren Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3-Zebrafische das bakteriell abgeleitete Nitroreduktase-Gen (NTR/nfsB)6, das unter Kontrolle des RPE-Enhancer-Elements rpe65a7 mit eGFP verschmolzen ist. Die Ablation wird durch Zugabe des Prodrugs, Metronidazol (MTZ), zu Systemwasser erreicht, das Zebrafische beherbergt. Die intrazelluläre Aktivierung von MTZ durch Nitroreduktase führt zu DNA-Vernetzung und Apoptose in NTR/nfsB-exprimierenden Zellen 8,9. Diese Technologie wurde häufig in Zebrafischen verwendet, um Zellen der Netzhaut10,11,12,13 und anderer Gewebe8 abzutragen. Zusammen ermöglichen diese Elemente die gezielte Expression (rpe65a) einer induzierbaren Zellablationsmethodik (NTR/MTZ)8,9 und eines fluoreszierenden Markers (eGFP) zur Visualisierung.
Es gibt auch andere interessante In-vivo-Modelle, mit denen das regenerative Potenzial des RPE14 untersucht werden kann. Diese sind breit gefächert und umfassen die RPE-zu-Retina-Transdifferenzierung nach der Retinektomie bei Amphibien, bei der RPE-Zellen, die durch das Nachwachsen der Netzhaut verloren gehen,ersetzt werden 15,16; RPE-Wiederherstellung nach der Verletzung in der "super heilenden" MRL/MpJ-Maus17; und exogene Stimulation der RPE-Proliferation in einem Rattenmodell von spontaner RPE und Netzhautdegeneration18, unter anderem. In-vitro-Modelle wie adulte humane RPE-Stammzellen (RPESCs)19 wurden ebenfalls entwickelt. Diese Modelle sind allesamt wertvolle Werkzeuge, um die zellulären Prozesse im Zusammenhang mit der RPE-Regeneration aufzudecken (z. B. Proliferation, Differenzierung usw.); Der Zebrafisch ist jedoch einzigartig in seiner Fähigkeit zur intrinsischen RPE-Reparatur nach der Ablation.
Während die Methodik hier geschrieben wurde, um sich auf das Verständnis der Mechanismen zu konzentrieren, die die RPE-Regeneration antreiben, könnten die Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) -Linie und dieses genetische Ablationsprotokoll verwendet werden, um andere zelluläre Prozesse wie RPE-Apoptose, RPE-Degeneration und die Auswirkungen von RPE-Verletzungen auf benachbarte Netzhaut- und Gefäßgewebe zu untersuchen. Das Ablationsprotokoll kann auch modifiziert werden, um pharmakologische Manipulation einzubeziehen, was eine bequeme Vorstrategie zum Screening von Signalwegen von Interesse ist. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass die Blockierung des kanonischen Wnt-Signalwegs mit Inhibitor of Wnt Response-1 (IWR-1)20 die RPE-Regenerationbeeinträchtigt 3. Dies wurde hier wiederholt, um Benutzer durch ein pharmakologisches Manipulationsexperiment zu führen und als Proof-of-Concept zu dienen, um ein MATLAB-Skript (RpEGEN) zu validieren, das zur Quantifizierung der RPE-Regeneration basierend auf der Wiederherstellung der Pigmentierung erstellt wurde. Wie das transgene Linien- und Ablationsprotokoll sind die RpEGEN-Skripte anpassungsfähig und könnten verwendet werden, um andere Marker / zelluläre Prozesse innerhalb der RPE zu quantifizieren.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Lab Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>Catalog number is for 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond tip scribing pen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-254-51</td>
			<td>Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO) &#8805;99.7 %</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo incubator (large)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3720A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo incubator (mini/tabletop)</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Zoom.V16</td>
			<td>Or similar, with 488 nm excitation laser/filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-4</td>
			<td>Manufactured by Corning, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5.04462</td>
			<td>Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue (powder)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP117-100</td>
			<td>Also available as a premade aqeuous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metronidazole (MTZ)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M3761</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td>Chemical waste, proper disposal required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (powder packets)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Used to make 10 X PBS stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PRON-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>H2010</td>
			<td>Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>Or similar, with transmitted light illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Fine-tipped forceps for manual dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop rotator/shaker</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>SK-D1807-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z135003</td>
			<td>3.2 mL bulb draw, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>TRS1, TRS2, TRS5</td>
			<td>Also available from Fisher Scientific (NC0342409)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td>Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRAMM examples and how-tos</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td>
			<td>Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB support</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/support.html</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nitroreductase/metronidazole-mediated ablation and a matlab platform (rpegen) for studying regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium

Das retinale Pigmentepithel (RPE) befindet sich im hinteren Teil des Auges und erfüllt Funktionen, die für die Aufrechterhaltung der Gesundheit und Integrität benachbarter Netzhaut- und Gefäßgewebe unerlässlich sind. Gegenwärtig hat die begrenzte Reparationskapazität von RPE für Säugetiere, die auf kleine Verletzungen beschränkt ist, Fortschritte beim Verständnis der regenerativen Prozesse von RPE in vivo behindert. Hier wird eine detaillierte Methodik bereitgestellt, um die Untersuchung der In-vivo-RPE-Reparatur unter Verwendung des Zebrafisches zu erleichtern, einem Wirbeltiermodell, das in der Lage ist, eine robuste Geweberegeneration durchzuführen. Dieses Protokoll beschreibt ein transgenes Nitroreduktase/Metronidazol (NTR/MTZ)-vermitteltes Verletzungsparadigma (rpe65a:nfsB-eGFP), das nach 24-stündiger Behandlung mit MTZ zu einer Ablation der zentralen zwei Drittel der RPE mit anschließender Gewebewiederherstellung führt. Der Schwerpunkt liegt auf RPE-Ablationen in Larvenzebrafischen und es werden auch Methoden zur Prüfung der Auswirkungen pharmakologischer Verbindungen auf die RPE-Regeneration beschrieben. Die Generierung und Validierung von RpEGEN, einem MATLAB-Skript, das zur Automatisierung der Quantifizierung der RPE-Regeneration auf der Grundlage der Pigmentierung erstellt wurde, wird ebenfalls diskutiert. Über aktive RPE-Reparaturmechanismen hinaus kann dieses Protokoll auf Studien zu RPE-Degenerations- und Verletzungsreaktionen sowie zu den Auswirkungen von RPE-Schäden auf benachbarte Netzhaut- und Gefäßgewebe sowie auf andere zelluläre und molekulare Prozesse ausgeweitet werden. Dieses Zebrafischsystem ist vielversprechend bei der Identifizierung von Genen, Netzwerken und Prozessen, die die RPE-Regeneration und RPE-Krankheitsmechanismen vorantreiben, mit dem langfristigen Ziel, dieses Wissen auf Säugetiersysteme und letztendlich auf die therapeutische Entwicklung anzuwenden.

Es ist bekannt, dass die Hemmung des kanonischen Wnt-Signalwegs die RPE-Regeneration von Zebrafischen unter Verwendung des genetischen Ablationsparadigmas (rpe65a:nfsB-eGFP) und der pharmakologischen Manipulationsmethodik (IWR-1), die im Protokoll3 beschrieben sind, signifikant beeinträchtigt. Dieses Experiment wurde hier wiederholt, um eine automatisierte Methode zur Quantifizierung der RPE-Regeneration von Zebrafischen basierend auf Pigmentierung zu validieren. Die im Folgenden zusamme...

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Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur genetischen Ablation des retinalen Pigmentepithels (RPE) unter Verwendung eines transgenen Zebrafischmodells. Die Anpassung des Protokolls an die Modulation des Signalwegs unter Verwendung pharmakologischer Verbindungen ist ausführlich beschrieben. Eine MATLAB-Plattform zur Quantifizierung der RPE-Regeneration auf Basis von Pigmentierung wurde entwickelt und wird vorgestellt und diskutiert.

Nitroreduktase/Metronidazol-vermittelte Ablation und eine MATLAB-Plattform (RpEGEN) zur Untersuchung der Regeneration des Zebrafisch-Netzhautpigmentepithels

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

Der Zebrafisch ist einzigartig in seiner intrinsischen Fähigkeit, viele verschiedene Gewebetypen zu regenerieren, einschließlich des RPE. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um molekulare Signalwege zu identifizieren, die die RPE-Regeneration und RPE-Krankheitsmechanismen antreiben. Vielseitigkeit ist ein Hauptvorteil dieser Methodik.Neben der Untersuchung der RPE-Regeneration kann dieses Protokoll verwendet werden, um degenerative RPE-Prozesse und die Auswirkungen von RPE-Schäden auf benachbarte Gewebe im Auge zu untersuchen. Säugetiere, einschließlich Menschen, sind nicht in der Lage, große RPE-Verletzungen zu reparieren, die auf Traumata oder degenerative Erkrankungen zurückzuführen sind. Die Verwendung von Zebrafischen als Werkzeug zur Entdeckung von RPE-pro-regenerativen Faktoren ist ein wichtiger Schritt zur Förderung der RPE-Regeneration von Säugetieren.Um eine frische 10-millimolare MTZ-Lösung fünf Tage nach der Düngung herzustellen, fügen Sie MTZ-Pulver zu Systemwasser ohne PTU hinzu und mischen Sie gründlich durch kräftiges Schütteln für eine Stunde bei 37 Grad Celsius. 10 Millimolar MTZ-Lösung eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Tischrotator oder -schüttler abkühlen. Um Zebrafischlarven aus dem rpe65a:nsfB-eGFP-Transgen zu screenen, trennen Sie transgene eGFP-positive Larven mit einem fluoreszierenden Stereomikroskop mit einem 488-Nanometer-Anregungslaser von nicht-transgenen eGFP-negativen Larven.Wake Screened Larven sofort durch Pipettieren direkt in eine Petrischale mit frischem 1,5X PTU ohne Tricain. Nach Abschluss des Screenings trennen Sie die eGFP-positiven Larven weiter in zwei Gruppen von Petrischalen auf, eine Gruppe, die eine MTZ-Behandlung erhält, und eine Gruppe, die die unverminderte Kontrolle darstellt. Dann das retinale Pigmentepithel abtragen, indem Sie 1,5X PTU aus den abgetragenen Behandlungsschalen entfernen und die frisch hergestellte 10-Millimolar-MTZ-Lösung hinzufügen.Entfernen Sie auch 1,5X PTU aus den unverminderten Kontrollschalen und fügen Sie frisches Systemwasser ohne PTU hinzu. Entfernen Sie die 10-millimolare MTZ-Lösung nach genau 24 Stunden und fügen Sie frisches Systemwasser ohne PTU hinzu. Wechseln Sie das frische Systemwasser ohne PTU auf den MTZ-Negativschalen.Screenen Sie eGFP-positive Larven an vier Tagen nach der Befruchtung. Das eGFP ist vier Tage nach der Befruchtung sichtbar, erscheint aber am fünften Tag dunkler als die Signalintensität. Geben Sie eGFP-positive Larven in Six-Well-Platten anstelle von Petrischalen mit einer Dichte von nicht mehr als 10 Larven pro Well für die pharmakologische Behandlung.Bezeichnen Sie separate Sechs-Well-Platten für abgetragene und unablierte Larven. Bestimmen Sie das Volumen von 15 mikromolaren IWR-1- oder volumenangepassten DMSO-Fahrzeugsteuerungsvorbehandlungen und aliquotieren Sie 1,5-fache PTU entsprechend in konische Röhrchen. IWR-1-Material zu 1,5-facher PTU hinzufügen, um eine Endkonzentration von 15 Mikromolar IWR-1 zu erhalten.Fügen Sie ein passendes DMSO-Volumen zu 1,5-facher PTU hinzu. Mischen Sie gut durch Vortexing und bestätigen Sie visuell die Auflösung von Verbindungen. Entfernen Sie 1,5-fache PTU aus den eGFP-positiven Larven in Sechs-Well-Platten und fügen Sie fünf Milliliter pro Vertiefung frisch hergestellte 0,06% DMSO- oder 15 mikromolare IWR-1-Behandlungen hinzu.Setzen Sie die RPE am nächsten Tag ab. Bestimmen Sie fünf Tage nach der Befruchtung das Volumen der pharmakologischen und Vehikelkontrollbehandlungen, die sowohl für unablierte als auch für abgetragene Sechs-Well-Platten erforderlich sind, und aliquot geeignete Mengen an Frischwasser ohne PTU oder 10-Millimol-MTZ-Lösung in konische Röhrchen. Fügen Sie IWR-1- und DMSO-Lagerlösungen zu den jeweiligen konischen Rohren hinzu, wie zuvor durchgeführt.Mischen Sie gut durch Vortexing und bestätigen Sie visuell die Auflösung von Verbindungen. Entfernen Sie 0,06% DMSO- und 15 mikromolare IWR-1-Vorbehandlungen in 1,5-facher PTU von ausgewiesenen unablierten und abgetragenen Sechs-Well-Platten. Nachfüllen mit dem entsprechenden Frischwasser ohne PTU- und MTZ-Lösungsbehandlungen.Entfernen Sie 0,06% DMSO- und 15 mikromolare IWR-1-Behandlungen in 10-millimolärer MTZ-Lösung nach genau 24 Stunden und füllen Sie sie mit Behandlungen in frischem Systemwasser ohne PTU auf. Füllen Sie 0,06% DMSO- und 15 mikromolare IWR-1-Behandlungen in frischem Systemwasser ohne PTU auf der unverminderten Sechs-Well-Platte auf. Überwachen Sie den Erfolg und das Ausmaß der Ablation in vivo mit Durchlichtbeleuchtung auf einem Stereomikroskop zur Larvenerhaltung nach der genetischen Ablation.Um die RPE-Region von Interesse oder ROI mit Fidschi zu generieren, öffnen Sie ein acht-Bit-TIFF-Bild, richten Sie das Bild neu aus, so dass die dorsale Seite oben und distal bleibt, indem Sie Bild, Transformation und horizontales Spiegeln auswählen. Wählen Sie für den letzten Befehl die Option aus, die der für dieses Bild erforderlichen Direktionalität am besten entspricht. Starten Sie den ROI-Manager, indem Sie Analyse, Tools, ROI-Manager auswählen.Verwenden Sie Bild, Zoom und Umschalten zwischen den DAPI- und Brightfield-Kanälen. Verwenden Sie Tastenkombinationen für Effizienz. Identifizieren Sie den Punkt, an dem die apikale Seite des RPE an die Spitze der äußeren Grenzmembran angrenzt, und verwenden Sie diesen anatomischen Meilenstein als ROI-Ausgangspunkt.Erstellen Sie den RPE-ROI mit dem Polygonauswahlwerkzeug in der Fidschi-Symbolleiste unter Verwendung der DAPI- und Hellfeld-Bildkanäle sowie der Bildzoomfunktion, um apikale und basale RPE-Grenzen zu identifizieren. Bringen Sie die dorsalen und ventralen Enden des ROI auf einen scharfen Punkt, anstatt abzustumpfen oder abzurunden. Fügen Sie den ROI hinzu, indem Sie im ROI-Manager auf Hinzufügen klicken.Speichern Sie die ROI-Datei, indem Sie mehr auswählen, und speichern Sie sie im ROI-Manager. Doppelklicken Sie auf den rpegen. M-Datei zum Öffnen im Editorbereich.Unter dem benutzerdefinierten Variablenabschnitt des rpegen. m-Datei, geben Sie die Verzeichnisspeicherorte für Ordner ein, die die ROI-Dateien, die TIFF-Image-Dateien enthalten und wo Ausgabedateien gespeichert werden sollen. Geben Sie den Gruppennamen für die zu exportierende MAT-Datei und die Position des Brightfield-Kanals im TIFF-Bildstapel ein.Führen Sie das Skript aus, indem Sie auf die Schaltfläche Ausführen im Editormenü oben in MATLAB klicken. Nach dem Speichern der MAT-Datei erscheint eine Drei-Panel-Figur und wird auch als PDF im Ausgabeverzeichnis für jeden Bildlauf gespeichert. Warten Sie, bis diese Qualitätskontroll-PDFs im Ausgabeordner gespeichert wurden und die letzte Abbildung verschwunden ist.Öffnen Sie die einzelnen PDFs und überprüfen Sie, ob alle ROIs mit den Brightfield-Bildern übereinstimmen. Doppelklicken Sie auf die rpegen_permplot. M-Datei zum Öffnen in einem neuen Editor-Tab.Geben Sie im Abschnitt Ein-Benutzerdefinierte Variablen den Verzeichnisspeicherort für den Ausgabeordner ein, der die MAT-Dateien aus der Ausführung des rpegen enthält. m Skript. Geben Sie jeden zu ladenden MAT-Dateinamen ein.Führen Sie diesen Abschnitt des Skripts aus, indem Sie im Editormenü auf die Schaltfläche Abschnitt ausführen klicken. Geben Sie in Abschnitt zwei die Namen der beiden Gruppen für einen statistischen Vergleich in die Variablen Daten A und Daten B ein und geben Sie die Anzahl der Wiederholungen der Permutationssimulation in der Variablen reps an. Für diese Demo wurden nur 2.000 Wiederholungen verwendet, um die Verarbeitungszeit zu verkürzen.Führen Sie diesen Abschnitt des Skripts aus, indem Sie im Editormenü auf die Schaltfläche Abschnitt ausführen klicken. Führen Sie Heatmap-Figuren- und Gruppenergebnisse sowie P-Wert-Abschnitte mithilfe der Schaltfläche Abschnitt ausführen unabhängig voneinander aus. Der gesamte Mount-Schaden einer fünftägigen Larve nach der Befruchtung zeigte zum Zeitpunkt des Screenings auf genetische Ablation eine helle Transgenexpression im RPE.Die transversale Kryosektion einer unablierten Sechs-Tage-Larve nach der Befruchtung zeigte, dass die Transgenexpression auf reife RPE-Zellen beschränkt war, wobei die hellste Expression auf die zentralen 2/3 der RPE beschränkt war. Pfeilspitzen zeigen apikale Mikrovilli an. Die transversale Kryosektion einer abgetragenen Larve eines Tages nach der Verletzung ergab eine Störung der eGFP-positiven Zellmorphologie.Pfeile zeigen pyknotische Kerne an. Ganze Mount-Schäden von unverminderten siebentägigen Larven nach der Befruchtung zeigten RPE-Pigmentierung im ganzen Auge und abgetragene Larven zwei Tage nach der Verletzung zeigten eine Ablationszone ohne Pigment im zentralen RPE. Ein mit RpEGEN erstelltes Diagramm zeigte Ähnlichkeiten zwischen den unverminderten DMSO- und IWR-1-Gruppen nach der Befruchtung über die gesamte Länge des RPE.Die Handlung zeigte eine insgesamt hellere Pixelintensität in den abgetragenen DMSO- und IWR-1-Gruppen nach der Verletzung, die im Vergleich zu jeder anderen Behandlungsgruppe in der abgetragenen IWR-1 am leichtesten erschien. Unterschiede in der zentralen RPE-Pigmentierung waren signifikant, wenn ablatierte IWR-1-behandelte Larven mit ablatierten DMSO-behandelten Kontrollen verglichen wurden. Mit diesem Zebrafisch-Ablationsparadigma konnten wir mehrere molekulare Signalwege identifizieren, wie z.B. die Windsignalisierung, die wir hier gezeigt haben und die kritische Regulatoren der RPE-Regeneration sind.

Research

JoVE Journal

Biology

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Ein System zur Kultivierung Iris Pigmentepithelzellen nach Lens Regeneration in Newt Study

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Forschung

Biologie

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Laser Ablation des Zebrafisch Vorniere auf Study Renal Epithelregeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

MicroRNA Expressionsprofile der Menschen iPS-Zellen, Retinapigmentepithel Abgeleitet aus iPS und Fetal Retinapigmentepithel

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea MNU-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosoharnstoff (MNU) induzierten Netzhautdegeneration und Regeneration im Zebrafisch: Die histologische und funktionelle Eigenschaften

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primären Zellkulturen aus das retinale Pigmentepithel Maus

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Isolierung von primären retinalen pigmentierten Epithelzellen der Maus

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Effiziente und konsistente Generierung von retinalen Pigmentepithel-/Aderhaut-Flatmounts aus dem menschlichen Auge für die histologische Analyse

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Caudal Peduncle Cryoinjury in Adult Zebrafish

A Cryoinjury Model for Studying Skeletal Muscle Regeneration of the Caudal Peduncle in Adult Zebrafish

A Cryoinjury Model for Studying Skeletal Muscle Regeneration of the Caudal Peduncle in Adult Zebrafish (Video) | JoVE 

Ein Kryoverletzungsmodell zur Untersuchung der Skelettmuskelregeneration des Schwanzstiels bei erwachsenen Zebrafischen

Skeletal muscle undergoes renewal and restoration after minor injury through the activation of satellite-like stem cells. Severe injuries of the ...

Modeling and Analyzing Retinal Degeneration

LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

Unraveling the Pathogenesis of Age-Related Macular Degeneration and Discovering Potential Therapies (Video) | JoVE

LipidUNet-Machine-Learning-basierte Methode zur Charakterisierung und Quantifizierung von Lipidablagerungen unter Verwendung von iPSC-abgeleitetem retinalem Pigmentepithel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to ...

Staining of Sub-Retinal Pigment Epithelium (RPE) Deposits

Staining of Sub-Retinal Pigment Epithelium (RPE) Deposits (Video) | JoVE 

Färbung von subretinalen Pigmentepithelablagerungen (RPE)